Een eenvoudig hoog rendement protocol voor isolatie van de alvleesklier eiland van muizen

Dit protocol vereist het gebruik van een enkele dichtheid gradiënt waardoor het aanzienlijk minder arbeidsintensief en kosteneffectiever in vergelijking met meer complexe conventionele eilandje isolatie methoden. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het enzym rechtstreeks aan de alvleesklier wordt geleverd, wat resulteert in een verbeterde weefselvertering en verhoogde eilandjesopbrengst. Begin met het aftappen van de ledematen van de muis in de supine positie en spuit het lichaam met 70%ethanol.

Met behulp van coverglass tang en gebogen chirurgische schaar, maak een ongeveer drie centimeter horizontale buikhuid incisie en trek de huid open om de buikwand bloot te leggen. Maak een verticale incisie van drie tot vier centimeter op het buikbaargtonum om de alvleesklier volledig bloot te leggen en plaats de muis onder een ontledende microscoop. Duw de leverkwab superieur aan de galbuis die verschijnt als een lichtroze buis bloot te stellen en voorzichtig bewegen de darmen van de rechter lenden- en iliacale regio aan de rechterkant van de buikholte om de galwegen en leverslagader bloot te stellen.

Gebruik Schwartz micro serrefines om het gemeenschappelijke galkanaal zo dicht mogelijk bij de lever te klemmen en de ampulla van Vater te identificeren die zich op de duodenale papillen bevindt en gevormd wordt door de vereniging van het alvleesklierkanaal en het gemeenschappelijke galkanaal. Met behulp van micro Adson tangen om de gemeenschappelijke gal buis onderwezen te trekken, steek een 30 meter halve-inch naald bevestigd aan een drie milliliter spuit met drie milliliter van vers bereide collagenase P oplossing in de ampulla van Vater duwen de naald in het kanaal parallel aan het vat voor ongeveer een kwart van de lengte van het vat. Zodra de naald op zijn plaats is, stabiliseer de naald met micro Adson tangen en langzaam en gestaag injecteren drie milliliter collagenase P oplossing in het kanaal.

De injectie wordt als succesvol beschouwd als de hoofd-, nek-, lichaams- en staartgebieden van de alvleesklier volledig zijn opgeblazen. Een goede intrede in de ampulla en cannulation van de gemeenschappelijke galbuis zijn van cruciaal belang voor een succesvolle spijsvertering oogst. Piercing de ductal muren vermindert de werkzaamheid van de isolatie.

Met behulp van gebogen en micro Adson tangen, zorgvuldig trek de opgeblazen alvleesklier te beginnen bij de milt en verder in de richting van de maag en langs de twaalfvingerige darm. Plaats vervolgens de alvleesklier in een 50 milliliter spijsverteringsbuis met drie milliliter ijskoude collagenase P-oplossing. Om de eilandjes te oogsten, gebruik je eerst een fijne chirurgische schaar om de alvleesklier drie tot vijf seconden te hakken voordat je de buis in een waterbad van 37 graden Celsius plaatst bij 100 tot 120 rotaties per minuut gedurende 12 tot 13 minuten.

Schud aan het einde van de incubatie de buis ongeveer 30 seconden zachtjes om het weefsel te verstoren totdat de oplossing homogeen is, zoals bevestigd door fijne zandachtige pancreasweefseldeeltjes. Zodra het weefsel is verteerd, plaats de buis op ijs en voeg 40 milliliter ijskoude stopoplossing toe om de enzymatische reactie te beëindigen. Na het zachtjes verstoren van de pellet, spin het verteerde weefsel in een swingende emmer centrifuge gevolgd door twee centrifugaties met 20 milliliter verse stopoplossing per wasbeurt.

Na de laatste wasbeurt, resuspend de pellet in 40 milliliter ijskoud HBSS voor drie extra wasbeurten, resuspending de pellet in vijf milliliter van kamertemperatuur dichtheid gradiënt oplossing na de laatste wasbeurt. Vortex de buis kort bij lage snelheid totdat de oplossing is gehomogeniseerd alvorens nog eens vijf milliliter kamertemperatuur dichtheid gradiënt aan de buis. Gebruik nu een pipet van 10 milliliter om voorzichtig en langzaam 10 milliliter kamertemperatuur HBSS aan de buis toe te voegen op een druppelwijze om de vorming van een gradiënt mogelijk te maken en gebruik een swingende emmercentrifuge om de celpopulaties te isoleren door dichtheidsgradiëntscheiding.

Gebruik aan het einde van de centrifugatie een pipet van 10 milliliter voorwet met koude HBSS om vijf tot 10 milliliter van de eilandjelaag tussen de dichtheidsgradiënt en de HBSS te verzamelen. Breng de eilandjes over in een nieuwe buis van 50 milliliter met 20 milliliter verse ijskoude HBSS en verzamel de cellen door centrifugeren in een swingende emmercentrifuge. Zorgvuldig aanzuigen alle, maar de laatste drie milliliter van de supernatant zonder verstoring van de pellet en was de eilandjes ten minste drie keer met 20 milliliter verse HBSS per wasbeurt.

Vervang na de laatste wasbeurt de supernatant door vier milliliter van 37 graden Celsius RMPI 1640 medium en draai de buis voorzichtig om de pellet los te maken. Giet de eilandjes onmiddellijk in een petrischaaltje van 100 millimeter en was de buis met vijf milliliter vers RPMI 1640 medium om de resterende eilandjes te verzamelen die de was met de andere eilandjes bundelen. Gebruik vervolgens een dissectie microscoop en een 20 microliter pipet tip om gezonde bolvormige of langwerpige goudbruine eilandjes met een glad oppervlak van de petrischaal te kiezen voor overdracht in een nieuwe petrischaal met 10 milliliter van volledige RPMI 1640 medium.

Wanneer alle eilandjes zijn verzameld, plaats de eilandjes in een steriele couveuse op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide in bevochtigde lucht 's nachts. Goede gezonde eilandjes lijken een gladde ronde vorm te hebben, terwijl slechte beschadigde eilandjes ruwe randen vertonen. Onverteerd exocrine weefsel is doorschijnend van uiterlijk en toont een onregelmatige vorm aan.

Een goede cannulation en distributie van het collagenase P enzym kan worden bevestigd door een inflatie van het miltgedeelte van de alvleesklier. 's Nachts incubatie in lage glucose media kan prime de eilandjes voor een glucose-gestimuleerde insuline secretie test op de volgende dag waardoor inzicht in de insuline secretoire capaciteit van de eilandjes.