Name: Proliferatie en differentiatie van lymfkliertest myeloïde voorloper 32 quinquies/G-CSF-R cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Leer proliferatie- en differentiatieprotocollen voor de murine myeloïde 32D/G-CSF-R-cellijn. Deze methode helpt onderzoekers genetische modificaties te bestuderen en hun effect op myelopoëse te analyseren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedanken Prof. Ruud Delwel en Prof. Ivo Touw voor het verstrekken van ons met de 32 quinquies/G-CSF-R cellijn en Prof. Daniel G. Tenen voor het verstrekken van ons met de cellijn van Bosc23. Dit werk werd ondersteund door subsidies van het subsidie-Agentschap van de Tsjechische Republiek (GACR 15-03796S en GACR 17-02177S) bij MA-J, ondersteuning van het Instituut voor moleculaire genetica van de Tsjechische Academie van Wetenschappen (RVO 68378050) MA-J, een GA UK fellowship (project nr. 341015) van de Karelsuniversiteit in Praag MK, en een fellowship GA UK (project nr. 1278217) van de Karelsuniversiteit in Praag te PD.

Opmerking: Stappen beschrijven expansie, differentiatie en transductie van 32 quinquies/G-CSF-R cellen zijn hieronder weergegeven.
1. voorbereiding
<ol><li>Voorbereiding van de media
	<ol>
<li>250 mL gestolde voedingsbodem voor te bereiden: RPMI (Roswell Park Memorial Instituut) 1640 medium aangevuld met 10% warmte geïnactiveerd FBS (foetale runderserum) en lymfkliertest IL-3 (10 ng/mL).<ol>
<li>U kunt ook gebruik zelfgemaakte IL-3. Voor de productie van zelfgemaakte IL-3, transduce HEK293 cellen met IL-3 waarin vector en verzamelen van IL-3 met supernatant22. Opmerking: Antibiotica, zoals penicilline G (100 IU/mL), streptomycine (100 µg/mL) en gentamicine (40 µg/mL), kunnen worden gebruikt voor de cel kweken bij elke stap van het protocol, tenzij anders vermeld.</li>
		</ol>
</li>
		<li>50 mL van differentiatie medium bereiden: RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS, en menselijke G-CSF (100 ng/mL). Opmerking: (Belangrijk) niet alle serum batches steunen differentiatie van 32 quinquies/G-CSF-R cellen. Test verschillende batches instellen van serum vóór aanvang van het experiment. Het is aanbevolen om test ten minste 4 verschillende batches instellen en selecteer de optimale gebaseerd op het vermogen van de 32 quinquies/G-CSF-R cellen te onderscheiden. Zie 32 quinquies/G-CSF-R differentiatie protocol hieronder.</li>
		<li>10 mL van bevriezing medium bereiden: RPMI 1640 medium aangevuld met 40% FBS, en 10% DMSO (dimethylsulfoxide).</li>
	</ol></li>
	<li>Productie van retrovirus
	<ol>
<li>Een eencellige suspensie van Bosc23 cellen (6 × 106) in een petrischaal 16 cm plaat en cultiveer in 18 mL DMEM (Dulbecco van bewerkt Eagle's Medium) bevattende 10 gewichtspercenten FBS tot de confluentie van de cultuur 80% (24 h bedraagt). Opmerking: De cellen moeten groeien in een enkelgelaagde en niet formulier klontjes in cultuur. Cel tellen kan worden uitgevoerd met behulp van verschillende methoden (geldig voor de rest van de hier gepresenteerde protocollen). In het geval van lage aantal monsters, wordt handmatig tellen onder de microscoop met behulp van de Bürker kamer aanbevolen. In dit geval, gebruik Trypan blauw voor uitsluiting van dode cellen. Cellen 1:1 mengen met 0,4% Trypan blauw in PBS. Voor het uitvoeren van tellen van groot aantal monsters, kan een automatische cel teller worden gebruikt.</li>
		<li>Combineer 40 µg voor retrovirale construct (zoals MSCV), 20 µg voor pCL-Eco (verpakking vector)23, 80 µl van PEI (polyethylenimine) en 2 mL verminderd-Serum medium (bijvoorbeeld Opti-MEM) medium (zonder antibiotica). Incubeer dit mengsel gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT).</li>
		<li>Bosc23 cellen medium zorgvuldig vervangen door 16 mL DMEM aangevuld met 2% FBS. Vooraf warm het medium tot 37 ° C vóór gebruik. Opmerking: Gebruik geen antibiotica tijdens de transfectie, aangezien het transfectie efficiëntie kan verminderen.</li>
		<li>Voeg het mengsel bereid in 1.2.2. dropwise en zorgvuldig naar de Bosc23 cultuur en incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C. Incubatie tot minder dan 6 h als gevolg van PEI toxiciteit te beperken.</li>
		<li>Na incubatie, omzetten in Bosc23 medium 18 mL pre opgewarmd DMEM met 10% FBS, en cultiveer cellen gedurende 48 uur bij 37 ° C. Gerechten in een laboratorium van bioveiligheid niveau 2 plaatsen, houd hier van deze stap op en volg standaard veiligheidsprocedures.</li>
