Name: Een geoptimaliseerde Evans Blue Protocol bij het beoordelen van vasculaire lek in de muis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Leer een geoptimaliseerd Evans Blue-protocol om vasculair lek in muizen te beoordelen met behulp van katheterisatie en kwantitatieve extractie. Deze methode biedt betrouwbare toegang voor vasculair onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedank Andy Poczobutt en Dr. Jori Leszczynski voor hun waardevolle hulp en de wijzigingen in dit manuscript.  Ondersteund door subsidies ontvangen van de National Heart, Lung en Blood Institute (NHLBI RO1 HL078929, PPG HL014985 en RO3 HL095439) en het Department of Veterans' Affairs (verdienste Review).

Alle internationale, nationale en/of institutionele richtsnoeren van toepassing voor de zorg en het gebruik van dieren (muizen) werden gevolgd in de experimenten beschreven in dit manuscript.
Deze methode gebruikt FVBN volwassen muizen, leeftijd 16-20 weken, vastgesteld dat optimale voor de doeleinden van deze studie. Dag 1 bevat stappen 1-5 en dag 2 stappen 6-7 (Figuur 1).
1. apparatuur voorbereiding
<ol><li>Veilig een voldoende toevoer van steriele, disposable spuiten en naalden, als ketamine/xylazine wordt gebruikt als de verdoving (aanbevolen). Als Isofluraan als de verdoving wordt gebruikt, controleert u de zuurstoftank en het vloeistofniveau van Isofluraan om te controleren of er voldoende voorraden voor het experiment voordat u begint. Ook de neuskegel ademhaling schakelingen te monteren en deze koppelen aan het vak inductie; nieuwe houtskool vaten hechten aan de ademhaling circuits. Bereid het vak inductie door te draaien op de zuurstof en na te gaan dat de tweede fase ongeveer 50 psi leest.</li>
	<li>Inschakelen van de verwarming pad tot 37 ° C.</li>
	<li>Bereiden de rectale temperatuursonde voor de operatie.</li>
</ol>2. muis voorbereiding
Deze stap omvat anesthesie, ontharing en positionering (volwassen FVBN muizen-leeftijd 16-20 weken).
<ol><li>Weeg de muizen en opnemen van de gewichten.</li>
	<li>Anesthetize van de muizen.<ol>
<li>Beheren van ketamine en xylazine IP (80-100 mg/kg en 7.5-16 mg/kg, respectievelijk). Het is echter raadzaam om te beginnen met lagere doses van ketamine en xylazine (over 30 mg/kg en 6 mg/kg, respectievelijk).</li>
		<li>Handhaven van de narcose met ongeveer 0,1 - 0,25 keer initiële doses van ketamine/xylazine tijdens de operatie. Ketamine en xylazine waren de verdoving agent(en) van keuze in dit bijzondere studie, zoals meer reproduceerbaarheid en de overlevingskansen werden waargenomen. De verdoving agent(en) van keuze in andere studies kan worden gevonden om anders te zijn.  Als Isofluraan wordt gebruikt, zet de muis in de kamer van een inductie en inschakelen van Isofluraan tot 5% totdat de muis volledig bewustzijn verliest. Gebruik vervolgens een nasale neuskegel vastgesteld op 1,5 tot 2,5% Isofluraan gedurende de rest van de procedure.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De muizen elke 2-3 min door teen knijpen om te controleren op de juiste diepte van anesthesie volgen.</li>
	<li>Scheren de ventrale halsgebied van de muis.</li>
	<li>Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in een liggende positie op de voorverwarmde pad. Beveilig de poten en voeten van de muis naar de chirurgische oppervlakte met tape.</li>
	<li>Plaats van kunstmatige scheur zalf op de ogen om te voorkomen dat tijdens de operatie uitdrogen.</li>
</ol>3. chirurgische Details
<ol><li>Maak een incisie van 1 cm in de rechts ventrale nek over de halsslagader.</li>
	<li>Gelden één of twee druppels van lidocaïne (1-2%) in het gebied van de incisie voor pijnbehandeling en ter bevordering van vasodilatatie. Wacht 2 minuten voor de lidocaïne kracht.</li>
	<li>Bloot en isoleren van de juiste interne halsslagader via botte dissectie. Tie van de ader af met 4-0 hechtdraad en zachtjes trekken de rostraal einde van het schip met een hemostat. Een gat, met behulp van fijn schaar, ongeveer 3 mm hieronder of caudal aan de stropdas, ongeveer halverwege de diameter van de ader.</li>
	<li>Een PV-1 polyvinyl katheter 1,5 cm van het einde markeren en plaatst u deze in de halsslagader door het gat met behulp van een vaartuig dilator en draad van de katheter caudal eind van het vaartuig, ongeveer 1,5 cm.</li>
	<li>De katheter veilig binnen de staartzijde van het schip (onder de gesneden), met 4-0 zijde binden. Bind de rostraal deel van het schip aan de buitenkant van de katheter met de losse eindjes van de hechtdraad die werd gebruikt om te binden uit de rostraal halsslagader, in stap 3.3.</li>
	<li>Tack de huid weer los bij elkaar rond de katheter met 4-0 zijde om te voorkomen dat het verlies van lichaamswarmte en uitdroging van de weefsels.</li>
