Combinatorische behandelingvan Trichostatin A en vitamine C verbetert de Efficiency van het klonen van muizen door overdracht van de somatische cel

Het algemene doel van dit experiment is om de productie-efficiëntie van gereconstrueerde embryo's en gekloonde muizen te verbeteren met behulp van somatische cel nucleaire transfer. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de basisbiologie, ontwikkelingsbiologie en het redden van bedreigde dieren. Zoals embryonale ontwikkeling, nucleaire programmering en genetisch onderzoek conservering.

Het belangrijkste voordeel van deze methode en techniek is dat het mogelijk is om gekloonde muizen te genereren met een praktische efficiëntie met eenvoudige procedures. Na het bereiden van het kweekmedium volgens het tekstprotocol, los 1,2 gram BSA op in 10 mL steriel water op kamertemperatuur. Voeg ongeveer 0,12 gram gemengde ionenuitwisselingsharskralen toe aan de BSA-oplossing bij kamertemperatuur met voorzichtig roeren.

Wanneer de kralen van kleur veranderen van blauwgroen naar goud, gebruik een pipet om de supernatant-oplossing te recupereren, vervang dan de kralen door een verse partij. Nadat bevestigd is dat de verse kralen niet van kleur veranderen, recupereer de oplossing. Voeg vervolgens 250 microliter 10,5% natriumbicarbonaat toe.

Gebruik een 0,45 micron filter om de supernatant te steriliseren, label het vervolgens als DBSA-stapoplossing en bewaar het bij min 20 graden Celsius. Na het uitvoeren van euthanasie op vrouwelijke muizen die aan superovulatie zijn onderworpen volgens het tekstprotocol, gebruik standaard dissectietechnieken om de buik in te snijden om toegang te krijgen tot het voortplantingskanaal. Gebruik kleine rechte schaar en pincetten om de eileiders te verwijderen en breng ze over naar een vel filterpapier om het bloed van het oppervlak te verwijderen.

Plaats vervolgens de eileiders in minerale olie, gebruik vervolgens dissectienaalden om de ampullae van de eileiders door te snijden en verplaats de cumulus oöcytcomplexen die uit de ampulla komen naar 200 microliter druppels HCZB-medium met 0,1% hyaluronidase. Incubeer het weefsel gedurende vijf minuten op een verwarmende plaat. Bevestig onder een stereomicroscoop dat de cumuluscellen loskomen van de cumulus oöcytcomplexen, verplaats vervolgens tweede meiotische of M2 metafase-stadium oöcyten met enkele resterende cumuluscellen naar MKSOM-medium met 0,3% DBSA.

Was de M2-fase oöcyten vier keer door op en neer te pipetten in het medium om de resterende cumuluscellen los te maken. Bewaar vervolgens de oöcyten in medium bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide tot enucleaties. Om de ontblootte oöcyten van de cumulus oöcytcomplexen te isoleren, breng onder een stereomicroscoop, terwijl je een pipet gebruikt, een klein aantal van de resterende cumuluscellen die zijn verspreid van de cumulus oöcytcomplexen over naar HCZB-medium met 6% DBSA.

Plaats de cumuluscellen op de verwarmende plaat bij 37 graden Celsius tot ze nodig zijn voor somatische cel nucleaire transfer of SCNT. Na het bereiden van PVP-medium en CB-stapoplossingen volgens het tekstprotocol, gebruik een gesteriliseerde pipet met 20 microliter HCZB-medium dat vijf microgram per milliliter CB bevat om de M2-fase oöcyten te wassen. Na het vijf keer herhalen, incubeer de oöcyten in enucleatiesoplossing op de verwarmende plaat gedurende 10 minuten.

Bereid vervolgens de enucleatieruimte voor, gebruik vervolgens een pipet om de M2-oöcyten over te brengen naar de kamer. Voeg vier microliter enucleatiesoplossing toe en bedek de kamer met minerale olie. Identificeer onder een microscoop bij kamertemperatuur de spindels en chromosomen van de M2-fase oöcyt.

Richt vervolgens de oöcyt met een uitgesproken eerste poollichaam met behulp van een vasthoudpipet en micropipet, zodat de positionering van de spindel en het chromosoom zich op de 3:00 of 9:00 positie bevindt. Stel de paizo-pulsintensiteit in op drie tot zes en gebruik een micromanipulatiepipet om tot aan de zona pellucida te boren en een gat erin te maken. Vervolgens met een minimale hoeveelheid cytoplasma volledig enucleaties de spindels en chromosomen.

Bevestig onder zichtbaar licht de afwezigheid van chromosomen in het cytoplasma, was vervolgens de enucleatide oöcyten grondig met MKSOM-medium dat 0,3% DBSA bevat en CB mist. Incubeer de schaal bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide tot celfusie. Om HBJE voor te bereiden, voeg 260 microliter ijskoud HBJE-suspensieoplossing toe aan gelyofiliseerd HVJ-E en pipet omhoog en omlaag totdat het volledig gesuspendeerd is.

Bereid vijf microliter aliquots van de oplossing voor en bewaar ze bij min 80 graden Celsius tot celfusie. Gebruik 20 microliter celfusiebuffer om vijf microliter HVJ-E-oplossing te verdunnen. Plaats de verdunde HBJE-oplossing op ijs tot gebruik.

Nadat de celfusieruimte zoals hier getoond is voorbereid, gebruik een pipet om de enucleatide oöcyten over te brengen naar HCZB-medium in de kamer. Voeg vier microliter van elke oplossing toe zoals getoond en gebruik ongeveer één milliliter minerale olie om de kamer te bedekken. Plaats de kamer met de enucleatide oöcyten op kamertemperatuur onder een microscoop met 400x vergroting.

Gebruik vervolgens de micromanipulatiepipet om de donorcellen over te brengen naar de HVJ-E-suspensieoplossing. Zuig de cumuluscellen een voor een af om ze gelijkmatig van elkaar te scheiden, waardoor seriële celfusie mogelijk is. Houd vervolgens de enucleatide oöcyten in HCZB-medium met behulp van een vasthoudpipet en gebruik de paizo-puls met de micromanipulatiepipet om de zona pellucida te boren.

Na het openen van het gat in de zona pellucida, pipet een cumuluscel met ongeveer vijf keer het volume van de HVJ-E-oplossing en pers het strak in de oöcytmembraan zonder door het membraan te gaan. Volgend op manipulatie van celfusie, breng de oöcyten onmiddellijk over naar MKSOM-medium dat 0,3% DBSA bevat en verplaats ze naar een incubateur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende één uur. Deze therapeutische st