		<li>Bosc23 medium (met ecotropic retrovirale deeltjes) met behulp van een 25-mL serologische precisiepipet in een conische buis van 50 mL verzamelen en bewaren bij 4 ° C. Opmerking: (Belangrijk) transfectie efficiëntie moet 90% voor de productie van een hoge titer virus bereiken.</li>
		<li>Voeg 18 mL pre opgewarmd DMEM 10% FBS te Bosc23 cellen en cultiveren gedurende 24 uur.</li>
		<li>Herhaal stap 1.2.6. Opmerking: Retrovirale supernatant van 1.2.6 en 1.2.8 kunnen worden gepoold zodra ze bij dezelfde temperatuur (4 ° C) om virale integriteit te behouden.</li>
		<li>Bosc23 om besmetting te voorkomen in virale supernatant, spin verzamelde virus bij 1500 × g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Aliquot virus, snap bevriezing met behulp van droogijs of vloeibare stikstof, en opslaan bij-80 ° C. Nochtans, merken op dat vers bereide virus is van hogere kwaliteit in termen van efficiëntie van de infectie dan bevroren voorraden. Opmerking: (Belangrijk) Vermijd repetitieve invriezen/ontdooien van virus, omdat het leidt tot aantasting van het virale.</li>
	</ol></li>
	<li>Productie van lentivirus
	<ol>
<li>Een eencellige suspensie van HEK293T (menselijke embryonale nier 293T) cellen (6 × 106) in een petrischaal 16 cm plaat en cultiveer in 18 mL DMEM met 10% FBS tot de confluentie van de cultuur 80% (24 h bedraagt). Opmerking: De cellen moeten groeien in een enkelgelaagde en niet formulier klontjes in cultuur.</li>
		<li>Combineren van 15 µg voor lentivirale construct (zoals pGhU6), verpakking van plasmiden pCMVdR8.74 (codering voor gag/pol, 12 µg) en pMD2.VSVG (codering voor VSV-G, 1,4 µg), 85.2 µL PEI, en 2 mL verminderd-serum medium (zonder antibiotica). Incubeer dit mengsel gedurende 20 minuten op RT.</li>
		<li>Zorgvuldig vervangen HEK293T medium met 16 mL DMEM aangevuld met 2% FBS. Vooraf warm het medium tot 37 ° C vóór gebruik. Gebruik geen antibiotica tijdens de transfectie, aangezien het transfectie efficiëntie kan verminderen.</li>
		<li>Zorgvuldig drop het mengsel bereid in 1.3.2 aan de cultuur van de cel van de HEK293T en incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C. Duur van de incubatie naar binnen 6 uur om te voorkomen dat PEI toxiciteit te beperken.</li>
		<li>Verandering middellange tot 18 mL pre opgewarmd DMEM 10% FBS en cultiveren van cellen gedurende 48 uur bij 37 ° C. Gerechten in een laboratorium van bioveiligheid niveau 2 plaatsen, houd hier van deze stap op en volg standaard veiligheidsprocedures.</li>
		<li>HEK293T medium (met amphotropic lentivirale deeltjes) met behulp van een 25-mL serologische precisiepipet in een conische buis van 50 mL te verzamelen en op te slaan bij 4 ° C. Opmerking: (Belangrijk) transfectie efficiëntie moet 90% voor de productie van een hoge titer virus bereiken.</li>
		<li>Voeg voorzichtig 18 mL voorverwarmde DMEM 10% FBS aan de HEK293T cellen. Cultiveren gedurende 24 uur bij 37 ° C.</li>
		<li>Herhaal stap 1.3.6. Opmerking: Lentivirale supernatant van 1.3.6 en 1.3.8 kunnen worden gepoold zodra ze bij dezelfde temperatuur (4 ° C) om virale integriteit te behouden.</li>
		<li>Om besmetting te voorkomen van virale supernatans met HEK293T cellen, spin verzamelde virus bij 1500 × g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Aliquot virus, snap bevriezing met behulp van droogijs of vloeibare stikstof, en opslaan bij-80 ° C. Nochtans, opmerken dat vers bereide virus is van hogere kwaliteit in termen van efficiëntie van de infectie dan bevroren voorraden. Opmerking: (Belangrijk) Vermijd repetitieve invriezen/ontdooien van virus, omdat het leidt tot aantasting van het virale.</li>
	</ol></li>
	<li>Titratie van virus met een GFP-reporter
	<ol>
<li>Zaad van 1 × 105 NIH/3T3 cellen in 300 µL van DMEM 10% FBS per putje in een 24-well-plaat. 7 putten zal worden gebruikt om een virus van de titer.</li>
		<li>Ontdooi virus bij 37 ° C en 1, 5, 10, 50, 100 en 500 µL virus toevoegen aan NIH/3T3 culturen. Voeg geen een virus in negatieve controle goed. Cultiveren van cellen in aanwezigheid van het virus gedurende 48 uur bij 37 ° C.</li>
		<li>Oogsten van NIH/3T3 cellen met behulp van 30 µL trypsine/EDTA (ethyleendiamminetetra zuur) (0,25% trypsine, 0,01% EDTA in PBS) en cellen plaats in 250 µL PBS in een buis FACS (fluorescentie geactiveerd cel Sorteren).</li>
