Name: Een eenvoudig hoog rendement protocol voor isolatie van de alvleesklier eiland van muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Leer een eenvoudig protocol voor isolatie van alvleesklier-eilandjes bij muizen met directe collageenase-injectie. Deze methode levert 250-350 hoogwaardige eilandjes op en is minder arbeidsintensief dan conventionele technieken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij zijn mevrouw Jennifer munguia zeer erkentelijk voor haar artistieke illustratie van het schematische diagram. We danken de heer Michael R. Honig in het publieke radio station van Houston, KPFT, voor zijn redactionele hulp. Deze studie werd gesteund door American Diabetes Association #1 -15-BS-177 (YS), en NIH R56DK118334/R01DK118334 (YS). Dit werk werd ook gesteund door het USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch project 1010840 (YS) en R01 DK095118 (SG).

Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door het Dierenzorg-en gebruiks Comité (ACUC) van Texas A & M University. De chirurgische gereedschappen moeten worden weergegeven in Figuur 1 en het schematische schema van de procedure wordt weergegeven in Figuur 2.
1. oplossingen
<ol><li>Bereid de uitgebalanceerde zoutoplossing van Hank (HBSS) voor door 100 mL 10X HBSS (uit voorraad) toe te voegen aan 900 mL gedistilleerd water om 1 L HBSS (1X) te maken.</li>
	<li>Bereid STOP oplossing (moet vers worden gemaakt en moet worden gebruikt binnen 1 h) door toevoeging van 50 mL 100X foetaal runderserum (FBS) aan 450 mL ijskoud 1X HBSS; Dit maakt 500 mL STOP oplossing. Houd de STOP oplossing bij 4 °C.</li>
	<li>Bereid Collagenase P-oplossing (moet vers worden gemaakt binnen 1 uur na gebruik) door toevoeging van 1 mg/mL Collagenase P aan ijskoud 1X HBSS; gebruik 6 mL/muis.<ol>
<li>Voeg 0,05% (w/v) bovine serumalbumine (BSA) toe aan Collagenase P-oplossing (dit levert voedingsstoffen aan de geïsoleerde eilandjes). Gebruik bijvoorbeeld 3 mg BSA in 6 mL Collagenase P-oplossing. Blijf op ijs.</li>
		<li>Bereken en bereid de hoeveelheid Collagenase P die nodig is voor alle muizen in 1 50 mL Tube.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereid complete RPMI 1640 medium voor door toevoeging van 10% FBS, 100 U/mL penicillaire, 100 μg/mL streptomycine, INS-1 celsupplement (10 mM HEPES, 2 mM L-glutamine, 1 mM natrium pyruvate en 0,05 mM 2-mercaptoethanol) tot 500 mL RPMI 1640 media met 5,5 mM glucose die gebruikt voor de nachtelijke cultuur en incubatie.</li>
</ol>2. voorbereiding
<ol><li>Vul 3 50 mL tubes van 25 mL RNase remmende oplossing, 70% ethanol of gedistilleerd H2O. Deze oplossingen zullen worden gebruikt voor het reinigen van chirurgische hulpmiddelen voorafgaand en tijdens de procedure.</li>
	<li>Week de tips van de gereedschappen in RNase remmende oplossing gedurende 30 minuten voordat het protocol wordt gestart; Dit elimineert potentiële RNase op de tools.</li>
	<li>Voorgesneden absorberende pads tot 6 in x 6 in grootte voor gebruik tijdens chirurgie.</li>
	<li>Bereid 1X HBSS-oplossing van tevoren en bewaar deze bij 4 °C. Bereid STOP oplossing voorafgaand aan de operatie. Bewaren bij 4 °C.</li>
	<li>Bereid Collagenase P-oplossing onmiddellijk voorafgaand aan de operatie en bewaar op ijs. Opmerking: dit moet binnen 2 uur na de voorbereiding worden gebruikt.</li>
	<li>Etiket 50 mL buizen voor spijsvertering en zuivering; bereid 2 buizen voor elke muis, een voor de spijsvertering en de andere voor de zuivering van het eilandje. Zorg ervoor dat het dier ID op beide buisjes staat.</li>
	<li>Voeg 3 mL Collagenase P-oplossing toe aan de eerste tube van 50 mL. De resterende 3 mL Collagenase P wordt geïnjecteerd.</li>
	<li>Teken de resterende 3 mL Collagenase-oplossing in een injectiespuit van 3 mL die is gemonteerd met 30 G 1/2 in de naald. Plaats de spuit op ijs.</li>
</ol>3. procedure
<ol><li>Verwijder alle gereedschappen van RNase remmende oplossing, DIP ze eerst in de buis met 70% ethanol, vervolgens in de buis met gedistilleerd H2O, dan lucht drogen op schone papieren handdoek.</li>
	<li>Plaats de muis in een kamer met 0,5 mL Isofluraan totdat de muis diep is verdoofd.</li>
	<li>Verwijder de muis uit de kamer en controleer de staat van de anesthesie door het knijpen van een voet pad met pincet. Diepe anesthetisering is gebaseerd op de waarneming dat ademhaling gestaag langzaam wordt en de muis is niet reactief om te voet knijpen. Na te hebben bevestigd dat de muis diep verdoofd is, euthaniseer je de muis met cervicale dislocatie en plaats je de muis op het absorberende kussentje.<ol>
<li>Plaats de verdoofde muis op zijn buik, druk op de nek en ontlucht de wervelkolom van de hersenen door de staart te trekken.</li>
	</ol></li>
	<li>Plak de ledematen van de muis in liggende positie op het absorberende pad, spuit het lichaam met 70% ethanol en veeg overtollig overtollige ethanol af.</li>
	<li>Gebruik afdekglas Tang en gebogen chirurgische schaar om incisies te maken. Maak eerst een horizontale incisie op de huid van de buikstreek (~ 3 cm), trek de huid wijd open om de buikwand bloot te leggen. Maak vervolgens een verticale incisie (~ 3 – 4cm) op het abdominale peritoneum om de alvleesklier in de buikholte volledig bloot te leggen (Figuur 3).</li>
	<li>Duw de lobben van de lever bovenzijde om de galkanaal bloot, het zal verschijnen als een bleke roze buis (Figuur 3).</li>
	<li>Beweeg de darmen voorzichtig van de rechter lumbale/iliacale regio van de buikholte naar rechts, waardoor het galkanaal en de lever slagader worden blootgesteld (Figuur 3).</li>
	<li>Klem de gemeenschappelijke galkanaal voorzichtig met de Schwartz micro-serverfomen (Figuur 1) zo dicht mogelijk bij de lever.</li>
	<li>Identificeer de Papil van Vater, die is gelegen op de duodenale papilla, gevormd door de Unie van de alvleesklier en de galkanaal. De Papil van Vater lijkt gezwollen wanneer bekeken onder een dissectie Microscoop die het ingangspunt van de gemeenschappelijke galkanaal (Figuur 4). Opmerking: het aanpassen van de intensiteit/hoek van het licht van de dissectie Microscoop kan het gemakkelijker maken om te lokaliseren.</li>
