Kinetische analyse van vasculogenese kwantificeert dynamiek van Vasculogenese en angiogenese In Vitro
31 januari 2018
Hier presenteren we een protocol voor time-lapse beeldvorming en analyse van het vasculogenese in vitro gebruik van fase contrast microscopie in combinatie met de open source-software, kinetische analyse van vasculogenese. Dit protocol kan worden toegepast om het kwantitatief het beoordelen van het potentieel van de vasculogenic van vele celtypes of experimentele omstandigheden dat model vasculaire ziekte.
Het algemene doel van deze experimentele methode is om het dynamische proces van vasculogenese in de loop van de tijd te visualiseren en te kwantificeren. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen te beantwoorden in de velden van angiogenese en vasculogenese over de snelheden van vaatvorming en de verschillen tussen gevormde netwerkstructurele patronen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de kwantificering van grote aantallen vasculogenese-tijdstippen mogelijk maakt, wat een kans biedt om de kinetiek van het vasculogenetische proces te beoordelen.
Deze methode kan worden toegepast op elke celpopulatie of pathologische toestand die de processen van vasculogenese of angiogenese beïnvloedt voor de studie van individuele celpopulaties of co-cultuursystemen. Ongeveer een tot twee uur voor het begin van het experiment, verwarm een Microscope Stage Top Incubator tot 37 graden Celsius en stel de koolstofdioxide op 5% en de luchtvochtigheid op 85%. Vul de luchtvochtigheidsreservoir van de incubator als deze leeg is. Plaats de live-celkamer op de microscoop en plaats vervolgens een lege kamerslide in een van de twee open posities binnen de live-celkamer.
Vul de slide met gedestilleerd water en stel een secundaire ventilator in op 39 tot 42 graden Celsius om de slides van onderen te verwarmen en condens te minimaliseren. Het handhaven van de juiste temperatuur en luchtvochtigheid binnen de live-celbeeldvormingskamer is cruciaal voor het succes van het experiment. Voeg een tweede slide toe als blanco tot de experimentele slide kan worden toegevoegd.
Voeg vervolgens water toe aan de reservoirs rond de putjes op de tweede slide om de omstandigheden tijdens het beeldvormingsexperiment na te bootsen. Om de experimentele kamerslide te laden met basement membraan matrix, laad eerst een 20 microliter pipette met een koude 20 microliter pipettetip en gebruik schaar om ongeveer een centimeter van het uiteinde van de tip af te snijden. Stel het pipettevolume in op iets meer dan 10 microliters en zuig langzaam de matrix in de aangepaste pipettetip op. Plaats de pipettetip onmiddellijk in het midden van een putje, raak de tip voorzichtig aan de bodem van het putje en druk langzaam op de plunjer om de matrix naar buiten te duwen. Nadat matrix aan alle 15 putjes is toegevoegd, duw het deksel helemaal op de slide. Nauwkeurig en consistent pipetteren van de Matrigel volumes in elk putje is cruciaal voor het verkrijgen van hoogwaardige fasecontrastbeelden.
Plaats vervolgens de slide gedurende 30 tot 60 minuten op 37 graden Celsius naast een 50 milliliter conische buisdop gevuld met twee tot drie milliliters PBS om matrixuitdroging te verminderen. Wanneer de matrix is gestold, verwijdert u de supernatant van een overnacht gekweekte endotheelcolonievormende celcultuur en was de cellen met zeven milliliters PBS. Zuig de PBS-was af en los de cellen op met twee tot drie milliliters Trypsine op 37 graden Celsius gedurende twee tot vijf minuten.
Resuspendeer vervolgens de gedissocieerde cellen in drie milliliters Endotheel Groei Medium-2 om eventuele celklonten te breken en breng de resulterende celsuspensie over in een 15 milliliter conische buis. Nadat alle endotheelcolonievormende celmonsters zijn gesuspendeerd, peletteer de cellen door centrifugatie en resuspendeer de pellet in een tot twee milliliters vers Endotheel Groei Medium. Tel het aantal levensvatbare cellen in elk monster en voeg voldoende endotheelcolonievormende cellen toe aan een nieuwe 1,5 milliliter buis om de cellen te verdunnen tot een concentratie van 1,4 maal 10 tot de vierde cellen per 175 microliters medium.
Meng vervolgens elke mastermix voorzichtig door pipetteren. Verwijder het slidedeksel en giet 50 microliters van elke mastermix per putje in drievoudig op de slide. Om de cellen te beeldvormen, vervang de lege slide door een experimentele slide en voeg water toe aan de reservoirs rond de cellen op de slide.
Loop door elk stagestandaard en bevestig dat het midden van de eerste put is geselecteerd. Focus op de in het putje geplateerde cellen en stel de Z-positie van de stage in. Wanneer de instellingen nauwkeurig zijn, doe de lichten uit om het beeldvormingsexperiment te beginnen.
