Multiplexed isotherme amplificatie gebaseerd diagnostische Platform om te detecteren Zika, Chikungunya en Dengue 1

Het algemene doel van deze procedure is om het gebruik van een multiplexed point-of-care diagnostiekplatform te demonstreren dat geen uitgebreide monstervoorbereiding en dure instrumentatie vereist en dat wordt gebruikt in een verscheidenheid aan biologische monsters. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van point-of-care diagnostiek, zoals de detectie van verschillende doelwitten in een enkele reactiebuis. Door gebruik te maken van loop-mediated isothermal amplification gekoppeld aan doelwit-specifieke streng-verplaatsende sondes, kunnen drie verschillende virussen efficiënt worden gedetecteerd.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat deze isotherme amplificatie gebruikt in plaats van PCR en dat minimale monstervoorbereiding vereist is en kan worden toegepast op een reeks klinische monsters. Begin door Q-papiervellen in kleine rechthoekjes van drie millimeter bij vier millimeter te snijden met behulp van een papierpons. Gebruik vervolgens een microstamper om Aedes aegypti vrouwelijke muggen die mogelijk besmet zijn met Zika op elk papier te pletten.

Pipetter 20 microliter van één molaire waterige ammoniakoplossing op elk stuk papier. Was na vijf minuten elk papier met 20 microliter 50% ethanol, gevolgd door 20 microliter nuclease-vrij water. Laat het papier een uur in een BSL-2 bioveiligheidskabinet aan de lucht drogen.

Na het drogen, dompel elk papier volledig onder in 100 microliter RT-LAMP reactiemengsel met behulp van pincetten en incubeer gedurende 45 minuten bij 65 tot 68 graden Celsius. Lees en noteer de fluorescentie die voortkomt uit het Zika-virus met behulp van een 3D-geprint observatiebox met een LED-lichtbron en een oranje of gele filter. Begin door 90 microliter 1,1-voudige rehydratiebuffer toe te voegen aan elke reactiebuis met gelyofiliseerd RT-LAMP reagentia en op te lossen door te schudden.

Spina vervolgens kort op 1.000 maal de zwaartekracht. Voeg na centrifugatie 10 microliter urinemonster toe dat is aangevuld met het virale RNA aan de reactiebuizen en meng door te pipetten. Als u muggen test, voegt u een rechthoek van Q-papier toe met daarop lijklichamen van muggen, samen met 10 microliter gezuiverd water in plaats van urine.

Plaats de gesloten buisjes in een warmteblok dat is vooraf ingesteld op 65 tot 68 graden Celsius en incubeer gedurende 30 tot 45 minuten. Houd na de incubatie de buisjes gesloten om besmetting van toekomstige tests te voorkomen en plaats ze in de observatiebox. Schakel de schakelaar aan de achterkant van de observatiebox in.

Observeer het monster door de oranje filter en leg de afbeelding vast met een mobiele telefooncamera die op een afstand wordt gehouden waar de afbeelding 80% van het gezichtsveld vult. Zet na de visualisatie de schakelaar uit. Bewaar de afgesloten buisjes in het donker, bij voorkeur gekoeld als later visualisatie nodig is.

In zowel enkele als multiplexgevallen verschijnen RT-LAMP-producten als een letter van concatemers wanneer ze op agarosegel worden gedraaid. Negatieve controlemonsters die water als monster bevatten, gaven alleen de banden voor de primers zelf, inclusief de niet-specifieke doelwitcontrole waarbij totaal genucleïnezuur dat uit een niet-geïnfecteerde vrouwelijke mug werd geëxtraheerd, werd gebruikt als template. Groene fluorescentie wordt waargenomen voor Zika met behulp van sondes als vijf prime NT gelabeld met FAM.

Lichtgroene gele fluorescentie wordt toegewezen aan Chikungunya, waarbij de sonde vijf prime NT is gelabeld met HEX. Een oranjerode fluorescentie wordt gebruikt voor Dengue-1, waarbij de sonde vijf prime NT is gelabeld met TAMRA. Twee papieren met muggen werden direct ondergedompeld in het RT-LAMP-mengsel en na incubatie bij 65 graden Celsius gedurende 30 minuten werd heldere groene fluorescentie waargenomen in aanwezigheid van het Zika-virus.

Met behulp van negen volumes rehydratiebuffer en één volume urinemonster kan binnen 30 minuten zichtbare groene fluorescentie worden gegenereerd en kan de afbeelding worden vastgelegd door elke mobiele telefooncamera. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van klinische diagnostiek om point-of-care platforms te verkennen voor het detecteren van door muggen overgedragen virussen in urine, bloed, speeksel of muggenlijklichamen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van het gebruik van een isotherme amplificatiesysteem, in dit geval lamp, om Zika en andere arbovirussen in multiplexmodus in een verscheidenheid aan biologische monsters te detecteren.