	<li>Plaats de spuit met 3 ml Collagenase P-oplossing in de Papil van Vater. Duw de naald in het kanaal voor ongeveer 1/4 van de lengte van de gemeenschappelijke galkanaal (ampulla leidt naar het kanaal) zoals weergegeven in Figuur 5.</li>
	<li>Zodra de naald in de ampulla is, zorg ervoor dat de oriëntatie van de naald zodanig is dat deze parallel met het kanaal.</li>
	<li>Stabiliseer de naald door te klemmen met de micro Adson-tang om te voorkomen dat het kanaal wordt doorgeprikken (Figuur 5).</li>
	<li>Injecteer langzaam en gestaag 3 mL Collagenase P-oplossing van de spuit in de Galgang (genoeg om weerstand te voelen) zoals afgebeeld in Figuur 6. Het doel is om terugstroom druk te creëren om de collagenase te dwingen om de alvleesklier buis te betreden. Injectie wordt beschouwd als succesvol als het hoofd, nek, lichaam en staart gebied van de alvleesklier volledig zijn opgeblazen. Opmerking: de opbrengst van het eilandje is laag als de alvleesklier niet volledig is opgeblazen of als het milt gebied niet volledig is opgeblazen. Het splenisch gebied bevat het hoogste aantal eilandjes6. De inflatie kan worden bevestigd door het verschijnen van open ruimten tussen pancreas weefsel die gevuld zijn met oplossing.</li>
	<li>Zorgvuldig ontleden de opgeblazen alvleesklier en plaats deze in een 50 mL digestie buis met 3 mL ijskoude Collagenase P-oplossing.<ol>
<li>Verwijder de alvleesklier met 2 Tang (gebogen en micro-Adson; Zie Figuur 1): (beginnend bij de milt, trek de alvleesklier weg van de milt en verder te verwijderen uit de maag en langs de twaalfvingerige darm. Opmerking: geen incisies nodig.</li>
		<li>Snijd de alvleesklier voor 3 – 5 s in de vergistings buis met 3 mL ijskoude Collagenase P-oplossing met behulp van een fijne chirurgische schaar (figuur 7A).</li>
	</ol></li>
	<li>Bevestig de buis aan een rek in 37 °C waterbad en schud bij 100 – 120 rpm gedurende ongeveer 12 – 13 minuten.</li>
	<li>Schud de buisjes na incubatie voorzichtig met de hand om het weefsel te verstoren tot de Collagenase P-digestie oplossing homogeen wordt (figuur 7b). Homogeniteit wordt bevestigd door een zandachtige verschijning van fijne deeltjes van de alvleesklier. Over 30 s van zachte hand schudden is meestal genoeg. Houd de buis aan het licht om te onderzoeken of het weefsel goed is gehomogeniseerd; Schud voor een ander ~ 15 s indien nodig.</li>
	<li>Eenmaal verteerd, plaats de buizen onmiddellijk op ijs en voeg 40 mL ijskoude STOP oplossing toe om de enzymatische spijsvertering te beëindigen. Let op: op dit punt kunnen vergistings buizen op ijs worden gelaten tot 2 uur, als u op meerdere muizen werkt.</li>
	<li>Centrifugeer de buis in een swingende emmer centrifuge bij 300 x g gedurende 30 sec. (temperatuur van centrifuge is flexibel). Opmerking: gebruik een swingende emmer centrifuge zodat de weefsel pellet wordt gevormd aan de onderkant van de 50 mL buis en niet op de wand van de buis; Dit is van cruciaal belang voor een betere eiland opbrengst.</li>
	<li>Decanteren en herhalen van de centrifugeren met STOP oplossing 2 keer, de oplossing na elke spin ontstoppen. Gebruik voor elke volgende wasbeurt 20 mL STOP oplossing.<ol>
<li>Voor elke spin, verstoren de pellet door zachtjes schudden van de weefsel pellet in de 50 mL buis in 20 mL STOP oplossing.</li>
	</ol></li>
	<li>Resuspendeer de weefsel pellet met 40 mL ijskoude HBSS en centrifugeer bij 300 x g gedurende 30 sec.</li>
	<li>Decanteren en herhalen van de centrifugeren met behulp van een swingende emmer centrifuge met HBSS-oplossing nog twee keer, de oplossing na elke spin destoppen. Gebruik voor elke wasbeurt 20 mL HBSS.<ol>
<li>Voor elke spin, verstoren de pellet, om het los te maken van de bodem van de buis door zachtjes schudden van de buis met 20 mL HBSS oplossing.</li>
	</ol></li>
	<li>Verwijder na de laatste centrifugeren alle HBSS.</li>
	<li>Voeg vervolgens 5 mL ruimte temperatuurdichtheids gradiënt toe aan de buis van 50 mL die de pellet bevat. Vortex kort bij lage snelheid tot gehomogeniseerd.</li>
	<li>Voeg nog eens 5 mL van de ruimte temperatuurdichtheids gradiënt toe aan de buis van 50 mL. Niet Vortex/mix. Opmerking: het is van cruciaal belang om stabiel te blijven en nog steeds om een betere gradiënt te vormen zonder onderbreking.</li>
	<li>Pipetteer 10 mL kamertemperatuur HBSS buffer in de buis (met de dichtheidsgradiënt), drop-by-drop zachtjes en langzaam om een verloop te vormen. Gebruik een pipet pistool met een pipet van 10 mL om HBSS dropwise toe te voegen.</li>
	<li>Gebruik een swingende emmer centrifuge, spin tubes bij 1700 x g gedurende 15 min. Zorg ervoor dat u de snelheid van zowel versnelling/vertraging naar de laagste instelling wijzigt om het verloop te behouden (afbeelding 7C).</li>
	<li>Na de spin, voorzichtig verwijderen van de buizen zonder verstoring van de helling. Gebruik een pipet dat is voorbevochtig met koude HBSS (HBSS op en neer Pipetteer) en Pipetteer de laag van de eilandjes (5 – 10 mL) tussen de dichtheidsgradiënt en de HBSS in de nieuwe 50 mL-opvang buis van het eilandje. Opmerking: het is handig om de pipet met koude HBSS te bevochtigen voordat u de eilandjes pipetteren om te voorkomen dat de eilandjes aan de binnenwanden van de pipet kleven.<ol>
<li>In het geval dat de scheiding onvolledig is, zouden eilandjes zichtbaar zijn in de laag met dichtheidsgradiënt, de hele 10 mL van de dichtheidsgradiënt (onderste laag), samen met de eilandlaag die op de interface is gevormd (alleen om ongeveer 8 – 10 mL van de HBSS-toplaag achter te laten). Let op: het verzamelen van zowel de Islet-laag als de laag met dichtheidsgradiënt (onderste laag) kan resulteren in het verzamelen van puin dat de orderverzameltijd van het eilandje kan verlengen, maar er zullen geen andere stappen worden gewijzigd. Het verzamelen van beide lagen is niet nodig wanneer de laag van Islet goed is gevormd.</li>
	</ol></li>
	<li>Voeg 20 mL ijskoude HBSS toe aan de nieuwe 50 mL tube met eilandjes en centrifugeer vervolgens bij 350 x g gedurende 3 minuten in een swingende emmer centrifuge.</li>
