Name: Behandeling van Monosynaptic verbindingen in Drosophila met behulp van resistente tetrodotoxine natrium kanalen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Leer monosynaptische verbindingen identificeren in Drosophila met behulp van tetrodotoxine-resistente natriumkanalen. Deze elektrofysiologische methode onthult de chemische aard van synapsen en neurale connectiviteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zouden graag bedanken Joshua Singer, Jonathan Schenk, evenals nadenkende reviewers voor opmerkingen op het manuscript. Wij zouden ook willen bedanken Ben White en Harold Zakon voor discussies over de techniek. Jonathan Schenk de gegevens heeft verschaft voor figuur 3A. Dit werk werd gesteund door een subsidie van de Stichting Whitehall en een NIH R21 naar QG.

1. Prepareer vliegen en identificeren GAL4 promotor lijnen
<ol><li>Selecteer een regel van de promotor GAL4 en het Kruis met vliegen met zowel de transgenic UAS-NaChBac en een optogenetic transgenic voor activering. Opmerking: UAS-CsChrimson11 is geselecteerd vanwege haar hoge geleidbaarheid en het gemak waarmee het NaChBac-gemedieerde actie potentials activeert. Zowel UAS-NaChBac en UAS-CsChrimson zijn beschikbaar via de Repository van de voorraden Bloomington.</li>
	<li>All-trans retinal bereiden als een stamoplossing in ethanol (35 mM) en bewaar de oplossing in de diepvries bij-20 ° C.</li>
	<li>Mix 28 µL van dit materieel in ongeveer 5 mL gerehydrateerd aardappel vlok voedsel en voeg dit mengsel aan de bovenkant van een flacon van conventionele Drosophila medium.</li>
	<li>Volwassen vliegen uiten van csChrimson over voedsel met 0,2 mM all-trans-retinale voor 1-3 dagen11te verhogen.</li>
</ol>2. voorbereiding van de TTX voorraad
<ol><li>Het maken van een stamoplossing van 1 mM TTX in gedestilleerd of gedeïoniseerd water. Bewaar deze oplossing in een lab-koelkast voor enkele maanden. Controleer de instellingen beleid met betrekking tot de opslag van TTX zoals vele instellingen TTX als een stof gevaarlijk of gecontroleerde classificeren.</li>
</ol>3. Prepareer vliegen electrofysiologie
<ol><li>1 – 3-daagse oude volwassene vliegt die zijn gerezen op het voedsel met all-trans-retinale verzamelen. Nota: Verwijs naar Murthy en Turner in 2013 voor een gedetailleerde beschrijving van de patch klemmen Drosophila neuronen12,13.</li>
	<li>Zet de vliegen in een flesje van glas scintillatie. Plaats de ampul op ijs voor 1 min te immobiliseren van de vliegen.</li>
	<li>Grof pincet een vlieg in de kamer van een op maat gemaakte opname invoegen gebruiken De kamer bestaat uit een 3 ½" cirkel laser gesneden uit 1/16" acryl. Knip een gat ¾" is in het midden waarop een aangepaste folie is aangesloten met 2-delige epoxy. De folie bevat een driehoekige vorm van hoop dat de vlieg wordt ingevoegd.</li>
	<li>Toepassing wax of UV drogende epoxy rond het dier om het stevig veilig binnen de kamer opnemen.</li>
	<li>Verlicht de voorbereiding met een zwanenhals optische vezel voor visualisatie onder een stereomicroscoop. De vezels van de zwanenhals voor schuine verlichting instellen door ze aan te passen zodat zij de vlieg rechtstreeks vanaf de kant verlichten.</li>
	<li>Pas het lichtniveau aan de laagst mogelijke instelling waarmee nog duidelijk visualisatie van de vlieg. Deze lichtintensiteit zal variëren van individuele experimenten. Opmerking: Dit protocol kan worden aangepast met behulp van een in situ hersenen explant methode14.</li>
	<li>Opname van externe bron zoutoplossing halen. De saline bevat in mM: 103 NaCl, 3 KCl, 5 N-tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoethane-Sulfonzure zuur, 8 trehalose, 10 glucose, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4, 1.5 CaCl2en 4 MgCl2 (aangepast aan 270-275 mΩ). De saline is borrelen met 95% O2/5% CO2 (carbogen) en heeft een pH aangepast aan 7.315.</li>
	<li>4-6 druppels extracellulaire opname zoutoplossing op de vlieg voorbereiding plaatst. Op dit punt verhogen het lichtniveau bij de dissectie Microscoop voor betere zichtbaarheid.</li>
	<li>Verscherpen een wolfraam draad met behulp van elektrolyse. Om de draad, bereid een verzadigde oplossing van KNO3 en toepassen van ongeveer 20 V van AC-stroom terwijl het uiteinde van de draad in de oplossing 20 keer voor elke 100 ms dompelen totdat de tip is verscherpt. Gebruik de aangescherpte wolfraam draad te verwijderen van de epidermis op het hoofd van de vlieg en dus het blootstellen van de hersenen.</li>
	<li>Verder bloot de hersenen door het verwijderen van de luchtpijp en vet organen eromheen. Als toegang tot de antennal lobben, kunt een gebogen wolfraam draad of soortgelijke tool zachtjes plooi antennes onder de folie opname kamer om de zichtbaarheid te vergroten. Hiermee kunt u dat scherpe pincet zachtjes scheur weg het gliale omhulsel van het terrein van belang waar de opnames zullen worden gemaakt.</li>
	<li>De opname-zaal overbrengen in de elektrofysiologie tuig. Onmiddellijk start perfusie met opname van externe bron saline borrelen met carbogen voor het behoud van de hersenen. Het reservoir van de zoutoplossing wordt geplaatst boven in het werkgebied van de Microscoop en wordt zwaartekracht-gevoed aan de voorbereiding. Gebruik een vacuüm lijn en een erlenmeyer van 2 L te verzamelen het afval zoutoplossing.</li>
</ol>4. het verkrijgen van geheel-cel opname
<ol><li>Patch pipetten op een commerciële Pipetteer trekker trek. Raadpleeg de handleiding voor instellingen om een passende Pipetteer met een tip weerstand in de buurt van 7 mΩ.</li>