	<li>De katheter verbinden met een injectiespuit met EDTA saline (10 U/mL) en de katheter spoelen.</li>
</ol>4. injecties
<ol><li>Injecteren de Evans blauwe oplossing (50 μl van een 30 mg/mL oplossing in de normale, unheparinized saline 0,9%, of ongeveer 50 mg/kg) in de halsslagader katheter, gevolgd door een klein volume van EDTA zoutoplossing te spoelen van de lijn.</li>
	<li>2 min later injecteren stof P (100 μl van een 0,3 μM-oplossing in de normale, unheparinized saline 0,9%, of 1 nmol/kg), gevolgd door een klein volume van EDTA zoutoplossing te spoelen van de lijn. Stof P verhoogt de extravasation van plasma-eiwitten door het endotheel laag; in dit protocol induceert het routinematig een vergroting van plasma extravasation waarden van ongeveer 1.5-fold, gemakkelijker plasma extravasation waarden te meten.</li>
	<li>18 min wachten nadat de stof P wordt geïnjecteerd. Gedurende deze tijd, zal de Evans blauwe kleurstof equilibreer en circuleren.</li>
	<li>Beëindigen van het experiment 18 min na de injectie van stof P (20 min na Evans blauwe injectie) door het opofferen van de muis met cervicale dislocatie. Het is waarschijnlijk dat de muis rechtstreeks cervically worden kan ontwricht, zonder een overdosis van een verdovingsmiddel, als de muis is waarschijnlijk nog goed narcose vanuit de chirurgie. Echter, als het nodig is, een overdosis van de verdoving ketamine/xylazine, Isofluraan of pentobarbital mag worden verleend, gevolgd door cervicale dislocatie.</li>
</ol>5. isolatie van organen
<ol><li>De borstholte van de muis opengesneden en zwaartekracht-perfuse (vanaf een hoogte van ongeveer 51 cm of 20") het hart en de bloedvaten met 50 mL 50 mM Natriumcitraat, pH 3,5. pH 3.5 behoudt vermoedelijk Evans blauwe binding met albumine.</li>
	<li>1-5 relevante organen (weefsels) met een ontleden scalpel (bijvoorbeeld de urineblaas, nieren, maag, lever, alvleesklier, proximaal of DISTAAL colon, ileum, twaalfvingerige darm, flank huid, oren, staart, hart, en/of longen) accijnzen en verwijder eventuele resterende inhoud, als aanwezig.</li>
	<li>Spoel de organen in een kamertemperatuur (RT)-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; 1,44 g Na,2HPO4, 0,24 g KH2PO4, 8,0 g van NaCl en 0,20 g van KCl in 1 L, pH 7.4).</li>
	<li>Vlek van de organen met weefsel, elk orgaan in tweeën gesneden en elke helft wegen (NAT gewichten, in g).</li>
	<li>Droog een helft van het weefsel in een droogstoof bij 150 ° C, op folie, voor 48 uur.</li>
	<li>Plaats de andere helft in een consistent volume (maximaal 200 µL) van formamide in een microfuge buis voor 48 uur (en maximaal 72 h) weefsel uitpakken van de blauwe Evans.</li>
</ol>6. meting van de weefsel OD
<ol><li>Verwijder 50 µL van Evans blauw-geïnfundeerd formamide (na 48-72 uur RT incubatie) uit de microfuge buis en de plaats in een putje van een 96-Wells polystyreen plaat. Wees voorzichtig niet over te dragen van weefsel stukken samen met de formamide.</li>
	<li>Plaats 50 µL van nieuwe, pure formamide in elk van de twee lege putjes van de 96-wells-plaat voor de blanco.</li>
	<li>Meten en registreren van de OD620 van elk putje van de 96-wells-plaat op een extinctie-afleesapparaat. 620 nm is de extinctie max Evans blauw.</li>
</ol>7. berekening van de Plasma Extravasation
<ol><li>Weeg het droge weefsel helft die al in de oven gedurende 48 uur.</li>
	<li>Bereken de natte gewicht/droog gewichtsverhouding voor de specifieke orgel van belang van elke afzonderlijke muis, beginnend met het natte gewicht van dit weefsel helft (verkregen in stap 5.4), gedeeld door het droge gewicht van dit dezelfde weefsel helft (verkregen in stap 7.1).</li>
	<li>Berekenen van het droge gewicht (in g) van het weefsel helft in formamide door te delen het natte gewicht van het weefsel helft voordat het werd geplaatst in formamide (verkregen in 5.4 stap) door de natte: droge gewichtsverhouding voor de specifieke orgel van belang (berekend in stap 7.2).</li>
	<li>Berekenen van de waarden OD-620 gecorrigeerd . Beginnen met de OD620 aftrekken waarde van elk experimentele putje van de 96-wells-plaat (met Evans blauw-geïnfundeerd formamide uit elk weefsel, verkregen in stap 6.3), de lege goed OD620 waarde (de gemiddelde OD620 waarde van de twee putten met zuivere formamide, bereid in stap 6.2, OD620 waarden verkregen in stap 6.3) van elke experimentele waarde.</li>
	<li>De plasma extravasation waarde berekenen door de gecorrigeerde OD620 (berekend in stap 7.4) te delen door het droge gewicht van het weefsel helft in formamide (berekend in stap 7.3). De eenheden van plasma extravasation zullen OD620/g drooggewicht.</li>
	<li>Gegevens analyseren en uitdrukkelijke als het gemiddelde ± SEM. statistisch vergelijken groepen door t of one-way variantie-analyse en Scheffé van meerdere-vergelijking test (lycofs01.lycoming.edu), zo nodig.</li>
</ol>

