Proliferatie en differentiatie van lymfkliertest myeloïde voorloper 32 quinquies/G-CSF-R cellen

Het algemene doel van dit experiment is om de murine myeloïde 32D-G-CSF-R cellen genetisch te modificeren door het gen van belang over te expresseren of te silencingen, en vervolgens het effect van deze veranderingen op de proliferatie en neutrofiele differentiatie van de cellijn te bepalen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de hematologie, zoals de manier waarop uw eiwit van belang betrokken kan zijn bij de groei en differentiatie van myeloïde precursorcellen. Het belangrijkste voordeel van deze cellijn is dat deze een onbeperkte proliferatiecapaciteit bezit, gevoelig is voor genetische manipulaties, relatief goedkoop is en een mate van biologische vereenvoudiging mogelijk maakt die vereist is bij bepaalde experimentele benaderingen. De procedure zal vandaag worden gedemonstreerd door Petr Danek, een PhD-student in mijn laboratorium.

Bereid 250 milliliters RPMI-1640-medium voor, aangevuld met hitte-geïnactiveerd 10% foetaal runderserum en 10 nanograms per milliliter murine interleukine-3. Bereid vervolgens 50 milliliters differentiatiemedium.

Zaai in een Petrischaal van 16 centimeter een suspensie van enkelvoudige Bosc23-cellen in 18 milliliter DMEM-medium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum. Kweek dit gedurende ongeveer 24 uur tot de confluentie 80% bereikt. Combineer vervolgens het MSCV-retroviraal construct, de PCL-echo packaging-vector, polyethylenimine en serumarm medium zonder antibiotica. Incubeer dit mengsel in een Flowbox bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Vervang daarna voorzichtig het kweekmedium van de Bosc23-cellen door 16 milliliter voorverwarmd DMEM-medium aangevuld met 2% foetaal kalfsserum, gehandhaafd bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens het retrovirale mengsel druppelsgewijs toe aan de Bosc23-cellen. Incubeer de kweek daarna vier uur bij 37 graden Celsius.

Zodra de incubatie is voltooid, wordt het Bosc23-kweekmedium afgezogen en worden 18 milliliters voorverwarmd DMEM-medium met 10% foetaal runderserum toegevoegd. Incubeer de cellen 48 uur bij 37 graden Celsius. Gebruik een serologische pipette van 25 milliliter om het virusbevattende Bosc23-medium over te brengen naar een conische buis van 50 milliliter. Bewaar de buis bij vier graden Celsius. Voeg vervolgens 18 milliliters voorverwarmd DMEM-medium met 10% foetaal runderserum toe aan de Bosc23-cellen en kweek de cellen gedurende 24 uur.

Centrifugeer het virale supernatant bij 1 500 ×g gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Verdeel het virus vervolgens in aliquoten en vries deze snel in met vloeibare stikstof om ze te bewaren bij minus 80 graden Celsius.

Zaai in elke put van een zesputsplaat NIH/3T3-cellen in drie milliliter DMEM-medium aangevuld met 10% foetaal runderserum om één virus te titreren. Kweek de cellen gedurende de nacht bij 37 graden Celsius. Verdun de volgende dag het virus met voorverwarmd medium zonder de virusdeeltjes te vortexen. Aspireer het kweekmedium van de NIH/3T3-cellen en voeg één milliliter verdund virus toe aan elke put. Incubeer gedurende de nacht bij 37 graden Celsius. Aspireer de volgende dag voorzichtig het verdunde virale medium en vervang dit door twee milliliter DMEM-medium met 10% foetaal runderserum en incubeer opnieuw gedurende de nacht bij 37 graden Celsius. Aspireer na de incubatie het oude medium en vervang dit door DMEM-medium dat twee microgram per milliliter puromycine bevat. Ga door met het kweken van de cellen om de drie dagen, of zodra het medium geel wordt, en vul aan met vers medium dat puromycine bevat.

Aspireer tussen de 10e en 12e dag na infectie het medium uit de putjes en was deze voorzichtig met fosfaatgebufferde zoutoplossing. Kleur vervolgens gedurende twee minuten bij kamertemperatuur met één milliliter kristalviolet-oplossing. Was na het kleuren zorgvuldig tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing. Tel het totale aantal blauwe kolonies in elk putje onder een microscoop.