	<li>Voeg 4 µL van interne opnameoplossing in een patch pipet. De interne zoutoplossing bestaat uit 140 kalium aspartaat, 10 HEPES, 4 MgATP, 0,5 Na3GTP, 1 EGTA en 1 KCl in mM.</li>
	<li>Patch-clamp versterker voor geheel-cel opname instellen Nul van de versterker verschuiving en stel de versterker te leveren test pulsen. Hier, wordt een AM systemen Patch klem versterker 2.400 gebruikt.</li>
	<li>Toepassen van positieve druk via de pipet en aanpak van de cel. Gebruik een micromanipulator om de pipet direct en contact met de cel. Positieve druk vrij. Set het bedrijf potentieel van het membraan tot -60 mV. De pipet dient een zegel van de gigaohm met het celmembraan zoals blijkt uit een lage sub-picoamp huidige bedrijf vormen. Opmerking: Als met behulp van GFP geleid cel targeting, probeer te minimaliseren gebruik van epifluorescerende licht ChR2 activering en potentiële synaptic depressie te voorkomen. Ook enkele minuten wachten voordat u stap 5.</li>
	<li>Instellen van de versterker test pulsen om van te verlossen -50 mV tot -60 mV. Deze instelling is standaard op patch-clamp versterkers. Test pulsen zal onthullen een grote capacitative van voorbijgaande aard vertegenwoordigen de huidige nodig om te laden van de patch pipet. Verwijder capacitative transiënten door het aanpassen van de capaciteit compensatie knoppen op de AM 2400 of soortgelijke versterker.</li>
	<li>Toepassing korte pulsen van negatieve druk te scheuren van de celmembraan en geheel-cel configuratie te verkrijgen. Opmerking: De configuratie van een hele cel wordt waargenomen wanneer er een grote stijging van de capacitative transiënten toont de capaciteit van het neuron. Een kleine toename van het huidige bedrijf (basislijn) zal waarschijnlijk ook worden waargenomen. De versterker aan huidige klem modus instellen en aanpassen van de cel kunnen -50 tot -60 mV.</li>
</ol>5. de synaptische verbinding testen
<ol><li>Configureren van de data (DAQ)-acquisitiesysteem te activeren van een LED-driver voor het genereren van lichte pulsen. Hier, wordt een nationale instrumenten DAQ-systeem gebruikt met Matlab te leveren van een analoog signaal aan een LED-driver. De LED-intensiteit wordt aangepast via het analoge signaal naar de chauffeur. De LED is een 620-630 nm golflengte LED.</li>
	<li>Plaats de high-powered rode LED direct onder de voorbereiding. De lichtintensiteit zodanig aanpassen dat 0.238 mW/mm2 de vlieg bereikt.</li>
	<li>Activeren presynaptische neuronen tijdens het opnemen van het postsynaptisch cel van belang. Bereiken van de cel activeren optogenetically, pharmacogentically, of via zenuwstimulatie. Hier, worden csChrimson en korte pulsen van rood licht toegepast. Opmerking: Synaptic verbindingen kunnen worden gecontroleerd in het huidige klem als EPSPs of spanning klem als EPSCs. Een synaptische verbinding moet alvorens TTX in reactie op een lichte puls van 40 ms zichtbaar zijn. Als geen verbinding wordt waargenomen, is het onwaarschijnlijk dat de neuronen synaptically aangesloten of mono - of polysynaptically. Het bedrijf potentiële kan worden aangepast om te benadrukken excitatory of inhiberende verbindingen dienovereenkomstig.</li>
	<li>Als een verbinding wordt waargenomen in normale zout, TTX toevoegen aan het systeem van de perfusie om een eindconcentratie van 1 µM. gebruik een circulatiepomp voor vastleggen en opnieuw gebruiken van de zoutoplossing om te besparen TTX. De slangenpomp zal de zoutoplossing trekken uit het bad en terug te sturen naar het zoute reservoir.</li>
	<li>Pas de snelheid van de pomp om een sterke constante vacuüm dat staat niet toe dat zoute niveau in het bad te stijgen en dalen. Opmerking: De toepassing van de TTX moet leiden tot de beëindiging van de activiteit in het neuron die moet worden gecontroleerd in geheel-cel stekelige. Dit bevestigt dat er voldoende TTX is toegevoegd aan de zoutoplossing.</li>
	<li>Korte pulsen van rood licht (40 ms voor elke pulse) opnieuw toepassen. Op dit punt een synaptische verbinding die blijft dreigt monosynaptic. Farmacologische antagonisten aan de recirculatie zoutoplossing om te testen de chemische aard van de synaptische verbindingen die blijven in de TTX toevoegen. Opmerking: Bij het combineren van optogenetics en fluorescerende targeting van neuronen, mogelijk het belangrijk niet te hardnekkig activeren de presynaptische bevolking van neuronen terwijl het proberen om het verkrijgen van een opname. Dit kan leiden tot synaptic depressie en maakt het moeilijk om te zien van verbindingen. Omdat csChrimson een lange excitatie-band die zich over het algemeen in het bereik van groen fluorescent proteïne heeft uitstrekt, een rode fluorophore kan worden gebruikt voor het visualiseren van de neuronen en channel2rhodopsin (Ch2R) kan worden gebruikt voor het opwekken van cel populaties. Doen vereist specifieke genetica en een aangepast filter kubus. Maken voor het genereren van geschikte vliegen, vliegen die uitdrukking geven aan de rode fluorophore (RFP of mCherry) onder de LexA of Q systeem binaire expressiesystemen. Deze zal moeten worden gekruist met vliegen uiting geven aan de promotor van een Gal4 en UAS-Ch2R en UAS-NaChBac effector genen. De optimale filter kubus voor epifluorescence zal hebben een smalle excitatie-bereik tot prikkelen de rode fluorophore, maar niet prikkelen de Ch2R. Bovendien, een lange pass emissie filter voor het verzamelen van zoveel uitgestraalde licht moet worden opgenomen door de filter set. We gebruikten een aangepast filter instellen vanuit Chroma die opgenomen deel getallen et580/25 x en t600lpxr (uit de 49306 set), maar met een et610lp barrière/emissie filter.</li>
</ol>