<ol><li>Snijdelaar, D. G., Dirksen, R., Slappendel, R., Crul, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substance+P%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pain%22%5BJournal%5D)">Substance P.</a> Eur J Pain. 4 (2), 121-135 (2000).</li>
<li>Rubinstein, I., Iwamoto, I., Ueki, I. F., Borson, D. B., Nadel, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+neutral+endopeptidase+attenuates+substance+P-induced+plasma+extravasation+in+the+guinea+pig+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Appl+Immunol%22%5BJournal%5D)">Recombinant neutral endopeptidase attenuates substance P-induced plasma extravasation in the guinea pig skin.</a> Int Arch Allergy Appl Immunol. 91 (3), 232-238 (1990).</li>
<li>Szabo, A., Menger, M. D., Boros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+and+epithelial+permeability+measurements+in+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Microsurgery%22%5BJournal%5D)">Microvascular and epithelial permeability measurements in laboratory animals.</a> Microsurgery. 26 (1), 50-53 (2006).</li>
<li>Radu, M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+assay+to+test+blood+vessel+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An in vivo assay to test blood vessel permeability.</a> J Vis Exp. (73), e50062(2013).</li>
<li>Moitra, J., Sammani, S., Garcia, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluation+of+Evans+Blue+dye+as+a+marker+of+albumin+clearance+in+murine+models+of+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Re-evaluation of Evans Blue dye as a marker of albumin clearance in murine models of acute lung injury.</a> Transl Res. 150 (4), 253-265 (2007).</li>
<li>Figini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substance+P+and+bradykinin+stimulate+plasma+extravasation+in+the+mouse+gastrointestinal+tract+and+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Substance P and bradykinin stimulate plasma extravasation in the mouse gastrointestinal tract and pancreas.</a> Am J Physiol. 272 (4), Pt 1 785-793 (1997).</li>
<li>Awad, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+sphingosine+1-phosphate+1+receptor+activation+reduces+ischemia-reperfusion+injury+in+mouse+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Selective sphingosine 1-phosphate 1 receptor activation reduces ischemia-reperfusion injury in mouse kidney.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 290 (6), 1516-1524 (2006).</li>
<li>Lu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+microvascular+permeability+and+blood+pressure+by+neutral+endopeptidase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The control of microvascular permeability and blood pressure by neutral endopeptidase.</a> Nat Med. 3 (8), 904-907 (1997).</li>
<li>Gendron, G., Simard, B., Gobeil, F., Sirois, P., D'Orleans-Juste, P., Regoli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+urotensin-II+enhances+plasma+extravasation+in+specific+vascular+districts+in+Wistar+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Human urotensin-II enhances plasma extravasation in specific vascular districts in Wistar rats.</a> Can J Physiol Pharmacol. 82 (1), 16-21 (2004).</li>
<li>Xu, Q., Qaum, T., Adamis, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+blood-retinal+barrier+breakdown+quantitation+using+Evans+blue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Sensitive blood-retinal barrier breakdown quantitation using Evans blue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (3), 789-794 (2001).</li>
<li>Saria, A., Lundberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evans+blue+fluorescence%3A+quantitative+and+morphological+evaluation+of+vascular+permeability+in+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Evans blue fluorescence: quantitative and morphological evaluation of vascular permeability in animal tissues.</a> J Neurosci Methods. 8 (1), 41-49 (1983).</li>
<li>Fricke, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+of+neurogenesis+-+the+role+of+the+blood+brain+barrier+in+an+experimental+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging of neurogenesis - the role of the blood brain barrier in an experimental model of Parkinson's disease.</a> Eur J Neurosci. 45 (7), 975-986 (2017).</li>
<li>Pink, D. B., Schulte, W., Parseghian, M. H., Zijlstra, A., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+visualization+and+quantitation+of+vascular+permeability+in+vivo%3A+implications+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Real-time visualization and quantitation of vascular permeability in vivo: implications for drug delivery.</a> PLoS One. 7 (3), 33760(2012).</li>
<li>Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+tumour+pathophysiology+using+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy.</a> Nat Rev Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).</li>
