Name: Hoge resolutie respirometrie voor het meten van mitochondriale functie van Intact Beta-cellen in de aanwezigheid van natuurlijke verbindingen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Leer hoe je hoge-resolutie respirometrie toepast om mitochondriale functie te meten in intacte 832/13 bètacellen onder insuline-stimulerende omstandigheden. Deze methode helpt onderzoekers de effecten van natuurlijke verbindingen op celademhaling te evalueren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs bedank leden van de Tessem en Hancock labs voor assistent en wetenschappelijke discussie. De auteurs bedanken Andrew Neilson, PhD (Virginia Tech) voor het verstrekken van de cacao afgeleide Epicatechine monomeer breuk. Deze studie werd gesteund door een subsidie van de Diabetes Action Research en Education Foundation naar JST.

1. de celkweek
<ol><li>Cultuur INS-1 afgeleide 832/13 beta cellen in RPMI 1640 aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 1% penicilline-streptomycine, 10 mM HEPES, 2 mM Glutamine, 1 mM natrium pyruvaat en 0.05 mM 2-mercaptoethanol9,10,11 ,12,13.</li>
	<li>832/13 cellen verwijderen uit een T75 kolf met behulp van 2 mL van 0,25% trypsine, incuberen bij 37 ° C gedurende 10 min. neutraliseren trypsine door 8 mL van volledige RPMI 1640-media toe te voegen.</li>
	<li>Met behulp van een hemocytometer cellen tellen en Verdun 100 µL van het volume van de cel uit stap 1.2 in 900 µL van PBS.</li>
	<li>Plaat 832/13 cellen bij een dichtheid van 2 x 106 cellen/mL in een 6 schotel goed.</li>
	<li>Cultuur cellen gedurende 48 uur in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2 voordat u begint met ademhaling experimenten.</li>
</ol>2. voorbereiding van cellen met een hoge resolutie respirometrie
<ol><li>
Het behandelen van 832/13 cellen met cacao afgeleide Epicatechine monomeer.
	<ol>
<li>Cultuur 832/13 cellen gedurende 24 uur na de beplating in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2.</li>
		<li>Wijzig media 24u na plating en 832/13 cellen met controle van het voertuig (3 wells) of 100 nM cacao monomeer (3 wells), gevolgd door de cultuur voor een aanvullende 24 h (totaal 48 h) in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2behandelen.</li>
		<li>832/13 cellen in 1 x lage Glucose secretie Assay Buffer (GAB) voor 5 min. Aspirate buffer wassen en incubeer 832/13 cellen in 1 x lage Glucose SAB gedurende 3 uur, 1 x lage Glucose SAB wijzigen elk uur.<ol>
<li>Maak 10 x SAB met 33.32 g NaCl, 1,73 g van KCl, KH2PO4, 0.7 g van MgSO4 0.82 g en H2O toevoegen aan een eindvolume van 500 mL. Steriel filter de uiteindelijke oplossing.</li>
			<li>Maak 1 x lage Glucose SAB met 10 mL 10 x SAB, 100 µL van 45% glucose, 1 M HEPES, 1 mL 2 mL van 0,25 M CaCl2, 0,57 mL van 35% BSA-oplossing, 0.21 NaHCO3 g en H2O tot een eindvolume van 100 mL toe te voegen. Steriel filter de uiteindelijke oplossing.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Het behandelen van 832/13 cellen met curcumine.
	<ol>
<li>Cultuur 832/13 cellen voor 48 h na beplating in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2.</li>
		<li>832/13 cellen in 1 x lage Glucose SAB voor 5 min. Aspirate buffer wassen en incubeer 832/13 cellen in 1 x lage Glucose SAB gedurende 3 uur, 1 x lage Glucose SAB wijzigen elk uur.</li>
		<li>Na 2,5 uur de incubatietijd van 3 h in 1 x lage Glucose SAB gecombineerd buffer en incubeer cellen in 1 x lage Glucose SAB met controle van het voertuig of 40 µM curcumine voor 30 min. Na incubatie, gecombineerd de buffer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Oogsten van cellen met trypsine voor hoge resolutie respirometrie
	<ol>
<li>Na de incubatie 3U in 1 x lage Glucose SAB, de cellen van de plaat met 250 µL van 0,25% trypsine per putje te verwijderen.</li>
		<li>De cellen in trypsine van 3 putten behandeld met controle van het voertuig of samengestelde van belang met 4 mL SAB in een conische tube van 15 mL combineren.</li>
		<li>Met behulp van een hemocytometer cellen tellen en Verdun 100 µL van het volume van de cel uit stap 2.3.2 in 900 µL van PBS.</li>
		<li>Verdun het juiste aantal cellen in 1 x lage Glucose GAB 3 mL maken met de geschikte concentratie voor elke kamer. De gegevens blijkt dat een concentratie van 1 x 106 cellen/mL het meest effectief.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Oogsten van cellen met mechanische dissociatie voor hoge resolutie respirometrie
	<ol>
<li>Na de incubatie 3U in 1 x Voeg lage Glucose GAB, 1 mL 1 x lage Glucose SAB aan elk goed en zachtjes blazen cellen uit de plaat met mechanische dissociatie door pipetteren met een 1000 µL pipette uiteinde.</li>
		<li>De cellen van 3 putten behandeld met controle van het voertuig of samengestelde van belang in een totaal van 3 mL SAB in een conische tube van 15 mL voor ademhaling te combineren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. hoge resolutie respirometrie
<ol><li>Voorbereiding van de hoge-resolutie respirometer.