<ol><li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Nat Neurosci. 10, 663-668 (2007).</li>
<li>Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+functional+neuronal+connectivity+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain.</a> J Neurophysiol. , 684-696 (2012).</li>
<li>Doyle, M. W., Andresen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliability+of+monosynaptic+sensory+transmission+in+brain+stem+neurons+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Reliability of monosynaptic sensory transmission in brain stem neurons in vitro.</a> J Neurophysiol. 85, 2213-2223 (2001).</li>
<li>Nicholls, J. G., Purves, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+chemical+and+electrical+connexions+between+sensory+and+motor+cells+in+the+central+nervous+system+of+the+leech%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol-London%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic chemical and electrical connexions between sensory and motor cells in the central nervous system of the leech.</a> J Physiol-London. 209, 647-667 (1970).</li>
<li>Byrne, J. H., Castellucci, V. F., Kandel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+individual+mechanoreceptor+sensory+neurons+to+defensive+gill-withdrawal+reflex+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Contribution of individual mechanoreceptor sensory neurons to defensive gill-withdrawal reflex in Aplysia.</a> J Neurophysiol. 41, 418-431 (1978).</li>
<li>Liao, X., Walters, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+elevated+divalent+cation+solutions+to+isolate+monosynaptic+components+of+sensorimotor+connections+in+Aplysia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">The use of elevated divalent cation solutions to isolate monosynaptic components of sensorimotor connections in Aplysia.</a> J Neurosci Meth. 120, 45-54 (2002).</li>
<li>Feinberg, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP+Reconstitution+Across+Synaptic+Partners+%28GRASP%29+Defines+Cell+Contacts+and+Synapses+in+Living+Nervous+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) Defines Cell Contacts and Synapses in Living Nervous Systems.</a> Neuron. 57, 353-363 (2008).</li>
<li>Macpherson, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+labelling+of+neural+connections+in+multiple+colours+by+trans-synaptic+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Dynamic labelling of neural connections in multiple colours by trans-synaptic fluorescence complementation.</a> Nat Commun. 6, 10024-10029 (2015).</li>
<li>Zhang, X., Gaudry, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+integration+of+a+serotonergic+neuron+in+the+Drosophila+antennal+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Functional integration of a serotonergic neuron in the Drosophila antennal lobe.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+olfactory+processing+in+Drosophila%3A+mechanisms+and+principles%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Early olfactory processing in Drosophila: mechanisms and principles.</a> Annu Rev Neurosci. 36, 217-241 (2013).</li>
<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nat Methods. 11, 338-346 (2014).</li>
<li>Murthy, M., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+in+vivo+patch-clamp+recordings+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Whole-cell in vivo patch-clamp recordings in the Drosophila brain.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 140-148 (2013).</li>
<li>Murthy, M., Turner, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+head+cuticle+and+sheath+of+living+flies+for+whole-cell+patch-clamp+recordings+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissection of the head cuticle and sheath of living flies for whole-cell patch-clamp recordings in the brain.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013, 134-139 (2013).</li>
<li>Gu, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Cell+Recordings+from+Brain+of+Adult+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Cell Recordings from Brain of Adult Drosophila.</a> J Vis Exp. , (2007).</li>
<li>Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+olfactory+representations+in+the+Drosophila+antennal+lobe%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transformation of olfactory representations in the Drosophila antennal lobe.</a> Science. 303, 366-370 (2004).</li>
<li>Kazama, H., Wilson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+Matching+and+Nonlinear+Amplification+at+Identified+Central+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Homeostatic Matching and Nonlinear Amplification at Identified Central Synapses.</a> Neuron. 58, 401-413 (2008).</li>
<li>Becnel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DREADDs+in+Drosophila%3A+a+pharmacogenetic+approach+for+controlling+behavior%2C+neuronal+signaling%2C+and+physiology+in+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">DREADDs in Drosophila: a pharmacogenetic approach for controlling behavior, neuronal signaling, and physiology in the fly.</a> Cell Reports. 4, 1049-1059 (2013).</li>
<li>Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+the+lock+to+fit+the+key+to+create+a+family+of+G+protein-coupled+receptors+potently+activated+by+an+inert+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand.</a> P Natl Acad Sci USA. 104, 5163-5168 (2007).</li>
<li>Sun, Q. Q., Wang, X., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laserspritzer%3A+A+Simple+Method+for+Optogenetic+Investigation+with+Subcellular+Resolutions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Laserspritzer: A Simple Method for Optogenetic Investigation with Subcellular Resolutions.</a> PLoS One. 9, e101600-e101608 (2014).</li>
<li>Holloway, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+Glutamatergic+Activation+of+Locus+Coeruleus+and+Other+Lower+Brainstem+Noradrenergic+Neurons+by+the+C1+Cells+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic Glutamatergic Activation of Locus Coeruleus and Other Lower Brainstem Noradrenergic Neurons by the C1 Cells in Mice.</a> J Neurosci. 33, 18792-18805 (2013).</li>
<li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457, 1142-1145 (2009).</li>
<li>Kloppenburg, P., Ferns, D., Mercer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+enhances+central+olfactory+neuron+responses+to+female+sex+pheromone+in+the+male+sphinx+moth+manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Serotonin enhances central olfactory neuron responses to female sex pheromone in the male sphinx moth manduca sexta.</a> J Neurosci. 19, 8172-8181 (1999).</li>
<li>Suster, M. L., Seugnet, L., Bate, M., Sokolowski, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refining+GAL4-driven+transgene+expression+in+Drosophila+with+a+GAL80+enhancer-trap%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Refining GAL4-driven transgene expression in Drosophila with a GAL80 enhancer-trap.</a> Genesis. 39, 240-245 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

