Kinetische analyse van vasculogenese kwantificeert dynamiek van Vasculogenese en angiogenese In Vitro
January 31st, 2018
Hier presenteren we een protocol voor time-lapse beeldvorming en analyse van het vasculogenese in vitro gebruik van fase contrast microscopie in combinatie met de open source-software, kinetische analyse van vasculogenese. Dit protocol kan worden toegepast om het kwantitatief het beoordelen van het potentieel van de vasculogenic van vele celtypes of experimentele omstandigheden dat model vasculaire ziekte.
Het algemene doel van deze experimentele methode is om het dynamische proces van vasculogenese in de loop van de tijd te visualiseren en te kwantificeren. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden in de velden van angiogenese en vasculogenese over de snelheden van vaatvorming en de verschillen tussen gevormde netwerkstructurele patronen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de kwantificering van grote aantallen vasculogenese-tijdstippen mogelijk maakt, wat een kans biedt om de kinetiek van het vasculogenetische proces te beoordelen.
Deze methode kan worden toegepast op elke celpopulatie of pathologische toestand die de processen van vasculogenese of angiogenese beïnvloedt voor de studie van individuele celpopulaties of co-cultuursystemen. Ongeveer een tot twee uur voor het begin van het experiment, verwarm een Microscope Stage Top Incubator tot 37 graden Celsius en stel de koolstofdioxide op 5% en de luchtvochtigheid op 85%. Vul de luchtvochtigheidsreservoir van de incubator als deze leeg is. Plaats de live-celkamer op de microscoop en plaats vervolgens een lege kamerslide in een van de twee open posities binnen de live-celkamer.
Vul de slide met gedestilleerd water en stel een secundaire ventilator in op 39 tot 42 graden Celsius om de slides van onderen te verwarmen en condens te minimaliseren. Het handhaven van de juiste temperatuur en luchtvochtigheid binnen de live-celbeeldvormingskamer is cruciaal voor het succes van het experiment. Voeg een tweede slide toe als blanco tot de experimentele slide kan worden toegevoegd.
Voeg vervolgens water toe aan de reservoirs rond de putjes op de tweede slide om de omstandigheden tijdens het beeldvormingsexperiment na te bootsen. Om de experimentele kamerslide te laden met basement membraan matrix, laad eerst een 20 microliter pipette met een koude 20 microliter pipettetip en gebruik schaar om ongeveer een centimeter van het uiteinde van de tip af te snijden. Stel het pipettevolume in op iets meer dan 10 microliters en zuig langzaam de matrix in de aangepaste pipettetip op. Plaats de pipettetip onmiddellijk in het midden van een putje, raak de tip voorzichtig aan de bodem van het putje en druk langzaam op de plunjer om de matrix naar buiten te duwen. Nadat matrix aan alle 15 putjes is toegevoegd, duw het deksel helemaal op de slide. Nauwkeurig en consistent pipetteren van de Matrigel volumes in elk putje is cruciaal voor het verkrijgen van hoogwaardige fasecontrastbeelden.
Plaats vervolgens de slide gedurende 30 tot 60 minuten op 37 graden Celsius naast een 50 milliliter conische buisdop gevuld met twee tot drie milliliters PBS om matrixuitdroging te verminderen. Wanneer de matrix is gestold, verwijdert u de supernatant van een overnacht gekweekte endotheelcolonievormende celcultuur en was de cellen met zeven milliliters PBS. Zuig de PBS-was af en los de cellen op met twee tot drie milliliters Trypsine op 37 graden Celsius gedurende twee tot vijf minuten.