Zaai de 32D-G-CSF-R-cellen in een zes-wells plaat. Voeg het virus toe met een multiplicity of infection tussen 10 en 40. Voeg vervolgens polybrene toe aan de cellen tot een uiteindelijke concentratie van 8 µg/mL en incubeer gedurende zes uur bij 37 °C. Pool na incubatie de cellen in een 15 mL buis en centrifugeer gedurende vijf minuten bij 450 ×g bij 4 °C. De 32D-cellen kunnen gedeeltelijk hun vermogen tot differentiatie verliezen als ze worden gekweekt tot concentraties hoger dan 1 miljoen cellen per ml; daarom is het zeer belangrijk om deze cellen tijdig te splitsen en de culturen niet te laten overgroeien.

Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in een T25-kweekfles met zes milliliter RPMI-1640-medium, aangevuld met hitte-geïnactiveerd 10% foetaal runderserum en 10 nanogram per milliliter murine interleukine-3. Incubeer de cellen 48 uur lang bij 37 °C.

Was de 32D-G-CSF-R-cellen tweemaal met RPMI-1640-medium zonder cytokinen. Zaai de cellen vervolgens op dag nul in één milliliter differentiatiemedium in een 24-wells plaat en incubeer deze gedurende de nacht bij 37 °C. De cellen doen er zeven tot negen dagen over om te differentiëren tot mature granulocyten. Tel vervolgens het aantal cellen met trypanblauw om dode cellen uit te sluiten.

Aangezien IL-3 het differentiatieproces kan remmen, is het absoluut cruciaal om alle sporen van de cytokine te verwijderen voordat de cellen in GCSF worden gekweekt.

Centrifugeer de cellen op een glazen objectglas met behulp van een cytospin-centrifuge met de benodigde adapters bij 20 ×g gedurende vijf minuten. Fixeer de cellen vervolgens gedurende vijf minuten in methanol bij kamertemperatuur en laat de cellen drogen. Kleur de cellen met May-Grünwald Giemsa-kleuring volgens het protocol van de fabrikant. Visualiseer na het kleuren de cellen die de kleurstof hebben opgenomen met een 40X vergroting.

Kwantificeer op basis van de cellulaire morfologie het aantal blasten, intermediair gedifferentieerde cellen en mature granulocyten in de gekleurde cellen.

Hier wordt een grafische weergave getoond die de proliferatie van 32D-G-CSF-R-cellen in media met interleukine-3 en granulocyt-koloniestimulerende factor demonstreert. De x-as representeert de behandelingsdagen, de y-as representeert het celgetal op een logaritmische schaal. De zwarte grafiek toont de proliferatie wanneer de cellen worden gekweekt in medium met interleukine-3. De blauwe grafiek toont een afname in celproliferatie wanneer deze worden gekweekt in medium met granulocyt-koloniestimulerende factor.

Hier worden representatieve cirkeldiagrammen en May-Grunwald Giemsa-kleuringen getoond die de proportie en differentiatie-morfologie van 32D-G-CSF-R cellen in medium met granulocyt-koloniestimulerende factor laten zien. De cirkeldiagrammen tonen de proportie blasten, intermediair gedifferentieerde cellen en neutrofielen bij behandeling met granulocyt-koloniestimulerende factor op dag nul, twee, vier en zes. De met Giemsa gekleurde cellen op dag nul vertonen grote karakteristieke kernen en donker cytoplasma. Op dag zes is de kerngrootte afgenomen en is het cytoplasma vergroot, maar niet donker.

Hier worden representatieve cirkeldiagrammen getoond die een hoger aandeel blastencellen laten zien wanneer er getransduceerd is met BCR-ABL-fusie-eiwitten vergeleken met de controle MSCV-vector in media met granulocytenkoloniestimulerende factor. De Giemsa-kleuring in het onderste paneel is representatief voor de cellen wanneer deze getransduceerd zijn met controle- of BCR-ABL-fusie-eiwitten.

De cellen ondergingen neutrofiele differentiatie op dag zes wanneer ze werden getransduceerd met de MSCV-controlevector, maar BCR-ABL-getransduceerde cellen vertoonden voornamelijk blastcellen en geen rijpe neutrofielen.

Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in twee dagen worden voltooid mits deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de 32D-G-CSF receptor-cellen bij de aangegeven concentraties gekweekt moeten worden. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals migratieassays en overlevingsexperimenten, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in de hantering van de 32D-G-CSF receptor-cellijn, inclusief genetische manipulatie via lentivirale en retrovirale transductie, expansie, differentiatie en de beoordeling van de proliferatie en differentiatie van deze cellen. Vergeet niet dat werken met virussen gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van handschoenen en een beschermbril, altijd in acht moeten worden genomen tijdens deze procedure.