	<ol>
<li>De hoge resolutie respirometer inschakelen en verbinding maken met het bureaublad door de lancering van de respirometer analyseprogramma.</li>
		<li>Gecombineerd 70% ethanol uit beide kamers. Geniet van deze kamers in 70% ethanol voor minimaal 45 min.</li>
		<li>De kamers met 70% ethanol, zuigen na elke stap twee keer wassen.</li>
		<li>Wassen van de kamers driemaal met ddH2O, zuigen na elke stap.</li>
		<li>Spoel de kamer plunjers in ddH2O. Dit reinigt uit residuele ethanol uit de plunjers en de titanium-poort.</li>
	</ol></li>
	<li>Kalibratie van polarographic zuurstofsensoren.
	<ol>
<li>2.4 mL 1 x lage Glucose SAB buffer toevoegen aan elke oxygraph kamer, roeren de buffer voortdurend met behulp van magnetische roer bars in de kamer op 750 rpm en 37 ° C met een gegevens-opname-interval op 2.0 s door op de F7 te drukken en het tabblad te openen met het label "Systemen". Duw plunjers helemaal in, en klik vervolgens met de instelling van de beluchting moersleutel intrekken. Laat de machine equilibreer gedurende een minimum van 1 uur tot stabiele zuurstof flux is verkregen.</li>
		<li>Stel de machine bij 37 ° C voor de duur van het experiment. Polarisatie spanning ingesteld op 800 mV, met een winst van 2 door op de F7 te drukken en het tabblad met het label "Zuurstof, O2"te openen. Equilibreer de zuurstofconcentratie van de GAB buffer gedurende ten minste 30 minuten, terwijl de verandering in zuurstofconcentratie stabiel is (minder dan 2 pmol/(s*mL)).</li>
		<li>Selecteer een regio waar de verandering van de zuurstofconcentratie stabiel is om achtergrond meting van de verandering in zuurstofconcentratie na de stabilisatie van de concentratie van zuurstof.<ol>
<li>Selecteer een gebied door indrukken van de shift-toets, linker muisknop te klikken op de muis en slepen met de muis in de geselecteerde regio. Klik op de letter die is gekoppeld aan de geselecteerde regio en verandering "R1" voor elke trace, overeenkomt met elk van de twee kamers.</li>
			<li>Tweevoudig tikken voort naar de vak "O2 van kalibratie" op de bodem verlaten en rechts van de hoeken van het scherm, klik op de knop "Selecteer mark" voor de "lucht kalibratie" als R1 en selecteer vervolgens "kalibreren en naar Klembord kopiëren" voor beide kamers.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Evaluatie van de ademhaling van 832/13 beta cellen voorbereid in stappen 2.1.5 of 2.2.5.
	<ol>
<li>Laden van 2,4 mL van het monster in elke kamer (één kamer met controle voertuig behandeld cellen, één kamer met samengestelde behandelde cellen) in 1 x lage Glucose SAB. 0,5 mL van cel monster voor eiwit kwantificatie door BCA (Bicinchoninic zuur) assay behouden, indien met behulp van de mechanische dissociatie aanpak (bevriezing bij-20 ° C voor later meting).<ol>
<li>Duw van de plunjer helemaal en het restvolume gecombineerd. Roer de cellen continu tijdens het experiment op 750 rpm en 37 ° C voor alle volgende stappen. Een merk maken door te klikken op F4 en labelen als "cellen" Wanneer monsters worden geladen.</li>
			<li>De monsters van de maatregel voor 30 min. Na stabilisatie van het signaal, selecteert u een regio van de verandering in zuurstofgehalte overeenkomt met de voorwaarden van de lage glucose (2.5 mM glucose) zoals beschreven in 3.2.3.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Na stabilisatie van het signaal is bereikt, toevoegen 12,5 µL van een 45% steriele glucose-oplossing (16.7 mM eindconcentratie) in elke kamer via de titanium poort met behulp van een injectiespuit te laden. Maak die een mark "Glucose" als beschreven in 3.3.1 gemeten wanneer behandeling wordt toegevoegd. Laat signaal stabiliseren en opnemen van cellulaire ademhaling totdat een stabiele zuurstof stroom is bereikt. Selecteer deze regio van de verandering in zuurstofconcentratie, zoals beschreven in 3.2.3. Dit is de 16.7 mM Glucose lezing, en komt overeen met stimulerend voorwaarden7.</li>