Resuspendeer vervolgens de gedissocieerde cellen in drie milliliters Endotheel Groei Medium-2 om eventuele celklonten te breken en breng de resulterende celsuspensie over in een 15 milliliter conische buis. Nadat alle endotheelcolonievormende celmonsters zijn gesuspendeerd, peletteer de cellen door centrifugatie en resuspendeer de pellet in een tot twee milliliters vers Endotheel Groei Medium. Tel het aantal levensvatbare cellen in elk monster en voeg voldoende endotheelcolonievormende cellen toe aan een nieuwe 1,5 milliliter buis om de cellen te verdunnen tot een concentratie van 1,4 maal 10 tot de vierde cellen per 175 microliters medium.
Meng vervolgens elke mastermix voorzichtig door pipetteren. Verwijder het slidedeksel en giet 50 microliters van elke mastermix per putje in drievoudig op de slide. Om de cellen te beeldvormen, vervang de lege slide door een experimentele slide en voeg water toe aan de reservoirs rond de cellen op de slide.
Loop door elk stagestandaard en bevestig dat het midden van de eerste put is geselecteerd. Focus op de in het putje geplateerde cellen en stel de Z-positie van de stage in. Wanneer de instellingen nauwkeurig zijn, doe de lichten uit om het beeldvormingsexperiment te beginnen.
Wanneer de beeldvorming is voltooid, schaal en exporteer beeldstapelbestanden binnen de Image Capture software, waarbij de beelden worden opgeslagen als TIFF-bestanden voor analyse. Om de beelden te analyseren, sleep het Kinetic Analysis of Vasculogenesis bestand vanuit de map naar de grijze balk onderaan het softwarevenster om de software te openen en klik op Opslaan om de software aan de lijst toe te voegen. Klik op Bestand en Open om het te openen beeldbestand te selecteren, of sleep het beeldbestand naar de grijze balk in de software.
Klik op Afbeelding, Pas aan en Helderheid/Contrast om het Helderheid/Contrast venster te openen. Klik op Reset binnen het Helderheid/Contrast venster om het beeld te visualiseren. Klik vervolgens op Afbeelding, Type en 8-bits om de beelden om te zetten naar 8-bits.
Selecteer Gereedschap en Regiobelangstelling Manager en gebruik een passend gevormde selectietool om een nieuwe regio van interesse te maken. Klik op Toevoegen om de regio van interessevorm toe te voegen aan het Regiobelangstelling Manager venster en klik op de Regio van Interesse label in de Regiobelangstelling Manager om de regio op het beeld te bekijken. Pas de regio van interesse aan zo nodig aan.
Wanneer de regio op zijn plaats staat, klik op Afbeelding en vervolgens op Bijsnijden om het beeld bij te snijden. Open vervolgens het Bewerk menu en selecteer Alles buiten verwijderen om de beeldgegevens buiten de regio van interesse voor elke afbeelding in de stapel te verwijderen. Open vervolgens het Plugins menu en selecteer de Analyse Netwerk plugin.
Gebruik de vervolgkeuzepijl in het pop-upvenster om de Drempelwaarde Methode te wijzigen en klik op OK om de softwareverwerking te starten. Aan het einde van de analyse worden een datatabel en een stapel gefuseerde beelden met Skeleton en Masker weergaven geopend. Klik op Bestand en Sla als om de numerieke waarden over te brengen naar een spreadsheet en sla de spreadsheet met de ruwe datawaarden op.
Klik op de gefuseerde Skeleton en Masker afbeelding en sla de gefuseerde Skeleton Masker beelda Stapel en de bijgesneden fasecontrast afbeeldings Stapel op als TIFF-bestanden. Klik vervolgens op het Regiobelang
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor time-lapse beeldvorming en analyse van vasculogenese in vitro met behulp van fasecontrastmicroscopie en Kinetic Analysis of Vasculogenesis software. De methode maakt kwantitatieve beoordeling mogelijk van het vasculogenetische potentieel van verschillende celtypen en experimentele omstandigheden met betrekking tot vasculaire ziekten.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Vasculogenese
- Angiogenese
- Celcultuurtechnieken
Achtergrond
- Het begrijpen van vasculogenese is cruciaal voor inzichten in vasculaire ziekten.