		<li>Bepaal de frequentie van GFP+ cellen door stroom cytometry in elk monster24. Dode cellen uitsluiten door toevoeging van een levensvatbaarheid kleurstof, zoals Hoechst 33258.</li>
		<li>Berekenen van het totale aantal GFP+ cellen (gebaseerd op het aantal vergulde cellen en percentage GFP+ cellen) en plot ze tegen de hoeveelheid virus gebruikt voor infectie. Opmerking: (Belangrijk) efficiëntie van infectie bereikt een plateau wanneer grote virale doses worden toegepast. Daarom is het belangrijk voor het schatten van de titer op basis van virale concentraties welke infectie efficiëntie in een lineaire reeks (zoals vermeld in tabel 1 optreedt). Het aantal cellen van het GFP+ geeft het aantal functionele virale deeltjes (TU - omzetten van eenheden) in een bepaald virus volume. Berekenen van het aantal TU per mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Titratie van virus met een puromycin-reporter
	<ol>
<li>Zaad 5 × 104 NIH/3T3 cellen in 3 mL DMEM 10% FBS per putje in een 6-well plaat; dienst 6 wells titer een virus. Cultuur 's nachts bij 37 ° C.</li>
		<li>Volgende dag Verdun virus zoals aangegeven in tabel 2. Om te verdunnen virus, voorverwarmde DMEM 10% gebruiken FBS. Doen niet vortex.</li>
		<li>Kweekmedium uit NIH/3T3 cellen verwijderen en voeg 1 mL verdunde virus.</li>
		<li>Na een nacht bebroeden bij 37 ° C.</li>
		<li>Zachtjes vervangen door het medium virus-bevattende 2 mL voorverwarmde DMEM 10% FBS, en na een nacht bebroeden bij 37 ° C.</li>
		<li>Zachtjes vervangen NIH/3T3 medium met 2 mL voorverwarmde DMEM 10% FBS met puromycin (2 µg/mL).</li>
		<li>Cultuur bij 37 ° C en zorgvuldig vernieuwen medium met puromycin om de 3 dagen of wanneer medium omslaat naar geel.</li>
		<li>10-12 dagen na infectie, gecombineerd medium uit elk putje en voorzichtig wassen met PBS.</li>
		<li>Vlek met kristalvioletoplossing (0,5% kristalviolet in 20% ethanol en dH2O), 1 mL 2 min op RT en zorgvuldig wassen met PBS tweemaal.</li>
		<li>Graaf blauwe kolonies in elk putje onder een microscoop (vergroting × X4) aanwezig. Geen kolonies moeten goed worden nageleefd in de negatieve controle.</li>
		<li>Bereken het totale aantal TU/mL overweegt de verdunningsfactor.</li>
	</ol></li>
</ol>2. uitbreiding en het onderhoud van 32 quinquies/G-CSF-R cellen
<ol><li>Als 32 quinquies/G-CSF-R cellen zijn bevroren, nemen een aliquoot gedeelte en ontdooien van cellen in een waterbad 37 ° C voor 1 min en giet cellen uit de ampul direct in 10 mL voorverwarmde RPMI 1640 voedingsbodem aangevuld met 10% FBS in een tube van 15mL. Omkeren de buis 3 keer en draaien de cellen neer op 400 × g. Verwijder supernatant en resuspendeer de cellen in de IL-3 met gestolde voedingsbodem in een concentratie tussen de 0,3 × 106 cellen/mL.</li>
	<li>Optimale cel groei concentratie is 0,25-0,5 × 106 cellen/mL. Cellen splitsen om de 2 dagen brengen ze naar een concentratie van 0,1-0,2 × 106 cellen/mL. Opmerking: (Belangrijk) 32 quinquies/G-CSF-R cellen kunnen gedeeltelijk verliezen hun vermogen om te onderscheiden als uitgegroeid tot concentraties hoger dan 1 × 106 cellen/mL. Het is daarom heel belangrijk om 32 quinquies/G-CSF-R cellen splitsen op tijd.</li>
	<li>Indien nodig, bevriezen en opslaan van cel aliquots voor langere tijd bij-80 ° C of in vloeibare stikstof. Spin down 3 × 10-6 cellen verwijderen supernatant en resuspendeer in 1 mL van bevriezing medium. Plaats de buis in een bevriezing container bij-80 ° C. Verplaatsen voor lange termijn opslag, cellen met vloeibare stikstof.</li>
</ol>3. signaaltransductie van cellen van de 32 quinquies/G-CSF-R
<ol><li>Plaat 32 quinquies/G-CSF-R cellen in 6-well plaat in een concentratie tussen de 0,3 × 106 cellen/mL.</li>
	<li>Voeg de juiste hoeveelheid virus te bereiken een MOI (multipliciteit van infectie) tussen 10 en 40. Opmerking: Hogere MOI zal leiden tot verhoogd percentage van GFP+ cellen, alsmede hogere niveaus van expressie van het gen van belang. Voorbeeld: Te infecteren 0,3 × 10-6 cellen met een MOI van 10; 3 × 10-6 TU zal moeten worden toegevoegd aan de cellen 32 quinquies/G-CSF-R.</li>
	<li>Voeg polybrene toe aan eindconcentratie 8 µg/mL en incubeer gedurende 6 uur bij 37 ° C. U kunt ook een spin-inoculatie-procedure uitvoeren: centrifugeren op 1200 × g gedurende 90 minuten bij 30 ° C in een kweken plaat met behulp van een swing-emmer rotor en incubeer gedurende 3 uur bij 37 ° C.</li>
	<li>De cellen van het verzamelen, overbrengen in een buis 15 mL, en spin bij 450 × g gedurende 5 min (4 ° C).</li>