<li>Vandoorne, K., Addadi, Y., Neeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+vascular+permeability+and+lymphatic+drainage+using+labeled+serum+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Visualizing vascular permeability and lymphatic drainage using labeled serum albumin.</a> Angiogenesis. 13 (2), 75-85 (2010).</li>
<li>Turner, A. J., Nalivaeva, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteinase+dysbalance+in+pathology%3A+the+neprilysin+%28NEP%29+and+angiotensin-converting+enzyme+%28ACE%29+families%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Biol+%28Noisy-le-grand%29%22%5BJournal%5D)">Proteinase dysbalance in pathology: the neprilysin (NEP) and angiotensin-converting enzyme (ACE) families.</a> Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 52 (4), 40-48 (2006).</li>
<li>Lu, B., Gerard, N. P., Kolakowski, L. F., Finco, O., Carroll, M. C., Gerard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutral+endopeptidase+modulates+septic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Neutral endopeptidase modulates septic shock.</a> Ann N Y Acad Sci. 780, Mar 22 156-163 (1996).</li>
<li>Dempsey, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neprilysin+null+mice+develop+exaggerated+pulmonary+vascular+remodeling+in+response+to+chronic+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Neprilysin null mice develop exaggerated pulmonary vascular remodeling in response to chronic hypoxia.</a> Am J Pathol. 174 (3), 782-796 (2009).</li>
<li>Karoor, V., Oka, M., Walchak, S. J., Hersh, L. B., Miller, Y. E., Dempsey, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neprilysin+regulates+pulmonary+artery+smooth+muscle+cell+phenotype+through+a+platelet-derived+growth+factor+receptor-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Neprilysin regulates pulmonary artery smooth muscle cell phenotype through a platelet-derived growth factor receptor-dependent mechanism.</a> Hypertension. 61 (4), 921-930 (2013).</li>
<li>Chu, P., Arber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin-section+detection+of+CD10+in+505+nonhematopoietic+neoplasms.+Frequent+expression+in+renal+cell+carcinoma+and+endometrial+stromal+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Paraffin-section detection of CD10 in 505 nonhematopoietic neoplasms. Frequent expression in renal cell carcinoma and endometrial stromal sarcoma.</a> Am J Clin Pathol. 113 (3), 374-382 (2000).</li>
<li>Bircan, S., Candir, O., Kapucuoglu, N., Serel, T. A., Ciris, M., Karahan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD10+expression+in+urothelial+bladder+carcinomas%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Urol+Int%22%5BJournal%5D)">CD10 expression in urothelial bladder carcinomas: a pilot study.</a> Urol Int. 77 (2), 107-113 (2006).</li>
<li>Koiso, K., Akaza, H., Ohtani, M., Miyanaga, N., Aoyagi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+tumor+marker+for+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Urol%22%5BJournal%5D)">A new tumor marker for bladder cancer.</a> Int J Urol. 1 (1), 33-36 (1994).</li>
<li>Wick, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+vascular+leak+in+neprilysin+transgenic+mice+with+complex+overexpression+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Protection against vascular leak in neprilysin transgenic mice with complex overexpression pattern.</a> Transgenic Res. 25 (6), 773-784 (2016).</li>
<li>Natah, S. S., Srinivasan, S., Pittman, Q., Zhao, Z., Dunn, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+acute+hypoxia+and+hyperthermia+on+the+permeability+of+the+blood-brain+barrier+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of acute hypoxia and hyperthermia on the permeability of the blood-brain barrier in adult rats.</a> J Appl Physiol. 107 (4), (1985) 1348-1356 (2009).</li>
<li>Scholzen, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutral+endopeptidase+terminates+substance+P-induced+inflammation+in+allergic+contact+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutral endopeptidase terminates substance P-induced inflammation in allergic contact dermatitis.</a> J Immunol. 166 (2), 1285-1291 (2001).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Zoals hierboven is besproken, kan de studie van plasma extravasation uiteindelijk leiden tot nieuwe kennis over de oorzaken van of nieuwe manieren om te remmen of plasma extravasation behandelen. Het succesvolle gebruik van het plasma extravasation protocol (zie hierboven), is met behulp van Evans blauwe kleurstof, aangetoond in het huidige manuscript. Hoewel de gegevens getoond weer aan de hypothese dat NEP de therapieën kan beschermen tegen plasma extravasation, dit is een secundair doel op dit moment met het primaire ...