- Time-lapse beeldvorming biedt dynamische visualisatie van vaatvorming.
- De methode kan worden toegepast op verschillende celpopulaties en omstandigheden.
- Kwantitatieve analyse verbetert het begrip van de vorming van vasculaire netwerken.
Doel van het onderzoek
- Om het proces van vasculogenese in de tijd te visualiseren en kwantificeren.
- Om de kinetica van vaatvorming in verschillende experimentele setups te beoordelen.
- Om structurele patronen van gevormde vasculaire netwerken te verkennen.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van een live-cel beeldvormingskamer met gecontroleerde temperatuur en vochtigheid.
- Gebruik van Matrigel voor het creëren van een matrix voor celcultuur.
- Time-lapse beeldvorming van endotheelkolonievormende cellen.
- Analyse van beelden met behulp van Kinetic Analysis of Vasculogenesis software.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van vasculogenetische processen in de tijd.
- Kwantitatieve gegevens over vaatvormingssnelheden en structurele patronen.
- Identificatie van verschillen in vasculogenetisch potentieel tussen celtypen.
- Generatie van datatabellen en gefuseerde beelden voor verdere analyse.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van vasculogenese.
- Kwantitatieve analyse kan leiden tot een beter begrip van vasculaire ziekten.
- Deze methode kan worden aangepast voor verschillende experimentele omstandigheden en celtypen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Quantifying the kinetics of vasculogenesis provides a predictive readout for endothelial progenitor cell functionality, enabling mechanistic de-risking in vascular disease models. This approach supports target validation by linking network formation dynamics to pathophysiological conditions such as maternal diabetes. The method enhances assay development for branching processes, improving translational continuity from discovery to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by measuring rates of network formation and stabilization in endothelial progenitor cells.
- Operational Value: Enables biological de-risking through quantitative comparison of vasculogenic potential across disease states.
- Scientific Value: Supports predictive confidence by identifying altered kinetics in diabetic-exposed fetal ECFCs versus controls.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows via standardized basement membrane matrix plating and time-lapse imaging.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through automated segmentation and skeletonization of network structures.
- Scientific Value: Highlights screening readiness by generating ten quantitative parameters (nine measured, one calculated) for network analysis.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by applying the protocol to fetal ECFCs from pregnancies complicated by diabetes mellitus.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling longitudinal assessment of vasculogenic dynamics.
- Scientific Value: Focuses on predictive de-risking value by identifying biphasic network formation patterns and altered maximal network achievement in disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification by providing dynamic, quantitative readouts of vasculogenesis that inform mechanistic and phenotypic assessments.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, and biological de-risking via kinetic analysis of network formation over 15 hours.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, and quantitative outputs through time-lapse phase contrast imaging and KAV-derived parameters such as closed networks, total branch length, and branch-to-node ratio.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, and statistical outputs that enable comparison of network structures across conditions and time points.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by demonstrating altered vasculogenesis in diabetic-exposed ECFCs, supporting risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for assessing vasculogenesis and other branching processes in diverse cell types and disease states.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in vascular network formation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of vasculogenesis assessment across multi-well formats and time-lapse experiments.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early detection of dysfunctional vasculogenic phenotypes.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative network formation kinetics and structural parameters.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in cell culture, live-cell imaging, and image analysis software operation.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including phase contrast microscopy, temperature/humidity-controlled live-cell chamber, and Kinetic Analysis of Vasculogenesis software.
- Cross-team standardization requirements for matrix plating, cell seeding density, and thresholding method selection (e.g., Mean or Otsu) to ensure consistent network detection.
- Adaptation considerations across model systems, including varying endothelial progenitor cell sources and extracellular matrix compositions.
- Practical limitations supported by source material: network detection accuracy is reduced under low image contrast or imaging artifacts such as gridding, necessitating quality control of phase contrast images.
