Een Time-lapse, Label-vrije, kwantitatieve fase Imaging studie van slapende en actieve menselijke kankercellen
16 februari 2018
Slapende en actieve kanker cel fenotypen werden gekenmerkt met behulp van kwantitatieve fase imaging. Cel proliferatie, migratie en morfologie assays werden geïntegreerd en geanalyseerd in één eenvoudige methode.
Het algemene doel van dit experiment is om angiogeen en niet-angiogene fenotypes van humane osteosarcoomcellen op een systematische manier kwantitatief te karakteriseren door een combinatie van analyses van celmorfologie, proliferatie en beweeglijkheid. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen met betrekking tot de ontwikkeling en progressie van kanker bij mensen. Met name de ontsnapping uit tumordormantie en de endogene overschakeling.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat multicellulaire parameters gelijktijdig kunnen worden geanalyseerd door deze geïntegreerde, wijdverbreide methode. Dit omvat celoppervlak, celdikte, celvolume, proliferatiesnelheid, verdubbelingstijd, beweegsnelheid, migratie en beweeglijkheid. Om te beginnen, verwarm het kweekmedium voor tot 37 graden Celsius in een waterbad.
Vervolgens verwijderen cryogenic vials van angiogeen en niet-angiogene humane osteosarcoomcellen uit de vloeibare stikstoftank. Dompel de bodem van de flesjes in een 37 graden Celsius waterbad en schud de cryogenic flesjes voorzichtig om het ontdooiproces te versnellen. Zodra de cellen zijn ontdooid, spuit de fles met 70%ethanol en veeg de fles om het te steriliseren.
Aspireer vervolgens onmiddellijk de celsuspensie uit de fles en schud ze voorzichtig in 10 milliliters verwarmd kweekmedium. Centrifugeer vervolgens de celsuspensies gedurende vijf minuten om de cellen te pelletten. Terug in de kap, verwijder de supernatant en resuspendeer het celpellet met 10 milliliters verwarmd kweekmedium.
Breng vervolgens de celsuspensie over in een T75 fles. Pipetteer de celsuspensie voorzichtig meerdere keren om de cellen gelijkmatig te verspreiden. Plaats de fles in een incubator en laat de cellen minimaal 12 uur hechten.
Ververs het kweekmedium om de twee tot drie dagen. Wanneer de cellen 80 tot 100 procent confluency bereiken, verwijder het kweekmedium van de fles en was de cellen met vijf milliliters steriele PBS zonder calcium en magnesium. Voeg vervolgens een milliliter van een 0,25% tripsine EDTA oplossing toe aan de fles en slinger de fles kort.
Incubeer de fles gedurende twee tot drie minuten en controleer vervolgens de cellen onder een microscoop om er zeker van te zijn dat de cellen zijn afgerond en losgelaten. Zodra de cellen zijn losgelaten, gebruik een pipetteer om 10 milliliters kweekmedium toe te voegen en pipetteer het medium voorzichtig om en om om eventuele resterende celaggregaten te breken. Na het tellen van de cellen, zaai twee miljoen ervan in een nieuwe T75 fles.
Plaats de fles in een incubator en laat de cellen groeien tot tussen de 80 en 100 procent confluency voordat de cellen worden gezaaid voor het kwantitatieve fasebeelden experiment. Oogst de cellen door tripsine-digestie en zaai angiogeen en niet-angiogene humane osteosarcoomcellen in zes putjes platen met een dichtheid van 50.000 tot 300.000 cellen per putje. Bedek de cellen met een totaal van vijf milliliters kweekmedium.
Incubeer vervolgens de platen gedurende ten minste 12 uur om de cellen de tijd te geven om te hechten. Vervang het medium met vers medium voordat u gaat beeldvormen. Reinig een dekglas door het meerdere keren te spoelen met stromend gedeïoniseerd water.
Dompel het vervolgens gedurende 15 minuten in een 75% ethanoloplossing. Plaats het gesteriliseerde dekglas in een laminaire flowkap om te drogen. Plaats vervolgens voorzichtig het dekglas in een zes-putjesplaat, waarbij duidelijke luchtbellen worden vermeden.
