Behandeling van Monosynaptic verbindingen in Drosophila met behulp van resistente tetrodotoxine natrium kanalen

Het algemene doel van deze techniek is om monosynaptische verbindingen elektrofysiologisch in drosophila te identificeren met behulp van tetrodotoxine-resistente natriumkanalen. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het eenvoudig is en de chemische aard van synapsen kan onthullen. Het is ook geschikt voor de studie van volume- of bulktransmissie.

Over het algemeen worstelen we, als we nieuw zijn met deze methode, met video's vanwege de moeilijkheid van de dissectie. Door de methode echter eenvoudig te begrijpen, is de logica gemakkelijk overdraagbaar naar andere modelsystemen zoals muizen. Voor de opnames, gebruik patch pipetten voor de weerstand van bijna zeven megaohm.

Heb ook externe opnamezoutoplossing met een pH van 7,3 of minder, continu belucht met carbogen dat 95% zuurstof en 5% koolstofdioxide bevat. Voor de proefpersonen, gebruik een vliegenstam die csChrimson tot expressie brengt, vermeerderd op voedsel dat 0,2 millimolar bevat van alle trans-Retinal. Voor de opnames, selecteer volwassenen van een tot drie dagen oud.

Laad ze in een glazen scintillatieglas en immobiliseer het door het een minuut bloot te stellen aan ijskoude omstandigheden. Verlaag vervolgens het lichtniveau op de dissectiescoop en grove pincetten om een verdoofde vlieg in de op maat gemaakte opnamekamer te laden. Zet de vlieg vast aan de kamer door deze te omringen met was of UV-uithardbare epoxy.

Plaats het met de dorsale kant omhoog met het folie ongeveer halverwege de thorax. De sleutel tot het verkrijgen van een geweldige voorbereiding is het hebben van het gat in het folie dat precies de juiste maat heeft, zodat de vlieg niet wordt geperst of door kan vallen. Verlicht de voorbereiding met optische vezelverlichting van beide kanten en houd ze zo zwak mogelijk.

Bedek vervolgens de voorbereiding met vier tot zes druppels opnamezoutoplossing. Maak vervolgens de tungsteendraad of het gloeidraadje scherp voor de dissectie. Pas ongeveer 20 volt wisselstroom toe op een kaliumnitraatverzadigde oplossing en dompel het uiteinde van de draad snel herhaaldelijk in de oplossing.

Na 20 doppen zal het uiteinde scherp zijn. Pas nu de verlichting aan om voldoende zichtbaarheid te bieden om de scherpe draad te gebruiken om de hersenen bloot te leggen door de cuticula te verwijderen, gevolgd door de luchtpijp en vetlichamen. Gebruik een gebogen tungsteendraad om de antenne voorzichtig onder de folieschild te plaatsen om de antennelobben te bereiken.

Gebruik vervolgens scherpe pincetten om voorzichtig de glialaag te verscheuren die het gebied van belang bedekt. Breng nu de voorbereiding over naar de elektrofysiologie rig om opnames te maken. Bij de rig, begin onmiddellijk met het perfunderen van de voorbereiding met opnamezoutoplossing, gebuisd met carbogen.

Gebruik een door zwaartekracht gevoede zoutoplossingsreservoir boven het microscoopplatform. Gebruik een vacuümlijn en een fles van 2 liter om de afvalzoutoplossing op te vangen. Laad vervolgens de patch pijp met 4 microliters interne opnameoplossing en bevestig de pijp aan een micromanipulator.

Nullen vervolgens de offset van de versterker en stel de versterker in om testpulsen te leveren. Pas vervolgens IR schuine verlichting aan om een duidelijk zicht op de hersenen te krijgen. Terwijl u positieve druk op de pijp toepast, nadert u de cel met de pijp.

Wanneer contact met de cel wordt gemaakt, laat u de positieve druk los om de pijp af te sluiten op het membraan. Stel vervolgens het houdpotentiaal van het membraan in op min 60 millivolt. De pijp moet een gigaohm-afsluiting vormen met het celmembraan.

De houdstroom moet dalen tot een zo laag mogelijk sub-picoamp niveau. Om constante gigaohm-afsluitingen te verkrijgen, zorg ervoor dat u uw pijp schoon houdt door positieve druk te houden en vermijd het raken van weefsel of het naderen van uw cellen. Stel de versterker in om testpulsen te leveren van min 50 tot min 60 millivolt.

De testpulsen zullen een grote capacitieve overgang tonen die de stroom vertegenwoordigt die nodig is om de patch pijp op te laden. Om de capacitieve overgang te verwijderen, pas de capaciteitscompensatieknoppen op de versterker aan. Pas nu korte pulsen van negatieve druk toe om het celmembraan te scheuren en de hele celconfiguratie te verkrijgen.

Een grote toename in de capacitieve overgang duidt op succes. Een kleine toename in de houdstroom zou ook moeten worden waargenomen. Stel vervolgens de versterker in op stroomklemmodus.

En pas het potentiaal van de cel aan op tussen min 50 en min 60 millivolt. Configureer in voorbereiding het data-acquisitiesysteem zoals aangegeven in het protocol van de technicus. Het systeem vereist een krachtige rode LED die onder de voorbereiding is gepositioneerd om de vlieg te verlichten met 0,238 milliwatt per vierkante millimeter.

Activeer nu de presynaptische neuronen optogenetisch, met behulp van gepulseerd rood licht in csChrimson-expressie. Andere methoden kunnen ook worden gebruikt. Voordat tetrodotoxine wordt toegepast, zou een synaptische verbinding zichtbaar moeten zijn als reactie op een lichtpuls van 40 milliseconden.

Geen reactie betekent dat een verbinding onwaarschijnlijk is. Het houdpotentiaal kan worden aangepast om de excitatoire of inhibitoire verbindingen te benadrukken, dienovereenkomstig. Zodra een verbinding is geverifieerd, stel de zoutoplossingsovervloed in voor hercirculatie bij de zoutoplossing.

Stel de pomp in zodat het zoutoplossingsniveau in het bad stabiel blijft. Voeg vervolgens voldoende tetrodotoxine toe aan het systeem voor een uiteindelijke concentratie van één micromolar. Dit zou de spiking-activiteit van de gepatchte neuron moeten stoppen.

Indien niet, voeg meer tetrodotoxine toe aan het systeem. Pas nu korte pulsen van rood licht toe om waarschijnlijk een monosynaptische verbinding te activeren. Ga vervolgens verder met het toevoegen van farmacologische antagonisten aan de circlerende zoutoplossing om de chemische aard van de synaptische verbindingen te testen.</