KERKEN analyse complimenten huidige technieken die worden gebruikt voor circuit kraken doordat de detectie van synapsen tussen geïdentificeerde neuronen. In het bijzonder blijkt de aanpak monosynaptic verbindingen door in grote lijnen silencing actie potentials met TTX wijl restoring prikkelbaarheid in een select aantal neuronen met de TTX-ongevoelig natrium-kanaal NaChBac. Synaptic release wordt opgewekt door stimulatie van de optogenetic terwijl postsynaptisch gebeurtenissen worden gecontroleerd met de opnames van de g...

Een belangrijk doel van de neurowetenschappen is om de verbindingen tussen neuronen te begrijpen hoe informatie stroomt door schakelingen in kaart. Talrijke benaderingen en middelen zijn beschikbaar om te testen voor functionele verbindingen tussen neuronen in een waaier van model systemen1,2gekomen. Voor het genereren van de meest nauwkeurige schakelschema's met behulp van electrofysiologie, is het belangrijk om op te lossen of waargenomen verbindingen tussen twee cellen directe en monosynaptic versus indirecte en polysynaptic zijn. Een gouden standaard voor het maken van dit onderscheid in zoogdieren neuronen is voor het meten van de latentie tussen enkele action potentials in de presynaptische cellen en het begin van excitatory postsynaptisch stromingen (EPSCs) in het tweede neuron. Monosynaptic verbindingen moeten korte latencies voor een paar milliseconden en lage variabiliteit3. Deze aanpak kan worden gecompliceerd in ongewervelde neuronen omdat synapsen op in hun dendrites ver van de somatische opname site treedt, veroorzaakt door vertragingen in de opsporing als gevolg van lange electrotonic afstanden tussen postsynaptisch conductances en de opname elektrode. Dergelijke vertragingen kunnen leiden tot dubbelzinnigheid over poly-versus monosynaptic bijdragen. Bovendien, kleine synaptic gebeurtenissen kan verval alvorens de site somatische opnames en rijden sterker presynaptische activiteit, dreigt te werven van polysynaptic evenementen.
Diverse technieken zijn ontwikkeld om te testen voor monosynaptic verbindingen in ongewervelden. Een benadering gebruikt hoge divalente kationen oplossingen (Hi-Di) met overtollige Mg++ en Ca++. Deze oplossing blokkeert polysynaptic verbindingen op vermindering release waarschijnlijkheid en toenemende actiepotentiaal drempel om de gunst van de detectie van monosynaptic input4,5. Bepaling van de precieze verhouding van Mg++ aan Ca++ vereist, echter, is niet triviaal en zelfs bescheiden stimulatie6polysynaptic bijdragen kunnen aanhouden. Een alternatieve benadering genaamd GFP reconstitutie in Synaptic Partners (greep) maakt gebruik van de nabijheid tussen pre-en postsynaptisch membraan gevonden op synapsen afleiden een monosynaptic verbinding 7. Hier, een onderdeel van de groen fluorescente proteïne (GFP) wordt uitgedrukt in een neuron en de aanvullende fragment van het molecuul wordt uitgedrukt in een vermeende postsynaptisch partner. De aanwezigheid van fluorescentie geeft aan dat de twee neuronen zijn genoeg dicht bij toestaan reconstitutie van het GFP-molecuul en impliceert het bestaan van een synaps. GREEP kunt melden synapsen ten onrechte, hoewel, als twee cellen hebben nauw apposed membranen, zoals in een zenuw of fascicle. Varianten van greep elimineren deze valse positieven door het binden van de presynaptische fragment van GFP rechtstreeks naar synaptobrevin, waardoor de reconstitutie alleen op actieve synapsen8. Terwijl greep en zijn varianten instrumentaal zijn bij het bepalen van de functionele connectiviteit in de Drosophila CNS, kunnen sommige verbindingen niet zichtbaar worden gemaakt door greep als de afstanden tussen de pre- en postsynaptisch partners is relatief groot. Dit is vooral relevant bij de beoordeling van volume transmissie neuromodulatie9 of10remming GABAergic zijn gekoppeld.
Hier blijkt een complementaire en nieuwe techniek voor het testen van directe monosynaptic verbindingen in de Drosophila CNS. Deze methode, genaamd tetrodotoxine Engineered weerstand voor indringende Synapses (kerken), werkt door co uitdrukking van de tetrodotoxine (TTX)-resistente natrium-kanaal, NaChBac en een optogenetic activator in een presynaptische cel tijdens het opnemen van vermeende postsynaptisch partners9. In aanwezigheid van de TTX, wordt alle actiepotentiaal-gemedieerde activiteit onderdrukt in cellen dan die uiting van NaChBac. Het NaChBac kanaal herstelt selectief prikkelbaarheid in de gerichte presynaptische cel(len), synaptische transmissie licht-opgeroepen het toelaat. Deze methode maakt sterke activering van de presynaptische neuronen, zodanig dat verbindingen postsynaptically kunnen worden opgelost door somatische opname terwijl het verminderen van de kans op polysynaptic schakelingen te werven. Nog belangrijker is, is deze techniek maakt de studie van volume transmissie en onthult de verspreiding van zender vrijgelaten uit een enkel neuron in een circuit. Bovendien kan de kerken de chemische aard van de verbinding via conventionele farmacologie onthullen. KERKEN is geschikt voor gebruik in elk modelsysteem waarmee de transgene uitdrukking van TTX-ongevoelig natrium kanalen.