Wanneer de beeldvorming is voltooid, schaal en exporteer beeldstapelbestanden binnen de Image Capture software, waarbij de beelden worden opgeslagen als TIFF-bestanden voor analyse. Om de beelden te analyseren, sleep het Kinetic Analysis of Vasculogenesis bestand vanuit de map naar de grijze balk onderaan het softwarevenster om de software te openen en klik op Opslaan om de software aan de lijst toe te voegen. Klik op Bestand en Open om het te openen beeldbestand te selecteren, of sleep het beeldbestand naar de grijze balk in de software.
Klik op Afbeelding, Pas aan en Helderheid/Contrast om het Helderheid/Contrast venster te openen. Klik op Reset binnen het Helderheid/Contrast venster om het beeld te visualiseren. Klik vervolgens op Afbeelding, Type en 8-bits om de beelden om te zetten naar 8-bits.
Selecteer Gereedschap en Regiobelangstelling Manager en gebruik een passend gevormde selectietool om een nieuwe regio van interesse te maken. Klik op Toevoegen om de regio van interessevorm toe te voegen aan het Regiobelangstelling Manager venster en klik op de Regio van Interesse label in de Regiobelangstelling Manager om de regio op het beeld te bekijken. Pas de regio van interesse aan zo nodig aan.
Wanneer de regio op zijn plaats staat, klik op Afbeelding en vervolgens op Bijsnijden om het beeld bij te snijden. Open vervolgens het Bewerk menu en selecteer Alles buiten verwijderen om de beeldgegevens buiten de regio van interesse voor elke afbeelding in de stapel te verwijderen. Open vervolgens het Plugins menu en selecteer de Analyse Netwerk plugin.
Gebruik de vervolgkeuzepijl in het pop-upvenster om de Drempelwaarde Methode te wijzigen en klik op OK om de softwareverwerking te starten. Aan het einde van de analyse worden een datatabel en een stapel gefuseerde beelden met Skeleton en Masker weergaven geopend. Klik op Bestand en Sla als om de numerieke waarden over te brengen naar een spreadsheet en sla de spreadsheet met de ruwe datawaarden op.
Klik op de gefuseerde Skeleton en Masker afbeelding en sla de gefuseerde Skeleton Masker beelda Stapel en de bijgesneden fasecontrast afbeeldings Stapel op als TIFF-bestanden. Klik vervolgens op het Regiobelang
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor time-lapse imaging en analyse van in vitro vasculogenese met behulp van fasecontrastmicroscopie en de software Kinetic Analysis of Vasculogenesis. De methode maakt een kwantitatieve beoordeling mogelijk van het vasculogene potentieel van verschillende celtypen en experimentele condities in relatie tot vaatziekten.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Vasculogenese
- Angiogenese
- Celkweektechnieken
Achtergrond
- Inzicht in vasculogenese is essentieel voor het begrijpen van vaatziekten.
- Time-lapse imaging biedt een dynamische visualisatie van de vaatvorming.
- De methode kan worden toegepast op diverse celpopulaties en condities.
- Kwantitatieve analyse vergroot het begrip van de vorming van vasculaire netwerken.
Doel van de studie
- Om het proces van vasculogenese in de loop van de tijd te visualiseren en te kwantificeren.
- Om de kinetiek van vaatvorming in verschillende experimentele opstellingen te beoordelen.
- Om structurele patronen van gevormde vasculaire netwerken te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van een live-cell imagingkamer met gecontroleerde temperatuur en vochtigheid.
- Gebruik van Matrigel voor het creëren van een matrix voor celkweek.
- Time-lapse imaging van endotheliale colony-forming cellen.
- Analyse van beelden met behulp van Kinetic Analysis of Vasculogenesis software.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van vasculogene processen gedurende een bepaalde tijd.
- Kwantitatieve gegevens over de snelheid van vaatvorming en structurele patronen.
- Identificatie van verschillen in vasculogeen potentieel tussen verschillende celtypen.
- Genereren van datatabellen en gefuseerde beelden voor verdere analyse.
Conclusies
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor het bestuderen van vasculogenese.
- Kwantitatieve analyse kan leiden tot een beter begrip van vasculaire aandoeningen.
- Deze methode kan worden aangepast voor diverse experimentele condities en celtypen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Executieve Functies
Het kwantificeren van de kinetiek van vasculogenese biedt een voorspellende maatstaf voor de functionaliteit van endotheliale progenitorcellen, wat mechanistische risicoreductie mogelijk maakt in modellen voor vaatziekten. Deze benadering ondersteunt targetvalidatie door de dynamiek van netwerkvorming te koppelen aan pathofysiologische aandoeningen, zoals materne diabetes. De methode optimaliseert de assayontwikkeling voor vertakkingsprocessen, waardoor de translationele continuïteit van ontdekking naar preklinische evaluatie wordt verbeterd.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door de snelheden van netwerkvorming en stabilisatie in endotheliale progenitorcellen te meten.