	<li>Na de spin, voorzichtig Pipet (niet decanteren) uit de supernatant (laat ~ 3 ml aan de onderkant) zonder verstoring van de pellet met de eilandjes aan de onderkant. Gooi het supernatant weg.</li>
	<li>Herhaal wassen en centrifugeren minstens 3 keer. Voeg elke keer 20 mL HBSS toe en zorg ervoor dat u de pellet voor elke spin onderbreekt.</li>
	<li>Verwarm de RPMI-1640 complete media fles in een waterbad van 37 °C vóór gebruik. Verwijder na de laatste centrifugeren alle HBSS en voeg 4 mL eerder bereide complete RPMI-1640-media (met FBS, INS-1-celsupplement en penicillaire/streptomycine) toe aan de pellet.</li>
	<li>Ontdoe de pellet door zachtjes over de buis te zwengelen en giet de RPMI-1640-media onmiddellijk in een 100 mm Petri schaaltje. Voeg nog eens 5 mL RPMI-1640 media toe aan de tube en zwenk het zachtjes om eventuele overgebleven eilandjes af te spoelen en giet de media vervolgens in dezelfde Petri schaal.<ol>
<li>Onder een dissectie Microscoop u gezonde eilandjes uit de Petri schaal plukken met behulp van een 20 μL Pipet, en ze in een nieuwe Petri schaaltje met 10 mL complete RPMI 1640 media plaatsen. Wanneer bekeken onder een dissectie Microscoop, eilandjes moeten sferisch/langwerpige en goudbruine kleur met een glad oppervlak in vergelijking met de relatief transparante, onregelmatige exocriene weefsel. Opmerking: vergroting van de dissectie Microscoop wordt meestal ingesteld op 12,5 – 16x. De opbrengst van het eilandje varieert afhankelijk van verschillende factoren, waaronder stam, leeftijd en geslacht van de muis. Dit protocol levert meestal 250 – 350 gezonde eilandjes van gezonde C57BL/6J muis leeftijd 4 – 10 maanden oud.</li>
	</ol></li>
	<li>Incuberen de eilandjes in een steriele incubator bij 37 ° c met 5% CO2 infusie en 95% bevochtiging lucht 's nachts voor experimenten de volgende dag, of bevriezen de eilandjes voor de gewenste analyse op een later tijdstip.<ol>
<li>Zodra eilandjes zijn bevroren, ze kunnen niet worden gebruikt voor secretie assays, alleen RNA of eiwit kwantificering. Om cellen te verzamelen om te bevriezen, plaats ze in HBSS buffer, verzamel alle eilandjes in 200 – 500 μL buffer, transfer naar 1,5 mL Tube, centrifuge 350 x g gedurende 1 – 2 min, verwijder de supernatant die niet meer dan 30 – 40 μl oplossing, plaats in-20 °c voor korte termijn opslag ( enkele dagen) of-80 °C voor lange termijn opslag.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+rodent+islet+isolation+and+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">A practical guide to rodent islet isolation and assessment.</a> Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).</li>
<li>Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+isolation+of+mouse+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">An improved method for isolation of mouse pancreatic islets.</a> Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).</li>
<li>O'Dowd, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+purification+of+rodent+pancreatic+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans.</a> Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).</li>
<li>Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lepr%28db%29+mouse+model+of+type+2+diabetes%3A+pancreatic+islet+isolation+and+live-cell+2-photon+imaging+of+intact+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632(2015).</li>
<li>Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+islet+of+Langerhans+isolation+using+a+combination+of+purified+collagenase+and+neutral+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (67), (2012).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+Differences+in+Islet+Distribution+in+the+Human+Pancreas+-+Preferential+Beta-Cell+Loss+in+the+Head+Region+in+Patients+with+Type+2+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Regional Differences in Islet Distribution in the Human Pancreas - Preferential Beta-Cell Loss in the Head Region in Patients with Type 2 Diabetes.</a> PLOS ONE. 8, (2013).</li>
<li>Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).</li>
<li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (88), e50374(2014).</li>
<li>Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-temperature+culture+of+human+islets+isolated+by+the+distention+method+and+purified+with+Ficoll+or+Percoll+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients.</a> Surgery. 107 (5), e50374(1987).</li>
<li>Salvalaggio, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+filtration%3A+a+simple+and+rapid+new+purification+procedure+that+avoids+ficoll+and+improves+islet+mass+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function.</a> Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).</li>
<li>Saliba, Y., Bakhos, J. J., Itani, T., Fares, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+for+purification+of+functional+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol for purification of functional islets of Langerhans.</a> Laboratory Investigation. 97 (1), 70-83 (2017).</li>
<li>Pradhan, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obestatin+stimulates+glucose-induced+insulin+secretion+through+ghrelin+receptor+GHS-R%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Obestatin stimulates glucose-induced insulin secretion through ghrelin receptor GHS-R.</a> Scientific Reports. 7 (1), 979(2017).</li>
<li>Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+yield+of+rodent+islets+with+intraductal+collagenase+and+stationary+digestion--a+comparison+with+standard+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion--a comparison with standard technique.</a> Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol omvat Collagenase perfusie en spijsvertering, gevolgd door zuivering van eilandjes. De meest kritieke stappen van dit protocol zijn effectieve injectie en volledige perfusie van de alvleesklier1,4,7. De leveringsmethode van dit protocol kan het enzym de anatomische routes doorkruisen om het exocriene weefsel rond de eilandjes1beter te verteren. Bovendien is deze techniek zeer geschikt voor vo...