	<li>Verwijder het supernatant, resuspendeer Ingehuld cellen in 6 mL gestolde voedingsbodem, breng in een maatkolf van T25 cel-cultuur, en cultuur bij 37 ° C.</li>
	<li>48 uur later, oogsten van cellen en draaien ze bij 450 × g gedurende 5 min (4 ° C). Verwijder het supernatant.</li>
	<li>In het geval van een GFP-verslaggever: cellen in 500 µL van PBS en sorteren GFP+ cellen met behulp van een stroom cytometry sorter plaatsen. In het geval van een verslaggever van de puromycin met vector: plaatsen van cellen in kweekmedium dat 2 µg/mL puromycin.</li>
	<li>Vouw cellen zo nodig voor verdere analyse en experimenten. Opmerking: (Optioneel) Transduced cellen kunnen worden bevroren in de bevriezing van de media in een bevriezing container bij-80 ° C, en verder opgeslagen in vloeibare stikstof.</li>
</ol>4. 32 quinquies/G-CSF-R cel proliferatie assay
<ol><li>Om te beoordelen van proliferatie tarief plaats 0.2 × 106 cellen in 1 mL gestolde voedingsbodem en na een nacht bebroeden bij 37 ° C.</li>
	<li>Volgende dag tellen aantal cellen en hen terug naar een concentratie van 0,2 × 106 cellen/mL gestolde voedingsbodem met verdund. Na een nacht bebroeden bij 37 ° C. Een register bijhouden van cel concentraties en verdunningen toegepast op de dagelijkse culturen met behulp van tabel 3.</li>
	<li>Herhaal stap 4.2 voor zoveel dagen zoals proliferatie dient te worden beoordeeld. Opmerking: De lengte van de proliferatie tests zal afhangen van het effect van het gen van belang. In geval van een sterke fenotype, zou kunnen 8-9 dagen volstaan om te kijken wat een significant effect (Zie figuur 3A). Nochtans, in geval van een milde fenotype, langere tijd kunnen zijn vereist.</li>
	<li>Beoordelen celgroei doordat een proliferatie curve zoals aangegeven in tabel 3.</li>
</ol>5. 32 quinquies/G-CSF-R cel differentiatie assay
<ol><li>Wassen 0.2 × 106 32 quinquies/G-CSF-R cellen tweemaal met RPMI medium zonder cytokines. Opmerking: De stappen wassen vóór toevoeging van G-CSF in de cultuur zijn belangrijk, omdat de aanwezigheid van residuele IL-3 differentiatie kan remmen.</li>
	<li>Cellen in 1 mL differentiatie opslagmedium (met 100 ng/mL G-CSF) in een 24 goed/plaat, wat resulteert in een cel concentratie van 0,2 × 10-6 cellen/mL (dag 0) plaatsen. Cultuur 's nachts bij 37 ° C.</li>
	<li>Aantal cellen/mL zoals hierboven (stap 1.2.1) aangegeven.</li>
	<li>Cytospin 2-5 × 104 cellen op een glasplaatje (76 X 26 mm) met behulp van een centrifuge met nodige adapters op 20 × g.</li>
	<li>Vernieuwen differentiatie medium en plaat cellen bij een concentratie van 0,2 × 105 cellen/mL op een 24 goed/plaat (dag 1). Gooi de oude plaat, en gaan de volgende dag met stap 5.6 met de nieuwe plaat.</li>
	<li>Herhaal stap 5.3 naar 5.5 op 2 tot 7 dagen. Beoordelen celproliferatie in aanwezigheid van G-CSF zoals beschreven in stap 4. Opmerking: (Belangrijk) tijdens de differentiatie, celproliferatie vertraagt, daarom na 3 tot 4 dagen in het bijzijn van G-CSF is het voldoende om de cellen van de cultuur bij hogere concentraties.</li>
	<li>Beoordelen van differentiatie staat van 32 quinquies/G-CSF-R cellen op basis van morfologie van de cel.<ol>
<li>Cellen uit stap 5.4 in methanol gedurende 5 minuten op RT vast en laat dia's om te drogen. Opmerking: Dia's uit dag 0 tot en met 7 kunnen worden opgeslagen op RT en tegelijkertijd vast. Ook kunnen ze ook worden bewaard op RT voor langere periodes na fixatie.</li>
		<li>Vlek cellen met behulp van mei-Grünwald-Giemsa kleuring van volgende fabrikant protocol.</li>
		<li>Gekleurde cellen met behulp van een microscoop en vergroting X40 visualiseren.</li>
		<li>Kwantificeren aantal ontploffingen, gearchiveerd gedifferentieerde cellen en volwassen granulocyten met behulp van de illustratieve afbeeldingen op Figuur 1 en beschrijving in tabel 4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De keuze van een experimenteel model is een van de belangrijkste kwesties in onderzoek. Hoewel primaire dierlijke en menselijke cellen worden verondersteld om de meest biologisch relevante gegevens te produceren, wordt deze modellen ethische bezwaren kunnen betrekken en worden vaak geassocieerd met dure en/of geavanceerde isolatie/kweken van procedures. Primaire cellen in aantallen zijn beperkt en het is moeilijk om genetisch te manipuleren hen. Bovendien, vertegenwoordigen primaire cellen een heterogene populatie bestaa...