Vasculaire lek in de organen verwijst naar extravasation, of lekkage van bloedplasma via lacunes geproduceerd in het endotheel van post capillaire venules in de organen. Deze plasma extravasation of toegenomen vasculaire permeabiliteit, die uit een soort van een ontstekingsreactie voortvloeien kan, kan ernstige gevolgen hebben. Het is dus belangrijk dat dit fenomeen, de oorzaken modulatoren en gevolgen, zijn bestudeerd en begrepen, en ook dat onderzoekers goede hebben instrumenten en protocollen om te bestuderen. Het endotheel hiaten via een aantal stimuli kunnen worden geproduceerd, maar meestal worden geproduceerd door de actie van peptide neurotransmitters en/of tachykinins op de endothelia. Een van de grootste natuurlijk voorkomende bemiddelaars van dit proces, wat in verhoogde plasma extravasation resulteert, is de undecapeptide tachykinin neuropeptide substantie P1.
Methoden te onderzoeken en te meten vasculaire permeabiliteit of plasma extravasation, die de albumine-bindende eigenschap van Evans blauwe kleurstof gebruikt, zijn ontwikkeld, en zijn meestal bekend voor hun nauwkeurigheid, eenvoud, economie, veiligheid, en de mogelijkheid om de bepaling van plasma extravasation uit verschillende weefsels tegelijk, als zo gewenst2,3,4,5,6,7,8,9 . Dit protocol Evans blauw voor de beoordeling van de extravasation van het plasma in de organen van FVBN muizen gebruikt al deze, maar voegt enkele belangrijke wijzigingen waarmee u gemakkelijker in het algemeen nuttig en aanpasbaar voor toekomstige studies, waarbij de gemiddelde laboratorium dat voert of zal belangrijk onderzoek van factoren die samenhangen met plasma extravasation of vasculaire permeabiliteit verrichten. In dit protocol, is stof P ingevoerd om de muizen op 1 nmol/kg, die de extravasation van plasma door 1.5-fold verhoogt. Dit verhoogt de gevoeligheid van het protocol, wat resulteert in meer gemakkelijk waarneembare en verkregen resultaten. Andere factoren die van invloed zijn permeabiliteit, zoals verschillende andere peptiden, chemische stoffen of bepaalde vormen van giftige letsel, kunnen worden gebruikt of worden bestudeerd door andere laboratoria, zoals gewenst. Halsslagader injecties worden gebruikt in dit protocol te voeren Evans blauw en stof P systemisch, waarvoor terminal chirurgie. Halsslagader injecties5,7,10, zijn zelfs na bestudering van de nodige terminal chirurgische technieken, echter gemakkelijker te beheersen en leiden tot de productie van meer consistente resultaten dan andere veneuze injecties, met inbegrip van de staart ader injecties4,9. Hoewel het mogelijk voor Evans blauw worden geleverd door de retro-orbitaal veneuze sinus injecties, hebben geen verwijzingen in de literatuur gevonden die gebruik maken van deze methode van levering van Evans blauw. Echter wat staart ader injecties beperkt de hoge graad van expertise en praktijk te reproducibly beheersen deze techniek zeer het gebruik ervan voor succesvolle Evans blauwe injecties. In tegenstelling, biedt de alternatieve halsslagader injectie methode zoals beschreven in ons protocol, een technisch verkrijgbaar oplossing. Een cruciale procedure voor perfusie van de muis van de aderen, uitgevoerd net nadat het offer van de Evans blauw-geperfundeerd muis, verwijdert overtollige Evans blauwe kleurstof en is gestandaardiseerd in dit protocol. Eerder beschreven methoden van perfusie zijn zorgvuldig onderzocht en bewerkt met het oog op de huidige procedure. Andere wijzigingen die hier worden beschreven zijn al geoptimaliseerd, eenvoudig en goedkoop.
Er zijn enkele belangrijke beperkingen van de methode van de blauwe kleurstof Evans. Lage gevoeligheid soms geassocieerd met deze methode kan bijvoorbeeld voorkomen dat met sommige extra bruto pathologische en histologisch onderzoek van weefsels van Evans blauw-geïnjecteerd dieren. Deze en andere beperkingen hebben echter geleid tot de ontwikkeling van alternatieve methoden en modellen, die echter nog steeds gebruik maken van Evans blauw. De meting van Evans blauw door fluorescentie (in plaats van visual-bereik) spectroscopie kan het verhogen van de gevoeligheid van de methode. Bovendien, werd fluorescentie microscopie van Evans blauw gebeitste weefsels ontwikkeld als u wilt toestaan voor de waarneming van vasculaire lek in duidelijker locaties11. Ook hele lichaam imaging en scannen van een levend dier eerder ingespoten met Evans blauw12 voorziet in een onderzoek van Evans blauwe concentraties op een continue wijze, in plaats van op een specifieke tijd gekozen punt van het experiment. Echter, deze methode vereist de beschikbaarheid van adequate beeldvorming faciliteiten, en kan erg duur. Wijzigingen waarbij Evans blauwe en uitgevoerd in een in vitro soort model, zijn zoals in een cel cultuur of kuiken chorion model13 (CAM) ook beschreven. Deze modellen zijn gecontroleerd door fluorescentie en intravital14 microscopie, en toestaan dat de kwantificering van veranderingen van de vasculaire permeabiliteit na verloop van tijd, maar vragen over nauwkeurige modellering van in vivo voorwaarden kunnen verhogen en kunnen ook worden duur.
Zijn er andere methoden ontwikkeld om te bepalen en kwantificeren van vasculaire lekken of permeabiliteit, waarbij niet de administratie van Evans blauw. Deze methoden kunnen tewerkstellen een passende fluorescerende molecuul (zoals albumine of fluoresceïne), of een ionenpaar met een label of anderszins tagged molecule, tot levende dieren (of cel cultuur of chorion (CAM) modellen13, gevolgd door niet-invasieve Imaging (PET-scan, MRI, intravital microscopie, hele lichaam scannen) of door invasieve beeldvormende (fluorescent microscopie)3,12,15. Hoewel deze technieken een aantal voordelen ten opzichte van andere Evans blauwe methoden bieden kunnen, hebben ze ook nadelen, waaronder eventueel hun aanzienlijke complexiteit, vereiste expertise, middelen en hoge monetaire kosten.
Neprilysin16 (de peptidase enzym NEP, ook bekend als CD10, MME of Enkephalinase) heeft gesuggereerd betrokken te worden bij het remmen van plasma extravasation, ten minste gedeeltelijk, door de enzymatische metabolisme en inactivatie van endogene stof P. Dus, in weefsels waarin de cel-oppervlakte peptidase NEP plaatsvindt, kan er een verzwakking van het effect van stof P, vermoedelijk door de peptidase activiteit van NEP.
In eerste instantie, we getest voor stof P-geïnduceerde plasma extravasation met behulp van dit gewijzigde Evans blauw-protocol, met NEP knock-out (KO) muizen en FVBN wild type (WT). NEP betrokkenheid in plasma stof P-augmented extravasation werd verdacht van deze eerste studies, en we beschrijven deze en verdere experimenten waarbij NEP de rol in plasma extravasation. De focus van dit manuscript is niet NEP of haar rol in plasma extravasation, echter liever de plasma extravasation experimenten zelf. De NEP-resultaten zijn representatief voor de aard van de resultaten die kunnen worden verkregen door het gebruik van dit gewijzigde protocol. De blauwe Evans-methode voor het meten van plasma extravasation is geoptimaliseerd en gewijzigd, zoals beschreven in detail hieronder voor FVBN muizen.