Er zijn twee veelgebruikte methoden in de literatuur voor de isolatie van de eiland alvleesklier. Men vereist het exciseren van de alvleesklier en het diceren in kleine stukjes met behulp van chirurgische schaar, en vervolgens verteerd in een Collagenase oplossing1,2,3. Een andere preciezere methode is het gebruik van het netwerk van kanalen aanwezig in de alvleesklier te introduceren spijsverterings enzym. De volgende sites zijn gebruikt voor de digestieve enzym injectie: de kruising van de gal en Cystic duct, de galblaas in de Galgang, of de gemeenschappelijke gal duct zelf1,4,5. Het is bekend dat eilandjes niet gelijkmatig worden verdeeld in de alvleesklier; de regio milt bevat de meeste eilandjes6. Terwijl de tweede methode met behulp van anatomische routes voor het leveren van spijsverteringsenzymen zorgt voor een vollediger perfusie van de alvleesklier, met inbegrip van de milt regio, deze procedure vereist vaak klemmen of het versterken van de Papil van Vater die technisch Uitdagende. In termen van de zuivering van het eilandje, zijn meerdere dichtheidsgradiënten, evenals celstrainers en magnetische terugtrekking gebruikt om de eilandjes op3,7te zuiveren. Het gebruik van deze gradiënten kan tijdrovend zijn en de Ficoll gradiënten kunnen leiden tot toxische schade aan eilandjes8.
Het huidige protocol is gebaseerd op de methode die wordt beschreven door Li et al.7, met aanvullende wijzigingen toegevoegd op basis van de ervaring van onszelf en anderen1,4. De meest kritische stappen van ons protocol zijn het klemmen van de galwegen in de buurt van het lever uiteinde, het injecteren van Collagenase P via de Papil van Vater om het exocriene weefsel te verteren en vervolgens een schud waterbad te gebruiken om de spijsvertering mechanisch te versnellen1, 4,7. Vervolgens wordt een ' STOP'-oplossing toegepast om de verdere vertering van de eilandjes te remmen; HBSS wordt gebruikt om de resterende Collagenase P-en STOP oplossing af te spoelen. Wanneer de Ficoll-methode werd gebruikt om menselijke eilandjes te zuiveren, werd de opbrengst gerapporteerd als tweemaal de eilandjes met een grotere functionele capaciteit (bijv. insuline secretie) in vergelijking met het gebruik van Percoll gradiënten9. Studies hebben echter het gebruik van Ficoll gradiënt betwist vanwege het toxische effect op de eilandjes1,10. Er is gemeld dat de histopaque gradiënt optimale zuiverings kinetiek biedt voor het isoleren van muizen eilandjes, wat een goede opbrengst oplevert van hoogwaardige eilandjes met eenvoudigere stappen en lagere kosten1. In ons protocol wordt Histopaque-1077 gebruikt om eilandjes van ander rest weefsel8,11te zuiveren. De geoogste eilandjes kunnen worden gekweekt in complete RPMI-1640-media, of rechtstreeks worden gebruikt in RNA/eiwit quantitatie.
Ons protocol, met behulp van een combinatie van Collagenase P spijsvertering en een enkele gradiënt zuivering stap, is eenvoudiger dan andere gepubliceerde protocollen. Onze methode vereist geen veeleisende chirurgische procedures en heeft slechts een paar eenvoudige stappen. Wat nog belangrijker is, dit protocol produceert consequent een goede opbrengst van hoogwaardige functionele eilandjes (250-350/muis) zoals we gemeld12.