<table><tbody><tr><td>UAS-csChrimson</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>55135</td><td>Wordt gebruikt als neurale activator</td></tr><tr><td>UAS-NaChBac</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>9466</td><td>Resotores exciteerbaarheid in cellen in TTX</td></tr><tr><td>Tetrodotoxin</td><td>Tochris</td><td>1078</td><td>Speciale toestemming kan nodig zijn om TTX te kopen, omdat het een gereguleerde stof is</td></tr><tr><td>all trans-Retinal</td><td>Sigma-Aldrichall trans-Retinal</td><td>R2500</td><td>Vereist co-factor voor channelrhodopsin</td></tr><tr><td>Lasbaar 321 roestvrij staal&nbsp;Vel,&nbsp;0.002"&nbsp;Dik,&nbsp;10"&nbsp;Breed</td><td>McMaster Carr</td><td>3254K7</td><td>Wordt gebruikt om een aangepaste vlieghoudster te maken. Aangepaste folie kan worden gelaserd op pololu.com vanuit het geleverde PDF-bestand</td></tr><tr><td>Dissectiemicroscoop</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td>Wordt gebruikt voor het dissecteren van preparaten</td></tr><tr><td>Waxer</td><td>Almore</td><td>Eectra Waxer 66000</td><td>Wordt gebruikt tijdens dissectie om de vlieg in folie vast te zetten</td></tr><tr><td>Paraffinewas</td><td>Joann</td><td>4917217</td><td>Wordt gebruikt met waxer</td></tr><tr><td>Nummer 5 tang</td><td>Fine Science Tools</td><td>#5CO</td><td>Wordt gebruikt voor dissectie en het ontdoen van de schede</td></tr><tr><td>Dissectiescharen</td><td>Fine Science Tools</td><td>15001-08</td><td>Wordt gebruikt om delen van de cuticula te verwijderen tijdens dissectie</td></tr><tr><td>Wolfraamdraad</td><td>A-M Systems</td><td>797500</td><td>Gebruik met elektrolyse om versterkte naalden voor dissectie te maken</td></tr><tr><td>Recirkelende peristaltiekpomp</td><td>Simply Pumps (Amazon)</td><td>PM200S</td><td>voor het recyclen van TTX</td></tr><tr><td>Snelheidsregelaar voor peristaltiekpomp</td><td>Zitrades (Amazon)</td><td>N/A</td><td>PWM-dimregeling voor LED-verlichting of lint, 12 Volt 8 Amp, instelbare helderheidslichtschakelaar dimmregeling DC12V 8A 96W voor ledstripverlichting B</td></tr><tr><td>Versa-Mount&nbsp;Precisie gecomprimeerde luchtregelaar</td><td>McMaster Carr</td><td>1804T1</td><td>Voor het aanbrengen van positieve druk tijdens het patchen</td></tr><tr><td>Glazen capillairen</td><td>World Precision Instruments</td><td>TW150F-3</td><td>Voor patchpipetten</td></tr><tr><td>Multifunctionele meter</td><td>McMaster Carr</td><td>3846K431</td><td>Meter voor drukregelaar</td></tr><tr><td>Elektrofysiologiecamera</td><td>Dage MTI&nbsp;</td><td>IR-1000</td><td>Elke camera die werkt in het IR-bereik (850 nm) zal werken. Je wilt geen rode verlichting gebruiken, omdat dit csChrimson kan activeren</td></tr><tr><td>IR LED</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>M850F2</td><td>Voor schuine verlichting</td></tr><tr><td>vezeloptiek voor IR LED</td><td>Thorlabs</td><td>M89L01</td><td>Koppelt aan IR LED</td></tr><tr><td>Objectieflens&nbsp;</td><td>Olympus 40X</td><td>LUMPlanFLN</td><td>Dit kan op de meeste microscopen worden gebruikt en werkt goed voor het visualiseren van vliegneuronen.</td></tr><tr><td>Bernstein LED</td><td>Thorlabs</td><td>M590L3d</td><td>Voor het visualiseren van RFP en mCherry</td></tr><tr><td>Blauwe LED</td><td>Thorlabs</td><td>M470L3d</td><td>Voor het visualiseren van GFP</td></tr><tr><td>GFP-filterset</td><td>Chroma</td><td>49011</td><td>Voor het visualiseren van GFP of het stimuleren van channel2rhodopsin</td></tr><tr><td>Aangepast mCherry-filterset</td><td>Chroma</td><td>&nbsp;et580/25x en t600lpxr (uit de 49306-set) maar met een et610lp-barrière/emissie-optiek</td><td>Gebruik alleen als u geïdentificeerde neuronen met channel2rhodopsin wilt patchen</td></tr><tr><td>Dichroic om Bernstein en blauwe LED te combineren</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP550R</td><td>Gebruik alleen voor het patchen onder mCherry en het exciteren van channel2rhodopsin met blauw licht.</td></tr><tr><td>Rode LED</td><td>LEDSupply</td><td>Cree XPE 620 - 630 nm</td><td>Wordt gebruikt om csChrimson aan te drijven</td></tr><tr><td>LED-driver</td><td>LEDSupply</td><td>3021-D-E-1000</td><td>Wordt gebruikt om LED's aan te drijven voor optogenetische stimulatie</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-225</td><td>Wordt gebruikt om de pipet tijdens opnames te positioneren</td></tr><tr><td>Patchclamp-versterker</td><td>A-M Systems</td><td>Model 2400</td><td>Een gelijkwaardige versterker is geschikt</td></tr><tr><td>Bessel-filter</td><td>Warner Instruments&nbsp;</td><td>LPF 202A</td><td>Auxiliaire filter dat wordt gebruikt om de stroomspoor naar de oscilloscoop tijdens het patchen te filteren.</td></tr><tr><td>Data-acquisitiesysteem&nbsp;</td><td>National Instruments</td><td>NI PCIe-6321&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 781044-01</td><td>Wordt gebruikt om gegevens van de versterker naar de computer op te nemen</td></tr><tr><td>Connectorblok - BNC-aansluiting BNC-2090A</td><td>National Instruments</td><td>779556-01</td><td>Wordt gebruikt om de versterker aan te sluiten op de DAQ-kaart.</td></tr><tr><td>Stalen folie&nbsp;</td><td>McMaster Carr</td><td>3254K7</td><td>Stalen folie voor aangepaste opnamekamer</td></tr><tr><td>Magneten</td><td>K&amp;J Magnetics</td><td>D42</td><td>Om de opnamekamer aan de ringsteun vast te zetten</td></tr><tr><td>1/16" Cell Cast Acryl Clear</td><td>Pololu</td><td></td><td>Wordt gebruikt om een aangepaste opnamekamer te maken. Acryl kan worden gelaserd op pololu.com vanuit het geleverde PDF-bestand</td></tr></tbody></table>