De hematopoietische stamcellen en voorlopercellen bevolking levert het organisme met een groot bereik van volwassen cellen, met inbegrip van cellen uit de myeloïde geslacht (neutrofiele granulocyten, eosinofielen basofielen en monocyten). Het proces dat de aandrijving van de productie van myeloïde cellen van hematopoietische stamcellen staat bekend als myelopoiesis, en voldoende productie van volwassen myeloïde cellen in reactie op de veranderende eisen is een voorwaarde voor goede coping van het organisme met stress voorwaarden, zoals infecties en bloedverlies. Onvoldoende productie van volwassen myeloïde cellen kan leiden tot onmogelijkheid tot het elimineren van pathogenen, verminderde bloedstolling en andere levensbedreigende omstandigheden1,2. Bovendien, kunnen wijzigingen in myeloïde lineage ontwikkeling ook gepaard gaan met hematologische maligniteiten, zoals acute myeloïde leukemie (AML)3. Wijzigingen in de myelopoiesis kunnen zich voordoen als gevolg van verschillende redenen, zoals gebreken in cel oppervlakte receptoren4, veranderde uitingen van transcriptie factoren5, verminderde signalering trajecten6, mutaties resulterend in vorming / activering van oncogenen7, of inactivering van tumor suppressor genen8.
Verschillende methoden hebben ontwikkeld om te studeren myeloïde ontwikkeling, en beoordelen van het effect van specifieke genetische wijzigingen in dit proces. Gemeenschappelijke benaderingen gebruikt bij het bestuderen van myelopoiesis omvatten primaire cellen en transgene muizen. Al deze modellen toe verwerving van biologisch relevante gegevens, hebben ze bepaalde beperkingen. Het gebruik van primaire cellen ontmoetingen een beperkt aantal cellen en een beperkte periode van cultuur, vernauwing van de mogelijkheden om te veranderen van genexpressie en de daaropvolgende biologische of biochemische analyse. Transgene muizen zijn kostbaar en vereisen een redelijke mate van biologische rechtvaardiging. Bovendien voegt werken met in vivo modellen een mate van complexiteit in het begrip van de rol van een gen van belang in een bepaald proces. Daarom, alternatieve benaderingen te omzeilen deze beperkingen nodig zijn. Cellijnen onbetwistbare voordelen hebben: (1) zij beschikken over onbeperkte proliferatie capaciteit waarmee het genereren van genoeg materiaal voor biochemische en biologische studies, (2) ze zijn gevoelig voor genetische manipulaties (knockdown, knock-out, overexpressie), (3) de kosten relatief laag is, en (4) zij toestaan dat een zekere mate van biologische vereenvoudiging vereist in bepaalde experimentele benaderingen.
De ouderlijke IL-3 (interleukine-3) afhankelijke 32 quinquies cellijn werd in 1983 opgericht door Greenberger en collega's door infectie van beenmergcellen van C3H/HeJ muizen met vriend lymfkliertest leukemie virus9. Verschillende 32ste klonen werden beschreven in de literatuur: cl-239, cl-310en cl-1011. De 32ste cl-3 cellen bleken te verspreiden in IL-3 en ondergaan neutrofiele differentiatie op een behandeling met granulocyt-kolonie stimulatie factor (G-CSF)10. Integendeel, werden 32ste cl-10 cellen, terwijl zijn afhankelijk van de IL-3, oorspronkelijk niet onderscheiden in reactie op G-CSF behandeling. In 1995 de groep van Dr. Ivo Touw retrovirally getransduceerde 32ste cl-10 cellen met wild type en mutant vormen van G-CSF receptor (G-CSF-R), teneinde functioneel belangrijke delen van deze receptor11. Deze studie resulteerde in de generatie van de 32 quinquies/G-CSF-R-cellen, die ook afhankelijk van IL-3 zijn, maar