<table><tbody><tr><td>3 mL spuit</td><td>BD</td><td>309657</td><td>Houding collagenase P</td></tr><tr><td>Coverglass pincet</td><td>VWR</td><td>82027-396</td><td>Hulpmiddel voor het vasthouden van de huid van een muis om de incisieprocedure te ondersteunen</td></tr><tr><td>Gebogen pincet</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z168696</td><td>Weefsels vasthouden tijdens pancreasverwijdering</td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Piramal</td><td>B13B16A</td><td>Om muizen voorafgaand aan de operatie te anesthesieren</td></tr><tr><td>100 mm petrischalen</td><td>VWR</td><td>30-2041</td><td>Gebaat voor eilandjescultuur</td></tr><tr><td>30 G. &frac12; inch naald</td><td>BD</td><td>305106</td><td>Voor het penetreren van de Ampulla van Vater om Collagenase P af te geven - dit gaatje wordt gebruikt omdat het goed past in de meeste CBD's</td></tr><tr><td>50ml buis</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td>Voor het vasthouden van gedigesteerd pancreasweefsel, collagenase P en gezuiverde eilandjes</td></tr><tr><td>Absorbeerbare kussentjes met waterdichte vochtbarrière</td><td>VWR</td><td>82020-845</td><td>Om bloed uit chirurgische procedures te absorberen</td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R met schommelemmer en deceleratiemogelijkheid</td><td>Eppendorf</td><td>5811FJ478114</td><td>Gebruikt voor het pelleten van weefsels, het pellet wordt gevormd op de bodem van de conische buis - schommelemmercentrifuge is nodig. Ook is de deceleratiefunctie belangrijk om de gradiëntlagen te vormen.</td></tr><tr><td>Collagenase P- 1g</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11249002001</td><td>Voor de vertering van exocrine pancreas</td></tr><tr><td>Gebogen chirurgische schaar</td><td>Fisher-Scientific</td><td>13-804-21</td><td>Voor het open snijden van de buik van een muis</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Olympus</td><td>SZX16</td><td>Gebaat voor het identificeren van belangrijke anatomische structuren om collagenase nauwkeurig in de pancreas af te geven</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution 10x</td><td>Corning</td><td>20-023-CV</td><td>Cellen wassen</td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma</td><td>RNBF5100</td><td>Voor gradiëntvorming</td></tr><tr><td>Lichtbron</td><td>Leeds</td><td>LR92240</td><td>Verbetering van de zichtbaarheid van de microscoop</td></tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Fisher-Scientific</td><td>AM9780</td><td>Voor het verwijderen van RNase</td></tr><tr><td>RPMI-1640 Media zonder L-Glutamine</td><td>Corning</td><td>15-040-CV</td><td>Cultiveren van eilandjes</td></tr><tr><td>Schwartz micro serrefines (Microvasculaire klem)</td><td>Fine Science Tools</td><td>18052-01</td><td>Gemeenschappelijke galgang en leverarterie klemmen</td></tr><tr><td>Schudwaterbad</td><td>Boekel/Grant</td><td>8R0534008</td><td>Belangrijk voor mechanische vertering van exocrine weefsel</td></tr><tr><td>Kleine chirurgische schaar</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td>Snijden van weefsel dat aan de pancreas is bevestigd</td></tr></tbody></table>