Plaats de plaat in de incubator om gedurende ten minste 15 minuten te gelijkstellen. Als er mist op de deksel van de plaat ontstaat, gebruik dan een steriele wattenstaafje om het schoon te maken voordat u gaat beeldvormen. Open de kwantitatieve fasebeelden software en initialiseer het systeem.
Zorg ervoor dat de waarden acceptabel zijn in de zelfkalibratie van belichtingstijd, patrooncontrast en hologramruis. Plaats vervolgens de zes-putjesplaat op de stage van de kwantitatieve fasebeelden microscoop. Terug in de software, klik op live capture.
Ga vervolgens naar het software focus menu en selecteer handmatig. Ga vervolgens naar het microscoopinstellingen menu en focus de fasebeelden van de cellen grof door de werkafstand aan te passen om contouren voor cellen in fasebeelden te verkrijgen. Wanneer u klaar bent, ga terug naar het software focus menu en wijzig de focusinstelling naar automatisch.
Klik nu op nieuw experiment. Begin met het selecteren van beeldverwervingsposities met behulp van de muis of de pijltoetsen op het numerieke toetsenbord. Klik op onthouden na elke selectie.
Zodra alle posities zijn geselecteerd, ga naar de time lapse sectie en stel de beeldverwervingsintervallen in zodat ze korter zijn dan vijf minuten en de totale tijdsperiode 48 uur is. Start het experiment door op capture te klikken. Dit zal automatisch focussen en beelden verwerven op de geselecteerde posities bij elke intervaltijdstip.
Na beeldverwerving, analyseer de morfologie van de cellen door eerst op cellen identificeren te klikken. Pas de numerieke instelling voor de achtergronddrempel aan zodat celgebieden goed gescheiden zijn van de achtergrondruis. Pas vervolgens de instellingsnummer voor objectgrootte aan om ervoor te zorgen dat elke cel slechts één kern heeft.
Wijzig handmatig eventuele celsegmenten die niet aan deze vereiste voldoen door middel van handmatige wijzigingen. Gebruik vervolgens de analyse gegevensfunctie in de software om cellen te analyseren. Start een nieuwe gegevensanalyse door op nieuwe analyse te klikken.
Sleep geselecteerde afbeeldingen naar de bronframes tab en neem celmorfologie parameters op, inclusief celoppervlak, optische dikte en volume voor elke individuele cel. Wanneer u klaar bent, kiest u de scatterplot of histogrammodus en exporteert u de gegevens als tabellen of figuren. Selecteer ten minste vijf afbeeldingen met een tussenruimte van 12 uur en noteer de celnummers die door de software worden verstrekt.
Schat de proliferatiesnelheid van de cellen door te normaliseren met de aanvankelijke celnummers en vervolgens de celnummers uit te zetten. Schat ten slotte de verdubbelingstijd in door de gegevenspunten te passen met behulp van een exponentiële groeicurve. Om celbeweg
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie karakteriseert kwantitatief angiogene en niet-angiogene fenotypes van menselijke osteosarcoomcellen met behulp van een systematische aanpak. De geïntegreerde methode analyseert celmorfologie, proliferatie en mobiliteit om inzichten te bieden in kankerprogressie.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Kankeronderzoek
Achtergrond
- Het begrijpen van het gedrag van kankercellen is cruciaal voor het ontwikkelen van effectieve behandelingen.
- Celrust en de overgang naar actieve toestanden zijn sleutelfactoren in tumorprogressie.
- Kwantitatieve fasebeelden maken een gedetailleerde analyse van celkenmerken mogelijk.
- Gedeeltelijk analyseren van meerdere parameters verbetert de onderzoeksefficiëntie.
Doel van het onderzoek
- De verschillen tussen slapende en actieve kankercelfenotypes karakteriseren.
- De mechanismen achter tumorrust en ontsnapping onderzoeken.
- Een uitgebreide methode bieden voor het analyseren van kankercelgedrag.