behandeling van monosynaptic verbindingen in drosophila met behulp van resistente tetrodotoxine natrium kanalen

Examining Monosynaptic Connections in Drosophila Using Tetrodotoxin Resistant Sodium Channels

Hier, wordt een nieuwe techniek genoemd Tetrotoxin (TTX) Engineered weerstand voor indringende Synapses (kerken) toegepast om te testen voor monosynaptic verbindingen tussen neuronen van de doelgroep. De methode is gebaseerd op co uitdrukking van een transgene activator met het tetrodotoxine-resistente natrium-kanaal, NaChBac, in een specifieke presynaptische neuron. Verbindingen met vermeende post synaptic partners worden bepaald door geheel-cel opnames in aanwezigheid van de TTX, die blokken van elektrische activiteit in de neuronen die niet NaChBac doen uitdrukken. Deze aanpak kan worden aangepast voor het werken met elke activator of calcium imaging als een verslaggever van verbindingen. KERKEN wordt toegevoegd aan de groeiende verzameling van hulpprogramma's voor het bepalen van de connectiviteit binnen netwerken. KERKEN is echter uniek in die zin dat zij ook betrouwbaar bulk of volume transmissie en spill-over transmissie verslag.

KERKEN wordt gebruikt om te onderscheiden tussen mono- en polysynaptic bijdragen in synaptic verbindingen tussen neuronen. Terwijl de zwakke stimulatie van een cel kan worden gebruikt voor rechtstreekse verbindingen testen, werft rijden vaak grotere presynaptische activiteit polysynaptic verbindingen (figuur 1A). KERKEN werkt door mede uiting geven aan de TTX-ongevoelig natrium-kanaal NaChBac en een optogenetic-activator, en het testen van verbindingen in aan...

Dit artikel biedt een methode om te testen de monosynaptic verbindingen tussen neuronen door tetrodotoxine en het tetrodotoxine-resistente natrium-kanaal, NaChBac.