een eenvoudig hoog rendement protocol voor isolatie van de alvleesklier eiland van muizen

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Pancreas eilandjes, ook wel de eilandjes van Langerhans, zijn een cluster van endocriene cellen die hormonen produceert voor glucoseregulatie en andere belangrijke biologische functies. De eilandjes bestaan hoofdzakelijk uit vijf soorten hormonen-afscheidende cellen: α-cellen scheiden glucagon, β-cellen scheiden insuline, δ cellen scheiden Somatostatine, ε cellen afscheiden ghreline, en PP cellen scheiden alvleesklier polypeptide. 60 tot 80% van de cellen in de eilandjes zijn β-cellen, die de belangrijkste celpopulatie zijn om de insuline secretie te bestuderen. Pancreatic eilandjes zijn een cruciaal modelsysteem om ex vivo insuline secretie te bestuderen. Het verwerven van hoge kwaliteit eilandjes is van groot belang voor diabetesonderzoek. De meeste eilandje isolatie procedures vereisen technisch moeilijk te benaderen site van Collagenase injectie, harde en complexe spijsvertering procedures, en meerdere dichtheid gradiënt zuivering stappen. Dit papier is voorzien van een eenvoudige, hoge opbrengst muis eiland isolatiemethode met gedetailleerde beschrijvingen en realistische demonstraties, met de volgende specifieke stappen: 1) injectie van Collagenase P bij de Papil van Vater, een klein gebied dat lid wordt van de alvleesklier en de Galgang, 2) enzymatische vertering en mechanische scheiding van de exocriene alvleesklier, en 3) een enkele gradiënt zuiveringsstap. De voordelen van deze methode zijn de injectie van spijsverterings enzym met behulp van de toegankelijker Papil van Vater, completere spijsvertering met behulp van combinatie van enzymatische en mechanische benaderingen, en een eenvoudigere enkele gradiënt zuivering stap. Dit protocol produceert ongeveer 250 — 350 eilandjes per muis; en eilandjes zijn geschikt voor verschillende ex vivo-studies. Mogelijke waarschuwingen van deze procedure zijn potentieel beschadigde eilandjes als gevolg van enzymatische spijsvertering en/of langdurige gradiënt incubatie, die allemaal grotendeels kunnen worden vermeden door zorgvuldige advertentie-rechtvaardiging van incubatietijd.