Gebruikte methoden
- Kwantitatieve fasebeelden voor celkarakterisering.
- Tests voor celproliferatie en migratie.
- Analyse van celmorfologie inclusief oppervlakte, dikte en volume.
- Integratie van meerdere tests in een enkele methode voor efficiëntie.
Belangrijkste resultaten
- Identificatie van verschillende fenotypes op basis van angiogenese-eigenschappen.
- Kwantitatieve gegevens over celproliferatiesnelheden en mobiliteit.
- Inzichten in de overgang van rust naar actieve proliferatie.
- Demonstratie van de effectiviteit van de geïntegreerde analysemethode.
Conclusies
- De studie biedt een nieuwe aanpak voor het begrijpen van kankerceldynamica.
- De bevindingen kunnen toekomstige kankerbehandelingsstrategieën informeren.
- Geïntegreerde methoden kunnen de efficiëntie van kankeronderzoek verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantitative phase imaging enables label-free, time-resolved analysis of cancer cell phenotypes, supporting mechanistic de-risking in target validation by quantifying morphological and behavioral shifts associated with angiogenic switching. This approach provides predictive confidence in distinguishing dormant and active states, informing early discovery decisions about therapeutic intervention points in tumor progression.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying angiogenic and non-angiogenic phenotypes in human cancer cells.
- Operational Value: Supports biological de-risking through label-free, longitudinal tracking of proliferation and motility parameters.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying phenotypic signatures linked to tumor dormancy escape.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative outputs for cell area, thickness, volume, proliferation rate, and motility speed.
- Reproducibility: Enables consistent measurement across conditions via automated image acquisition and analysis workflows.
- Scalability: Supports multiplexed parameter analysis in a single platform, reducing need for multiple orthogonal assays.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects in vitro phenotypic analysis to in vivo relevance of angiogenic switching in tumor dormancy escape.
- Mechanistic De-risking: Provides quantitative biomarkers (e.g., cell thickness, motility) to assess progression risk in preclinical models.
- Predictive Confidence: Enables data-driven go/no-go decisions by linking morphological changes to functional angiogenic potential.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by delivering multiparametric phenotypic data that informs target validation and lead identification stages through continuous, non-invasive monitoring.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of angiogenic switching by quantifying concurrent changes in morphology, proliferation, and motility.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative readouts enabling comparison of compound effects on cancer cell phenotypes.
- Analytics: Provides normalized proliferation rates and doubling time calculations from time-lapse data for comparative condition analysis.
- Translational Research: Aligns with preclinical validation by establishing disease-relevant phenotypic benchmarks for osteosarcoma models.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable imaging platform applicable across cancer types and phenotypic screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in cancer cell behavior through direct, label-free quantification of angiogenic phenotypes.
- Operational Value: Standardizes multiparametric analysis via integrated imaging, minimizing reagent use and technical variability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by consolidating morphology, proliferation, and motility assays into one workflow.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on quantitative phenotypic dormancy-escape signatures.
Implementation Considerations
- Requires expertise in quantitative phase imaging instrumentation and software-based morphometric analysis.
- Dependent on stable environmental control (temperature, CO2) for 48-hour time-lapse imaging fidelity.
- Necessitates standardized cell seeding and preparation protocols to ensure phenotypic consistency across wells.
- Involves manual validation steps for cell segmentation and tracking to maintain data integrity.
- Limited by field of view and throughput constraints inherent to single-position time-lapse acquisition.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:58
Cell Preparation
2:35
Cell Preparation: Splitting KHOS-A and KHOS-N Cells
3:50
Cell Preparation: Seeding KHOS-A and KHOS-N Cells for QPI
4:30
Quantitative Phase Image Acquisition: Cover Slip Set-up
5:19
Quantitative Phase Imaging
7:03
Analyzing Cell Morphology
8:20
Analyzing Cell Proliferation
8:54
Analyzing Cell Motion
10:16
Results: Quantiative Phase Imaging of Dormant and Active Human Cancer Cells
11:50
Conclusion