Behandeling van Monosynaptic verbindingen in Drosophila met behulp van resistente tetrodotoxine natrium kanalen

Here, a new technique termed Tetrotoxin (TTX) Engineered Resistance for Probing Synapses (TERPS) is applied to test for monosynaptic connections between ...

Het algemene doel van deze techniek is om monosynaptische verbindingen elektrofysiologisch in drosophila te identificeren met behulp van tetrodotoxine-resistente natriumkanalen. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het eenvoudig is en de chemische aard van synapsen kan onthullen. Het is ook geschikt voor de studie van volume- of bulktransmissie.Over het algemeen worstelen we, als we nieuw zijn met deze methode, met video's vanwege de moeilijkheid van de dissectie. Door de methode echter eenvoudig te begrijpen, is de logica gemakkelijk overdraagbaar naar andere modelsystemen zoals muizen. Voor de opnames, gebruik patch pipetten voor de weerstand van bijna zeven megaohm.Heb ook externe opnamezoutoplossing met een pH van 7,3 of minder, continu belucht met carbogen dat 95% zuurstof en 5% koolstofdioxide bevat. Voor de proefpersonen, gebruik een vliegenstam die csChrimson tot expressie brengt, vermeerderd op voedsel dat 0,2 millimolar bevat van alle trans-Retinal. Voor de opnames, selecteer volwassenen van een tot drie dagen oud.Laad ze in een glazen scintillatieglas en immobiliseer het door het een minuut bloot te stellen aan ijskoude omstandigheden. Verlaag vervolgens het lichtniveau op de dissectiescoop en grove pincetten om een verdoofde vlieg in de op maat gemaakte opnamekamer te laden. Zet de vlieg vast aan de kamer door deze te omringen met was of UV-uithardbare epoxy.Plaats het met de dorsale kant omhoog met het folie ongeveer halverwege de thorax. De sleutel tot het verkrijgen van een geweldige voorbereiding is het hebben van het gat in het folie dat precies de juiste maat heeft, zodat de vlieg niet wordt geperst of door kan vallen. Verlicht de voorbereiding met optische vezelverlichting van beide kanten en houd ze zo zwak mogelijk.Bedek vervolgens de voorbereiding met vier tot zes druppels opnamezoutoplossing. Maak vervolgens de tungsteendraad of het gloeidraadje scherp voor de dissectie. Pas ongeveer 20 volt wisselstroom toe op een kaliumnitraatverzadigde oplossing en dompel het uiteinde van de draad snel herhaaldelijk in de oplossing.Na 20 doppen zal het uiteinde scherp zijn. Pas nu de verlichting aan om voldoende zichtbaarheid te bieden om de scherpe draad te gebruiken om de hersenen bloot te leggen door de cuticula te verwijderen, gevolgd door de luchtpijp en vetlichamen. Gebruik een gebogen tungsteendraad om de antenne voorzichtig onder de folieschild te plaatsen om de antennelobben te bereiken.Gebruik vervolgens scherpe pincetten om voorzichtig de glialaag te verscheuren die het gebied van belang bedekt. Breng nu de voorbereiding over naar de elektrofysiologie rig om opnames te maken. Bij de rig, begin onmiddellijk met het perfunderen van de voorbereiding met opnamezoutoplossing, gebuisd met carbogen.Gebruik een door zwaartekracht gevoede zoutoplossingsreservoir boven het microscoopplatform. Gebruik een vacuümlijn en een fles van 2 liter om de afvalzoutoplossing op te vangen. Laad vervolgens de patch pijp met 4 microliters interne opnameoplossing en bevestig de pijp aan een micromanipulator.Nullen vervolgens de offset van de versterker en stel de versterker in om testpulsen te leveren. Pas vervolgens IR schuine verlichting aan om een duidelijk zicht op de hersenen te krijgen. Terwijl u positieve druk op de pijp toepast, nadert u de cel met de pijp.Wanneer contact met de cel wordt gemaakt, laat u de positieve druk los om de pijp af te sluiten op het membraan. Stel vervolgens het houdpotentiaal van het membraan in op min 60 millivolt. De pijp moet een gigaohm-afsluiting vormen met het celmembraan.De houdstroom moet dalen tot een zo laag mogelijk sub-picoamp niveau. Om constante gigaohm-afsluitingen te verkrijgen, zorg ervoor dat u uw pijp schoon houdt door positieve druk te houden en vermijd het raken van weefsel of het naderen van uw cellen. Stel de versterker in om testpulsen te leveren van min 50 tot min 60 millivolt.De testpulsen zullen een grote capacitieve overgang tonen die de stroom vertegenwoordigt die nodig is om de patch pijp op te laden. Om de capacitieve overgang te verwijderen, pas de capaciteitscompensatieknoppen op de versterker aan. Pas nu korte pulsen van negatieve druk toe om het celmembraan te scheuren en de hele celconfiguratie te verkrijgen.Een grote toename in de capacitieve overgang duidt op succes. Een kleine toename in de houdstroom zou ook moeten worden waargenomen. Stel vervolgens de versterker in op stroomklemmodus.En pas het potentiaal van de cel aan op tussen min 50 en min 60 millivolt. Configureer in voorbereiding het data-acquisitiesysteem zoals aangegeven in het protocol van de technicus. Het systeem vereist een krachtige rode LED die onder de voorbereiding is gepositioneerd om de vlieg te verlichten met 0,238 milliwatt per vierkante millimeter.Activeer nu de presynaptische neuronen optogenetisch, met behulp van gepulseerd rood licht in csChrimson-expressie. Andere methoden kunnen ook worden gebruikt. Voordat tetrodotoxine wordt toegepast, zou een synaptische verbinding zichtbaar moeten zijn als reactie op een lichtpuls van 40 milliseconden.Geen reactie betekent dat een verbinding onwaarschijnlijk is. Het houdpotentiaal kan worden aangepast om de excitatoire of inhibitoire verbindingen te benadrukken, dienovereenkomstig. Zodra een verbinding is geverifieerd, stel de zoutoplossingsovervloed in voor hercirculatie bij de zoutoplossing.Stel de pomp in zodat het zoutoplossingsniveau in het bad stabiel blijft. Voeg vervolgens voldoende tetrodotoxine toe aan het systeem voor een uiteindelijke concentratie van één micromolar. Dit zou de spiking-activiteit van de gepatchte neuron moeten stoppen.Indien niet, voeg meer tetrodotoxine toe aan het systeem. Pas nu korte pulsen van rood licht toe om waarschijnlijk een monosynaptische verbinding te activeren. Ga vervolgens verder met het toevoegen van farmacologische antagonisten aan de circlerende zoutoplossing om de chemische aard van de synaptische verbindingen te testen.</