Juiste voltooiing van deze procedure vereist enig begrip van muis anatomie in de buikholte. Dit zorgt voor een juiste identificatie van de Papil van Vater en klemmen van de Galgang. De gehele procedure duurt normaal 1 – 2 uur. Het is efficiënter om eilandjes van 4 – 6 muizen tegelijkertijd te isoleren, zodat verschillende monsters samen kunnen worden gecentrifugeerd. De tijd voor eilandje-plukken varieert, afhankelijk van het aantal eilandjes en de efficiëntie van de spijsvertering; het kan ongeveer een uur duren om 250 ...

Dit eilandje isolatie protocol beschreef een roman route van Collagenase injectie om het exocriene weefsel te verteren en een vereenvoudigde gradiënt procedure om de eilandjes van muizen te zuiveren. Het gaat om enzymatische spijsvertering, gradiënt scheiding/zuivering en eilandje hand-picking. Succesvolle isolatie kan 250 – 350 hoge kwaliteit en volledig functionele eilandjes per muis opleveren.

Een eenvoudig hoog rendement protocol voor isolatie van de alvleesklier eiland van muizen

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Dit protocol vereist het gebruik van een enkele dichtheid gradiënt waardoor het aanzienlijk minder arbeidsintensief en kosteneffectiever in vergelijking met meer complexe conventionele eilandje isolatie methoden. Het belangrijkste voordeel van dit protocol is dat het enzym rechtstreeks aan de alvleesklier wordt geleverd, wat resulteert in een verbeterde weefselvertering en verhoogde eilandjesopbrengst. Begin met het aftappen van de ledematen van de muis in de supine positie en spuit het lichaam met 70%ethanol.Met behulp van coverglass tang en gebogen chirurgische schaar, maak een ongeveer drie centimeter horizontale buikhuid incisie en trek de huid open om de buikwand bloot te leggen. Maak een verticale incisie van drie tot vier centimeter op het buikbaargtonum om de alvleesklier volledig bloot te leggen en plaats de muis onder een ontledende microscoop. Duw de leverkwab superieur aan de galbuis die verschijnt als een lichtroze buis bloot te stellen en voorzichtig bewegen de darmen van de rechter lenden- en iliacale regio aan de rechterkant van de buikholte om de galwegen en leverslagader bloot te stellen.Gebruik Schwartz micro serrefines om het gemeenschappelijke galkanaal zo dich

a-simple-high-efficiency-protocol-for-pancreatic-islet-isolation-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een gedetailleerde beschrijving van muis eilandje isolatie wordt beschreven door de techniek van in situ pancreas ductaal infusen en perfusie van een combinatie van gezuiverd collagenase en neutrale protease.