- Operationele waarde: Maakt biologische risicoreductie mogelijk door een kwantitatieve vergelijking van het vasculogene potentieel over verschillende ziektestadia.
- Wetenschappelijke waarde: Ondersteunt de voorspellende betrouwbaarheid door het identificeren van gewijzigde kinetiek in foetale ECFC's blootgesteld aan diabetes vergeleken met controles.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream workflows via gestandaardiseerde plating op basaalmembraanmatrix en time-lapse imaging.
- Operationele waarde: Pakt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid aan door geautomatiseerde segmentatie en skeletonisatie van netwerkstructuren.
- Wetenschappelijke waarde: Benadrukt de geschiktheid voor screening door het genereren van tien kwantitatieve parameters (negen gemeten, één berekend) voor netwerkanalyse.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Bespreekt de relevantie voor ziekten door het protocol toe te passen op foetale ECFC's uit zwangerschappen gecompliceerd door diabetes mellitus.
- Operationele waarde: Beschrijft de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door longitudinale beoordeling van vasculogene dynamiek mogelijk te maken.
- Wetenschappelijke waarde: Richt zich op de voorspellende waarde voor risicovermindering door het identificeren van bifasische netwerkvormingspatronen en een gewijzigde maximale netwerkbereik in ziektemodellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van hypotheseonderzoek tot lead-identificatie, door dynamische, kwantitatieve read-outs van vasculogenese te bieden die mechanistische en fenotypische beoordelingen informeren.
- Discovery Biology: Legt uit hoe de methode hypothesetesten, pathway-verduidelijking en biologische risicoreductie ondersteunt via kinetische analyse van netwerkvorming over 15 uur.
- Screening: Beschrijft de assay-gereedheid, reproduceerbaarheid en kwantitatieve output via time-lapse fasecontrastbeeldvorming en KAV-afgeleide parameters zoals gesloten netwerken, totale vertaktingslengte en de verhouding tussen vertakking en knooppunt.
- Analytics: Benadrukt metingen, read-outs en statistische outputs die vergelijking van netwerkstructuren over verschillende condities en tijdspunten mogelijk maken.
- Translationeel Onderzoek: Verbindt de methode met preklinische continuïteit door aangepaste vasculogenese aan te tonen in ECFC's die zijn blootgesteld aan diabetes, wat risicogebaseerde beslissingen voor verdere ontwikkeling ondersteunt.
- Enterprise Hergebruik: Positioneert de methode als een herbruikbare capaciteit voor het beoordelen van vasculogenese en andere vertakkingsprocessen in diverse celtypen en ziektestadia.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Voorspellende betrouwbaarheid, validatie van targets, vermindering van mechanistische ambiguïteit bij de vorming van vasculaire netwerken.
- Operationele waarde: Standaardisatie, reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van de beoordeling van vasculogenese in multi-well formats en time-lapse experimenten.
- Strategische waarde: Betere go/no-go beslissingen, kapitaalefficiëntie en vermindering van biologische risico's in een laat stadium door vroege detectie van dysfunctionele vasculogene fenotypes.
- Impact op portfolio: Risico-gecorrigeerde prioritering en beslissingen over verdere ontwikkeling op basis van kwantitatieve kinetiek van netwerkvorming en structurele parameters.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereiste wetenschappelijke expertise in celkweek, live-cell imaging en het gebruik van software voor beeldanalyse.
- Behoeften op het gebied van instrumentatie en analytische infrastructuur, waaronder fasecontrastmicroscopie, een temperatuur- en vochtigheidsgecontroleerde live-cellkamer en Kinetic Analysis of Vasculogenesis-software.
- Eisen voor standaardisatie tussen teams voor matrixplating, celzaaidichtheid en de selectie van de drempelwaardemethode (bijv. Mean of Otsu) om een consistente netwerkdetectie te waarborgen.
- Overwegingen voor aanpassing over verschillende modelsystemen, inclusief variërende bronnen van endotheliale progenitorcellen en samenstellingen van de extracellulaire matrix.
- Praktische beperkingen ondersteund door het bronmateriaal: de nauwkeurigheid van de netwerkdetectie is verminderd bij een laag beeldcontrast of beeldartefacten zoals rastervorming, waardoor kwaliteitscontrole van de fasecontrastbeelden noodzakelijk is.
Veelgestelde vragen over Biopharma
Chapters in this video
0:05
Title
0:59
Microscope Preparation and Endothelial Colony Forming Cell (ECFC) Matrix Plating
4:46
Image Acquisition and Processing and Kinetic Analysis of Vasculogenesis (KAV)
8:12
Results: Representative Kinetic Analysis of Vasculogenesis
10:22
Conclusion