<table><tbody><tr><td>isofluraan</td><td>Vet One</td><td>200-070</td><td>inhalatie anestheticum</td></tr><tr><td>ketamine</td><td>Vet One</td><td>200-055</td><td>injecteerbaar anestheticum</td></tr><tr><td>xylazine</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>139-236</td><td>injecteerbaar anestheticum</td></tr><tr><td>spuitjes (10,3 &amp; 1 cc)</td><td>Becton Dickinson</td><td>309604, 309657, 309659</td><td></td></tr><tr><td>naalden (20G1,23G1 &amp; 26G1/2)</td><td>Becton Dickinson</td><td>305178, 305193, 305111</td><td></td></tr><tr><td>isofluraan inductiekamer</td><td>VetEquip</td><td>941443</td><td>1 Liter</td></tr><tr><td>nosecone ademhalingscircuits&nbsp;</td><td>VetEquip</td><td>RC2</td><td>Rodent Circuit Controller 2</td></tr><tr><td>zuurstoftank</td><td>Airgas</td><td>UN 1072</td><td>100% medisch</td></tr><tr><td>verwarmingspad</td><td>CWE Inc.</td><td>TC-1000</td><td>temperatuurregelaar</td></tr><tr><td>rectale temperatuur sonde</td><td>CWE Inc.</td><td>10-09012</td><td>muis</td></tr><tr><td>weegschaal (voor knaagdieren)</td><td>Ohaus</td><td>CS 2000</td><td></td></tr><tr><td>chirurgische instrumenten - schaar</td><td>Fine Science tools</td><td>15000-00</td><td>Vannas Spring schaar 3mm rechte kling (vaatjes snijden)&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>chirurgische instrumenten - pincetten</td><td>Fine Science tools</td><td>11151-10</td><td>Graefe extra fijne pincetten (isolatie muis vaatjes)</td></tr><tr><td>chirurgische instrumenten - hemostatis</td><td>Fine Science tools</td><td>13009-12</td><td>Halstead-mosquito hemostatis (blunt dissect, houd weefsel vast)</td></tr><tr><td>chirurgische instrumenten -naaldvoerders</td><td>Fine Science tools</td><td>12502-12</td><td>Olsen-Hegar naaldvoerders (naaien)</td></tr><tr><td>chirurgische instrumenten - pincetten</td><td>Fine Science tools</td><td>11627-12</td><td>Adson-Brown alligator pincetten (weefsel grijpen, naaien, rat)</td></tr><tr><td>chirurgische instrumenten - schaar</td><td>Fine Science tools</td><td>14110-15</td><td>Mayo zwaar snijdende schaar 15 cm (chirurgie, dissectie, botten, rat)</td></tr><tr><td>chirurgische instrumenten - pincetten</td><td>Fine Science tools</td><td>18025-10</td><td>naald binden pincetten (gebruikt voor Millar cath)</td></tr><tr><td>chirurgische instrumenten - schaar</td><td>Fine Science tools</td><td>14078-10</td><td>Lexer Baby schaar recht (chirurgie, muis)</td></tr><tr><td>chirurgische instrumenten - pincetten</td><td>Fine Science tools</td><td>11254-20</td><td>Dumont #5 fijne punt pincetten (rat vaatjes, dissectie)</td></tr><tr><td>chirurgische instrumenten - schaar</td><td>Fine Science tools</td><td>14082-09</td><td>Dissector schaar 12 mm (chirurgie, rat muis)</td></tr><tr><td>chirurgische instrumenten - pincetten</td><td>Fine Science tools</td><td>11051-10</td><td>10 cm Graefe pincetten (weefsel grijpen, rat muis)</td></tr><tr><td>chirurgische instrumenten - pincetten</td><td>Fine Science tools</td><td>11251-35</td><td>Dumont 5/45 pincetten (introducer voor vaatjes)</td></tr><tr><td>chirurgische instrumenten - retractoren</td><td>Fine Science tools</td><td>17012-11</td><td>Weitlaner retractoren 2/3 tand (chirurgische rat)</td></tr><tr><td>chirurgische instrumenten - pincetten</td><td>Fine Science tools</td><td>11294-00</td><td>Dumont #4 pincetten (vaatje isolatie ratten, muizen)</td></tr><tr><td>chirurgische instrumenten - pincetten</td><td>Fine Science tools</td><td>11297-00</td><td>Dumont #7 pincetten (weefsel grijpen, dissectie)</td></tr><tr><td>chirurgische instrumenten - schaar</td><td>Fine Science tools</td><td>14058-11</td><td>zwaar snijdende iris schaar (muis dissectie, botten)</td></tr><tr><td>chirurgische instrumenten - pincetten</td><td>Fine Science tools</td><td>11009-13</td><td>gekartelde, gebogen Semken pincetten (weefsel grijpen, muis rat)</td></tr><tr><td>chirurgische instrumenten - hemostatis</td><td>Fine Science tools</td><td>13003-10</td><td>Hartman gebogen hemostatis (blunt dissect, houd weefsel vast)</td></tr><tr><td>chirurgische instrumenten - pincetten</td><td>Fine Science tools</td><td>11006-12</td><td>Adson gekartelde pincetten (weefsel grijpen)</td></tr><tr><td>haarknipscharen</td><td>Oster</td><td>A5</td><td></td></tr><tr><td>tape</td><td>Fisherbrand</td><td>159015G</td><td></td></tr><tr><td>kunstmatige traanoogdruppels</td><td>Akorn Inc</td><td>13985-600-03</td><td></td></tr><tr><td>lidocaïne</td><td>Hospira</td><td>0409-4277-01</td><td>2% injecteerbaar</td></tr><tr><td>polyvinyl katheters</td><td>Tygon</td><td>PV-1</td><td></td></tr><tr><td>Evans blauw</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Substantie P</td><td>Bachem&nbsp;</td><td>H-1890</td><td></td></tr><tr><td>heparine</td><td>Sagent Pharmaceuticals</td><td>25201-400-10</td><td>1000 U/ml</td></tr><tr><td>zoutoplossing</td><td>Hospira</td><td>0409-7138-09</td><td>0.9% natriumchloride</td></tr><tr><td>phenobarbital&nbsp;</td><td>Vortech</td><td>0298-9373-68</td><td></td></tr><tr><td>natriumcitraat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP327-1</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417-50TAB&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes voor blotting</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>formamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47670</td><td></td></tr><tr><td>microbalance</td><td>Denver Instrument</td><td>APX-60</td><td></td></tr><tr><td>microfuge buisjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-534</td><td></td></tr><tr><td>polystyreen 96 well plaat</td><td>Becton Dickenson</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>absorbance plaat lezer</td><td>BioTek</td><td>Synergy 2</td><td></td></tr><tr><td>polyacrylamide gels</td><td>Bio-Rad</td><td>3450014&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>eiwit moleculair gewicht standaard</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Protran ondersteunde nitrocellulose</td><td>Amersham (GE)</td><td>10600015</td><td></td></tr><tr><td>gel box</td><td>Bio-Rad</td><td>1658005</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P-1379</td><td></td></tr><tr><td>natriumchloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>primaire NEP polyklonale antistof&nbsp;</td><td>R &amp; D Systems</td><td>AF1182</td><td></td></tr><tr><td>doxycycline voer</td><td>Teklad (HARLAN)</td><td>TD.13