binnen 6 tot 10 dagen na de vervanging van IL-3 met G-CSF, cellen stoppen om te vermenigvuldigen en onherroepelijk onderscheiden in volwassen neutrofiele granulocyten. Deze eigenschappen maken 32ste cl-3 en 32 quinquies/G-CSF-R cellen vereenvoudigde modellen van lymfkliertest neutrofiele differentiatie die kan worden gedifferentieerd door twee welomschreven groei en differentiatie factoren - IL-3 en G-CSF. Tijdens de laatste decennia hebben meerdere groepen 32 quinquies/G-CSF-R cellen gebruikt om te bestuderen van de rol van bepaalde genen in de proliferatie en differentiatie van myeloïde cellen in cultuur12,13,14,15 , 16, en te bestuderen of G-CSF signalering17,18. Nog belangrijker is, de resultaten verkregen met behulp van deze cellijn gecorreleerd met gegevens die zijn verkregen met primaire cellen en transgene muizen16,19,20,21. Wij zijn bijgevolg van mening dat 32 quinquies/G-CSF-R paneeltechnologie, een wijd gebruikte en reeds lang gevestigde model een waardevolle systeem vormen te bestuderen myeloïde differentiatie die kan worden gebruikt in parallel met andere benaderingen voor het aanpakken van deze vraag.
Hier, gedetailleerde protocollen beschrijven de behandeling van de 32 quinquies/G-CSF-R cellijn, welke uitbreiding van de dekking, differentiatie en evaluatie van de proliferatie en differentiatie van deze cellen wordt gepresenteerd. Gedetailleerde informatie voor genetische modificatie van 32 quinquies/G-CSF-R cellen, hetzij door retrovirale of lentivirale signaaltransductie, evenals de protocollen voor virus titratie zijn verstrekt. Daarnaast vindt u enkele representatieve resultaten waaruit potentiële toepassingen van 32 quinquies/G-CSF-R cellen.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 poedermedium</td><td>Merck, Kenilworth, NJ, USA</td><td>T 121-10</td><td>zonder NaHCO3, met L-glutamine</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>15028</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>31985-047</td><td>L-Glutamine, Fenol Rood</td></tr><tr><td>Foetaal runderserum (FBS)</td><td>PAA Laboratories (GE Healthcare,Chicago, IL, USA)</td><td>MT35011CV</td><td>Voor differentiatie van 32D/G-CSF-R cellen</td></tr><tr><td>Foetaal runderserum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>10270</td><td>Gebruikt voor het kweken van HEK293T, NIH3T3, BOSC23 cellen</td></tr><tr><td>Penicilline</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>S9137</td><td>Streptomycine sulfaat zout poeder</td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>G1914</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL-3</td><td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>Human G-CSF</td><td>PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA</td><td>300-23</td><td></td></tr><tr><td>Polyethyleenimide</td><td>Polyscience, Warrington, PA, USA</td><td>23966</td><td>Lineair, MW 25.000 (PEI 25000)</td></tr><tr><td>Polybreen</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>VWR Chemicals, Radnor, PA, USA</td><td>0458</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Kristalkobalt</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>Trypaanblauw</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>T6146</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfaat (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich (Merck, Kenilworth, NJ, USA)</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>May-Grünwald Giemsa</td><td>DiaPath, Martinengo, BG, Italië</td><td>10802</td><td></td></tr></tbody></table>