Muis Islet van Langerhans Isolatie met behulp van een combinatie van Gezuiverde Collagenase en neutraal protease

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. This protocol explains a method for isolating pancreatic islets by first perfusing collagenase via Ampulla of Vater to digest the exocrine pancreatic tissue and a simplified density gradient centrifugation to purify the islets from mice.

Pancreatic Islets Isolation through Collagenase Perfusion: An Enzymatic Method to Isolate Pancreatic Islet Cells

Het testen in vitro β-celfunctie met geïsoleerde eilandjes van Langerhans muis is een belangrijke component in de studie van diabetes pathofysiologie en therapie. Terwijl veel downstream applicaties beschikbaar zijn, dit protocol beschrijft specifiek de meting van intracellulaire cyclische adenosine monofosfaat (cAMP) als een essentiële parameter bepalen van β-cel functie.

Een methode voor muis eilandjes van Langerhans Isolatie en intracellulaire cAMP Bepaling

We presenteren hier een protocol voor de isolatie van eilandjes uit het muismodel van type 2 diabetes, Leprdb en details van een live-cel assay voor het meten van insulinesecretie uit intacte eilandjes dat gebruikmaakt van 2 foton microscopie.

LepR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Model van Type 2 Diabetes: eilandjes van Langerhans Isolatie en live-cell 2-Photon Imaging van intacte Eilandjes

Cruciale uitdagingen voor het onderzoeksgebied diabetes zijn de moleculaire mechanismen die eilandje β-cellen replicatie en op werkwijzen voor het stimuleren van β-celregeneratie ontwikkelen begrijpen. Hierin een high-gehalte screening methode voor het identificeren en evalueren van de β-cel-replicatie bevorderende activiteit van kleine moleculen wordt gepresenteerd.

Een High-gehalte<em&gt; In Vitro</em&gt; Eilandjes van Langerhans β-cel Replication Discovery Platform

We beschrijven een protocol hierin voor het isoleren van intacte eilandjes van neonatale muizen. Pancreata werden gedeeltelijk gedigereerd met collagenase, gevolgd door wassen en handmatige oogst. 20-80 eilandje clusters verkrijgbaar per pancreas van pasgeboren muizen, die geschikt zijn voor verschillende eilandje studies.

Effectieve Isolatie van Functionele eilandjes van neonatale muis alvleesklier

Alvleesklier islet transplantatie is een manier om normoglycemia bij type 1 diabetes. Dit artikel richt zich op de transplantatie-techniek via de intraportal route om normale glucoseniveaus in diabetesmuizen te handhaven.

Intraportal transplantatie van de alvleesklier eilandjes in Mouse Model

Hier presenteren we een protocol voorbeeld vorming en kwantificeren van de calcium dynamica in heterogene celpopulaties, zoals de eiland cellen van de alvleesklier. Fluorescerende verslaggevers worden geleverd in de perifere laag van cellen binnen het eilandje, die vervolgens wordt geïmmobiliseerd en imaged, en per-cel analyse van de dynamiek van de intensiteit van de fluorescentie wordt uitgevoerd.

Imaging calcium dynamica in subpopulaties van muizen pancreatic eilandje cellen

Dit protocol beschrijft de isolatie van endotheelcellen van muizen uit de hele alvleesklier.

Isolatie van endotheelcellen van de pancreas van muizen

Deze studie ontwikkelde een vereenvoudigde methode om efficiënt functionele primaire eilandjes en acinaire cellen uit de muizenalvleesklier te extraheren, wat een waardevol hulpmiddel biedt voor het bestuderen van intercellulaire communicatie in de pathogenese van Acute Pancreatitis-geïnduceerde Diabetes.

Een eenvoudige en snelle methode voor gelijktijdige isolatie van primaire eilandjes en primaire alvleesklier-acinaire cellen van muizen

Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde methode voor chirurgische oogst, enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntzuivering van Lewis rat-pancreaseilandjes, waardoor hoogopbrengst- en hoogzuiverheidspreparaten mogelijk zijn voor direct gebruik in transplantatie- of in vitrostudies .

Isolatie en zuivering van het pancreaseiland door Lewisratten met behulp van enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntscheiding

Leer een eenvoudig protocol voor isolatie van alvleesklier-eilandjes bij muizen met directe collageenase-injectie. Deze methode levert 250-350 hoogwaardige eilandjes op en is minder arbeidsintensief dan conventionele technieken.

Een eenvoudig hoog rendement protocol voor isolatie van de alvleesklier eiland van muizen

Meer video's verkennen