een geoptimaliseerde evans blue protocol bij het beoordelen van vasculaire lek in de muis

An Optimized Evans Blue Protocol to Assess Vascular Leak in the Mouse

Vasculaire lek, of plasma extravasation, kan heeft een aantal oorzaken, en een ernstig gevolg of symptoom van een ontstekingsreactie. Deze studie kan uiteindelijk leiden tot nieuwe kennis over de oorzaken van of nieuwe manieren om te remmen of plasma extravasation behandelen. Het is belangrijk dat onderzoekers de juiste hulpmiddelen hebben, met inbegrip van de beste methoden beschikbaar, voor de studie van plasma extravasation. In dit artikel beschrijven we een protocol, met behulp van de methode van de blauwe kleurstof Evans, voor de beoordeling van de extravasation van het plasma in de organen van FVBN muizen. Dit protocol is opzettelijk eenvoudig, als groot een diploma als mogelijk, maar biedt hoogwaardige gegevens. Evans blauwe kleurstof heeft uitgekozen, vooral omdat het is gemakkelijk voor de gemiddelde laboratorium te gebruiken. We hebben dit protocol gebruikt om te bewijs en ondersteuning bieden aan de hypothese dat het enzym neprilysin de therapieën tegen plasma extravasation kan beschermen. Echter kan dit protocol worden experimenteel gebruikt en gemakkelijk aangepast voor gebruik in andere muizenstammen of in andere soorten, in vele verschillende organen of weefsels, voor studies die andere factoren die belangrijk zijn bij het begrijpen, te voorkomen of te behandelen kunnen meebrengen Plasma extravasation. Dit protocol is uitgebreid geoptimaliseerd en aangepast ten opzichte van de bestaande protocollen en combineert betrouwbaarheid, gebruiksgemak, economie, en algemene beschikbaarheid van materialen en uitrusting, waardoor dit protocol superieur voor de gemiddelde laboratorium in te gebruiken kwantificeren van plasma extravasation van organen.

In Figuur 1, wordt een schema van de procedure weergegeven, die leiden tot de meest betrouwbare en consistente stof P-geïnduceerde plasma extravasation waarden uit organen van FVBN muizen is gebleken. Deze procedure duurt meestal twee dagen werk, gescheiden door ten minste 48 uur wachttijd. Het is mogelijk om het te verspreiden zelfs meer, als dit gebeurt consequent voor alle experimenten worden vergeleken. Bijvoorbeeld, nadat de organen zijn geïsoleerd op da...

In dit artikel, is een zuinige, geoptimaliseerde en eenvoudig protocol beschreven die de Evans blauwe kleurstof methode gebruikt voor het beoordelen van de extravasation van het plasma in de organen van FVBN muizen die aangepast voor gebruik in andere stammen, soorten, en andere organen of weefsels worden kunnen.

Een geoptimaliseerde Evans Blue Protocol bij het beoordelen van vasculaire lek in de muis

Vascular leak, or plasma extravasation, has a number of causes, and may be a serious consequence or symptom of an inflammatory response. This study may ...