proliferatie en differentiatie van lymfkliertest myeloïde voorloper 32 quinquies/g-csf-r cellen

Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells

Inzicht in de hematopoietische stamcellen en voorlopercellen celbiologie heeft belangrijke implicaties voor regeneratieve geneeskunde en de behandeling van hematologische aandoeningen. Ondanks de meest relevante gegevens die kan worden verkregen met behulp van in vivo modellen of primaire culturen, beperkt de lage overvloed van hematopoietische cellen van de stam en voorlopercellen aanzienlijk de pool van geschikte technieken voor hun onderzoek. Daarom kan het gebruik van cellijnen voldoende productie van biologisch materiaal voor de uitvoering van screenings of testen waarvoor grote cel nummers. Hier presenteren we een gedetailleerde beschrijving, uitlezing en interpretatie van de proliferatie en differentiatie tests die worden gebruikt voor het onderzoek van de processen die betrokken zijn bij myelopoiesis en neutrofiele differentiatie. Deze experimenten gebruikmaken van de 32 quinquies/G-CSF-R cytokine lymfkliertest myeloïde doelcel lijn, die beschikt over de mogelijkheid om te verspreiden in het bijzijn van IL-3 en differentiëren in G-CSF. Wij bieden geoptimaliseerde protocollen voor het afhandelen van 32 quinquies/G-CSF-R cellen en bespreken van valkuilen en nadelen die de beschreven tests en de verwachte resultaten in gevaar kunnen brengen. Daarnaast bevat dit artikel protocollen voor lentivirale en retrovirale productie, titratie en transductie van 32 quinquies/G-CSF-R cellen. We laten zien dat genetische manipulatie van deze cellen kan worden gebruikt met succes functionele en moleculaire om onderzoek te verrichten, die resultaten verkregen met primaire hematopoietische cellen van de stam en voorlopercellen of in vivo modellen kunnen aanvullen.

Proliferatie en differentiatie van cellen van de 32 quinquies/G-CSF-R
Om te beoordelen van proliferatie van 32 quinquies/G-CSF-R cellen onder de voorwaarden van pro-proliferatieve en Pro-differentiatie, werden 32 quinquies/G-CSF-R cellen gekweekt in medium met IL-3 en G-CSF, respectievelijk. Het werd waargenomen dat cellen gekweekt in IL-3 met medium (10 ng/mL) ongeveer elke 24 h (figuur 2A verdelen). ...

Hier worden gedetailleerde protocollen voor het kweken van de 32 quinquies/G-CSF-R cellijn van lymfkliertest myeloïde voorloper, uitvoeren van virale infecties en het uitvoeren van de proliferatie en differentiatie testen gepresenteerd. Deze cellijn is geschikt voor de studie van myeloïde cel ontwikkeling, en de rol van genen van belang in myeloïde celgroei en neutrofiele differentiatie.

Proliferatie en differentiatie van lymfkliertest myeloïde voorloper 32 quinquies/G-CSF-R cellen

Understanding of the hematopoietic stem and progenitor cell biology has important implications for regenerative medicine and the treatment of ...

Het algemene doel van dit experiment is om de murine myeloïde 32D-G-CSF-R cellen genetisch te modificeren door het gen van belang over te expresseren of te silencingen, en vervolgens het effect van deze veranderingen op de proliferatie en neutrofiele differentiatie van de cellijn te bepalen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de hematologie, zoals de manier waarop uw eiwit van belang betrokken kan zijn bij de groei en differentiatie van myeloïde precursorcellen. Het belangrijkste voordeel van deze cellijn is dat deze een onbeperkte proliferatiecapaciteit bezit, gevoelig is voor genetische manipulaties, relatief goedkoop is en een mate van biologische vereenvoudiging mogelijk maakt die vereist is bij bepaalde experimentele benaderingen. De procedure zal vandaag worden gedemonstreerd door Petr Danek, een PhD-student in mijn laboratorium.Bereid 250 milliliters RPMI-1640-medium voor, aangevuld met hitte-geïnactiveerd 10% foetaal runderserum en 10 nanograms per milliliter murine interleukine-3. Bereid vervolgens 50 milliliters differentiatiemedium.Zaai in een Petrischaal van 16 centimeter een suspensie van enkelvoudige Bosc23-cellen in 18 milliliter DMEM-

proliferation-differentiation-murine-myeloid-precursor-32dg-csf-r

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Deze video toont de procedure voor de differentiatie van myeloïde dendritische cellen van de muis beenmerg. Isolatie van de muis scheenbeen en dijbeen, en verwerking van het beenmerg worden aangetoond. Foto's tonen celmorfologie voor en na de differentiatie, en figuren afbeelden cel fenotype en IL-12 productie na rijping met behulp van CpG worden weergegeven.