examining-monosynaptic-connections-drosophila-using-tetrodotoxin

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier beschrijven we elektrofysiologische methoden voor het meten van synaptische transmissie bij de neuromusculaire junctie van Drosophila larve. Evoked release wordt kunstmatig geïnitieerd door het stimuleren van de motorische neuron axonen, en de transmissie door middel van de NMJ kan worden gemeten door de postsynaptische respons opgeroepen in de spier.

Elektrofysiologische methoden voor opname Synaptic Potentials van de NMJ van Drosophila Larven

Deze procedure maakt gebruik van een blauw licht geactiveerd algen kanaal en cel-specifieke genetische expressie tools om synaptische potentialen op te roepen met lichtpulsen op de neuromusculaire junctie (NMJ)...

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulatie van synaptische Potentials op Drosophila Neuromusculaire verbindingen

Elektrofysiologische opname in de Drosophila Embryo

Dissectie en Imaging van Active Zones in de Drosophila Neuromusculaire Junction

This video demonstrates testing monosynaptic connections using a transgenic fly. The fly has tetrodotoxin-resistant sodium channels and red light-activated channels in its presynaptic neurons, which are optogenetically excited to transmit signals to postsynaptic neurons.

Testing Monosynaptic Connections Using Tetrodotoxin and Tetrodotoxin-Resistant Sodium Channels

This video demonstrates the technique for recording synaptic currents from a synaptic bouton at the Drosophila larva's neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton, which is important for the study of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Recording Synaptic Currents at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Hier beschrijven we een eenvoudige en breed toegankelijke methode om segmentale zenuwen in Drosophila larven te beschadigen om neurodegeneratie van motorische neuronen bij de neuromusculaire verbinding (NMJ) van derde instar larven te visualiseren en te kwantificeren.

Een eenvoudige neurologische mechanische letselmethode om te bestuderen<em&gt; Drosophila</em&gt; Motor Neuron Degeneration

Synaptic stromingen kunnen focally worden opgenomen van de gevisualiseerde synaptic los op de Drosophila derde instar larven motorische eindplaat. Deze techniek maakt het mogelijk de activiteiten van een enkele synaptic bouton worden gecontroleerd.

Focal Macropatch opnames van Synaptic stromingen uit de larvale Drosophila motorische eindplaat

We beschrijven een methode voor het retrograde traceren van de Drosophila embryonale motorneuronen met behulp van lipofiele fluorescerende kleurstoffen.

Retrograde tracing van Drosophila embryonale motor neuronen met behulp van lipofiele fluorescerende kleurstoffen

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om de microtubuli-netwerken in neuromusculaire knooppunten en spiercellen te visualiseren. In combinatie met de krachtige genetische hulpmiddelen van Drosophila melanogaster, vergemakkelijkt dit protocol de genetische screening en de analyse van de microtubuli-dynamiek aanzienlijk voor de rol van regulerende eiwitten van het microtubuli-netwerk in het zenuwstelsel.

Drosophila-larvale neuromusculaire junctie en spiercellen gebruiken om het netwerk van microtubuli te visualiseren

Dit protocol beoordeelt functionele synaptische activiteit tussen gedefinieerde neuronale partners in vivo in het centrale zenuwstelsel van Drosophila melanogaster-larven met behulp van genetisch gecodeerde instrumenten. CsChrimson-gemedieerde optogenetische stimulatie van presynaptische cIVda-sensorneuronen induceert calciumafhankelijke fotoconversie van CaMPARI in postsynaptische Basin-4 interneuronen.

Functionele karakterisering van individuele pre- en postsynaptische partners in het centrale zenuwstelsel van de Drosophila-larve met behulp van CaMPARI

Leer monosynaptische verbindingen identificeren in Drosophila met behulp van tetrodotoxine-resistente natriumkanalen. Deze elektrofysiologische methode onthult de chemische aard van synapsen en neurale connectiviteit.

Behandeling van Monosynaptic verbindingen in Drosophila met behulp van resistente tetrodotoxine natrium kanalen

Meer video's verkennen