Het algemene doel van dit protocol is om plasma-extravasatie of lekkage in de organen van muizen of andere kleine diersoorten te beoordelen en relatief te kwantificeren met behulp van een gewijzigde Evans Blue Dye-methode. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het vasculaire veld, zoals welke endogene of exogene factoren plasma-extravasatie in een specifieke soort of orgaan van belang wijzigen? Het grote voordeel van deze techniek is dat, hoewel katheterisatie een bescheiden graad van chirurgische competentie vereist, de methode duurzame veneuze toegang biedt en reproduceerbaar is van muis tot muis.Over het algemeen kunnen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen vanwege de bescheiden chirurgische moeilijkheid van de katheterplaatsing. Na het wegen van een 16 tot 20 weken oude volwassen FVB NJ-muis, bevestigt u een gebrek aan reactie op teenprik en scheert u het ventrale nekgebied van het dier. Plaats de muis in de rugligging op een voorverwarmde pad en plak alle vier poten op het chirurgische oppervlak.Breng zalf aan op de ogen van het dier om uitdroging te voorkomen. Maak een snede van één centimeter in de rechter ventrale nek boven de

an-optimized-evans-blue-protocol-to-assess-vascular-leak-in-the-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

This video demonstrates ommaya mediated intracerebroventricular injection in a mouse model. The method enables localized delivery of potential drug candidates and evades the blood-brain barrier.

Intracerebroventricular Injection in Mouse: An Ommaya Mediated Direct Drug Administration Method to Deliver Drugs to Cerebral Ventricles of Mouse Brain

Een<em&gt; In vivo</em&gt; Assay naar Blood Vessel Permeabiliteit Test

Allergische reacties, gekenmerkt door de activering van mestcellen en basofielen, worden door de verknoping van IgE en het vrijkomen van pro-inflammatoire mediatoren. Een kwantitatieve beoordeling van allergische reacties kunnen worden bereikt door Evans Blue kleurstof veranderingen in vasculaire permeabiliteit na provocatie met allergeen controleren.

Meten Lokaal Anafylaxie in Muizen

Om de permeabiliteit van de bloed-retinabarrière en de integriteit van de binnenste begrenzingsmembraan in diermodellen van retinale aandoeningen te onderzoeken, hebben we verschillende adeno-geassocieerde virus (AAV) varianten gebruikt als hulpmiddelen om retinale neuronen en gliacellen te labelen. Virusgemedieerde reportergenexpressie wordt vervolgens gebruikt als een indicator van de permeabiliteit van de retinabarrière.

Met behulp van adeno-geassocieerd virus als een instrument om retinale Barrières in ziekte te bestuderen

Dit protocol beschrijft de inductie van een ischemie-reperfusie (IR) model op de muis oor huid met behulp van magneet klemmen. Met behulp van een custom-built intravitale imaging model, bestuderen we in vivo ontstekingsreacties post-reperfusie. De reden voor de ontwikkeling van deze techniek is om te begrijpen hoe leukocyten reageren op huid IR schade verlengen.

Induceren van ischemie-reperfusie schade in de Mouse Ear Skin voor intravitale Multiphoton Imaging van immuunresponsen

Het algemene doel van deze procedure is bedoeld als een zeer reproduceerbaar techniek voor in vivo beoordeling van de verstoring van de bloed - hersen barrière in rat modellen van ischemische beroerte.

In Vivo eenbeoordeling van de verstoring van de bloed - hersen barrière in een Rat Model van ischemische beroerte

Hier presenteren we een protocol voor het meten van de vasculaire lekkage geïnduceerd door intradermale toediening van permeabiliteit bevordering van agenten in de lymfkliertest huid. Deze techniek kan worden gebruikt om de mogelijkheid van moleculen te bevorderen of belemmeren van vasculaire lekkage of te bestuderen van de moleculaire mechanismen die vasculaire permeabiliteit regelen bepalen.

Beoordelende vasculaire Hyperpermeability-inducerende stoffen in de huid met de Miles-test

Dit protocol beschrijft een nieuwe techniek om de drie belangrijkste parameters van ischemisch hersenletsel te meten op dezelfde set knaagdierhersenmonsters. Het gebruik van slechts één hersenmonster is zeer voordelig in termen van ethische en economische kosten.

Het meten van post-beroerte cerebraal oedeem, infarctzone en bloed-hersenbarrière-afbraak in een enkele set knaagdierhersenmonsters

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol voor retinale ader occlusie met behulp van rose bengal en een lasergeleid retinaal beeldvormingscoopsysteem met aanbevelingen om de reproduceerbaarheid ervan in genetisch gemodificeerde stammen te maximaliseren.

Optimalisatie van het Retinal Vein Occlusion Mouse Model om variabiliteit te beperken

Er wordt een protocol gepresenteerd om te evalueren of kleine EV's (sEV's) geïsoleerd uit placenta-explantaten gekweekt onder hypoxische omstandigheden (modellering van één aspect van pre-eclampsie) de bloed-hersenbarrière verstoren bij niet-zwangere volwassen vrouwelijke muizen.

Verstoring van de bloed-hersenbarrière van muizen door kleine extracellulaire blaasjes van hypoxische menselijke placenta's

Er is een methode ontwikkeld om kleurstofextravasatie als gevolg van afbraak van de bloed-hersenbarrière (BBB) te visualiseren door twee fluorescerende kleurstoffen op verschillende tijdstippen aan muizen toe te dienen. Het gebruik van glycerol als cryoprotectant vergemakkelijkte immunohistochemie op hetzelfde monster.

Evaluatie van de afbraak van de bloed-hersenbarrière in een muismodel van licht traumatisch hersenletsel

Leer een geoptimaliseerd Evans Blue-protocol om vasculair lek in muizen te beoordelen met behulp van katheterisatie en kwantitatieve extractie. Deze methode biedt betrouwbare toegang voor vasculair onderzoek.

Een geoptimaliseerde Evans Blue Protocol bij het beoordelen van vasculaire lek in de muis

Meer video's verkennen