Cultuur van myeloïde dendritische cellen uit beenmerg precursors

Dit protocol beschrijft de afleiding van gliale Beperkte Voorlopers uit foetaal ruggenmerg en onderhouden in vitro hetzij voor transplantatie of voor de studie van oligodendrocytic afstamming.

Afleiding van gliale Beperkte Voorlopers van de E13 muizen

This video demonstrates a method for obtaining Schwann cell-like cells from multipotent bone marrow stromal cells (BMSCs). Initially, the BMSCs undergo hypoxia treatment, followed by directed differentiation into neuronal progenitor cells. Subsequently, specific media and culture conditions are employed to induce the transformation of these progenitor cells into Schwann cell-like cells.

Generating Schwann Cell-Like Cells from Bone Marrow Stromal Cells

Dit protocol beschrijft experimentele procedures om de differentiatie van plasmacytoïde dendritische cellen in Peyer's patch van zachte dendritische celvoorlopers nagegaan met behulp van technieken met FACS-gemedieerde isolatie hydrodynamische gentransfer en flow-analyse van immune subsets in Peyer's patch.

Het beoordelen van de ontwikkeling van de Muriene plasmacytoïde dendritische cellen in Peyer&#39;s Patches Met behulp adoptieve overdracht van hematopoëtische voorlopers

In deze studie presenteren we een in vitro kweeksysteem dat efficiënt pDC's kan genereren door co-cultiveren van gemeenschappelijke lymfoïde progenitorcellen met AC-6 feedercellen in aanwezigheid van Flt3-ligand.

In vitro generatie van Muriene plasmacytoïde dendritische cellen van Common Lymfoïde Progenitors met behulp van de AC-6 Feeder System

Spiercellen (MSC's) met neurale potentieel bestaan ​​in het beenmerg. Ons protocol verrijkt deze populatie van cellen via hypoxische preconditioning en wijst hen vervolgens op om volwassen Schwann cellen te worden.

Hypoxische preconditioning van merg-afgeleide progenitorcellen als bron voor de generatie van volwassen Schwann-cellen

Hier bieden we een methode voor het vaststellen en isoleren van grote aantallen van GM-CSF gedreven myeloïde cellen met hoge snelheid cel sorteren. Vijf verschillende populaties (gemeenschappelijk myeloïde voorlopercellen, granulocyt/macrofaag progenitoren monocyten, monocyt-afgeleide macrofagen en monocyt-afgeleide DCs) kunnen worden geïdentificeerd op basis van Ly6C en CD115 expressie.

Generatie van grote aantallen van myeloïde voorlopercellen en dendritische cel precursoren uit lymfkliertest beenmerg met behulp van een nieuwe cel sorteren van strategie

We laten zien hoe te identificeren en te isoleren 6 deelverzamelingen van myeloïde voorlopercellen uit lymfkliertest beenmerg met behulp van een combinatie van magnetische en fluorescentie sorteren (MACS en FACS). Dit protocol kan worden gebruikt voor in vitro cultuur assays (methylcellulose of vloeistof culturen), in vivo adoptief overdracht experimenten en RNA/eiwit analyses.

Identificatie en isolatie van de Oligopotent en Lineage-begaan myeloïde voorlopercellen uit beenmerg van de muis

Hier presenteren we een protocol voor immunophenotypic karakterisering en cytokine geïnduceerde differentiatie van snoer bloed afgeleide CD34+ hematopoietische stam en voorlopercellen tot de vier myeloïde lijn. De toepassingen van dit protocol omvatten onderzoeken naar het effect van myeloïde ziekte mutaties of kleine moleculen op myeloïde differentiatie van de CD34+ cellen.

Pan-myeloïde differentiatie van menselijk snoer bloed afgeleid CD34+ hematopoietische stam en voorlopercellen

Hier beschrijven we een nieuwe flowcytometrische methode voor prospectieve isolatie van vroege burst-forming unit erythroid (BFU-e) en kolonievormende unit erythroid (CFU-e) voorlopers rechtstreeks uit vers beenmerg en milt van muizen. Dit protocol, ontwikkeld op basis van eencellige transcriptomische gegevens, is het eerste dat alle erytroïde voorlopercellen van het weefsel met een hoge zuiverheid isoleert.

Identificatie en isolatie van burst-forming unit en kolonievormende eenheid Erytroïde voorlopers uit muizenweefsel door flowcytometrie

Leer proliferatie- en differentiatieprotocollen voor de murine myeloïde 32D/G-CSF-R-cellijn. Deze methode helpt onderzoekers genetische modificaties te bestuderen en hun effect op myelopoëse te analyseren.

Proliferatie en differentiatie van lymfkliertest myeloïde voorloper 32 quinquies/G-CSF-R cellen

Meer video's verkennen