		<li>Na stabilisatie van het signaal is bereikt Voeg 1 µL van 5mM oligomycin een (2,5 µM eindconcentratie) in elke kamer via de poort van het laden. Maak die een mark "OligoA" als beschreven in 3.3.1 gemeten wanneer behandeling wordt toegevoegd. Laat signaal stabiliseren en opnemen van cellulaire ademhaling totdat een stabiele zuurstof stroom is bereikt. Selecteer dit gebied van de curve zoals beschreven in 3.2.3. Oligomycin A remt ATP-synthase en is dus de enige zuurstof flux die zich voordoen via lekken van elektronen en niet oxidatieve fosforylatie7.</li>
		<li>Na stabilisatie van het signaal is bereikt toevoegen 1 mM FCCP in 1 µL stappen tot een maximale ademhalingsfrequentie is gevestigd. Dit betekent maximale afgekoppeld ademhaling. Tussen de 3-4 µL is FCCP voldoende (1,5-2,0 µM eindconcentratie) voor het opwekken van maximale afgekoppeld ademhaling van INS-1 832/13 cellen. Maak een markering met het label "FCCP" zoals beschreven in 3.3.1 wanneer de behandeling wordt toegevoegd. Laat signaal stabiliseren en opnemen van cellulaire ademhaling totdat een stabiele zuurstof stroom is bereikt. Selecteer dit gebied van de curve zoals beschreven in 3.2.3. FCCP is een ontkoppelingseiwit agent. Dit kan we meten afgekoppeld ademhaling7.</li>
		<li>Na stabilisatie van het signaal is bereikt toevoegen 1 µL van 5 mM Antimycin A (2,5 µM eindconcentratie) in elke kamer via de poort laden. Maak een markering met het label "AntiA" zoals beschreven in 3.3.1 wanneer de behandeling wordt toegevoegd. Laat signaal stabiliseren en opnemen van cellulaire ademhaling totdat een stabiele zuurstof stroom is bereikt. Selecteer dit gebied van de curve zoals beschreven in 3.2.3. Opmerking: Antimycin A bindt cytochroom C reductase, remt ubiquinone oxidatie en blokkeert alle ademhaling. Dit laat ons ademhaling7volledig te stoppen.</li>
	</ol></li>
	<li>Het meten van 832/13 beta cellen voor eiwit concentratie en ademhaling normalisatie.
	<ol>
<li>Met behulp van de 0,5 mL van het monster bewaard laden, maatregel eiwitSteekproef met behulp van de methode BCA13.</li>
		<li>Elk monster in drievoud, zonder verdunning, na instructies van de fabrikant worden uitgevoerd.</li>
	</ol></li>
	<li>832/13 bèta cel ademhaling berekeningen van trypsinized cellen.<ol>
<li>Voer het aantal cellen per mL gebruik in de analyse door het indrukken van de knop van de F3 van de respirometer analyseprogramma. De maateenheid wijzigen in cellen/mL, voer de cellulaire concentratie en middellange omzetten in SAB.</li>
		<li>Selecteer achtergrond lezingen te normaliseren van de gegevens door te selecteren en het aangaan van de O-2 kalibratie vorm zoals beschreven in 3.2.3.</li>
		<li>Maak selecties van lezingen van 2,5 mM Glucose, 16.7 mM Glucose, Oligomycin A, FCCP en Antimycin A zoals beschreven in 3.3.1.</li>
		<li>Binnen de respirometer analyseprogramma, exporteert u de lezingen voor elke kamer na invoeren van eiwitconcentratie en selecteren van de juiste gemiddelde waarden voor elke behandeling tijdens de meting van de ademhaling. Dit wordt gedaan door te klikken op F2 en vervolgens duwen het "kopiëren naar Klembord-functie". Zo exporteert u de gegevens voor gebruik in andere programma's van analyse. De "O2 helling neg."-waarden gebruiken voor berekeningen.</li>
		<li>Gegevens verzamelen voor 3-5 onafhankelijke loopt van voertuig behandeld besturingselementen en natuurlijke verbindingen behandelde cellen om te bepalen van het effect op intact cellulaire ademhaling van INS-1 832/13 beta cellen.</li>
	</ol></li>
	<li>832/13 bèta cel ademhaling berekeningen van mechanisch losgekoppeld cellen.<ol>
<li>Voer de eiwit-berekeningen van de BCA-bepaling door het indrukken van de knop van de F3 van de respirometer analyseprogramma. De maateenheid wijzigen in mg, voer de BCA-concentratie en middellange omzetten in SAB.</li>
		<li>Selecteer achtergrond lezingen te normaliseren van de gegevens door te selecteren en het aangaan van de O-2 kalibratie vorm zoals beschreven in 3.2.3.</li>
		<li>Maak selecties van lezingen van 2,5 mM Glucose, 16.7 mM Glucose, Oligomycin A, FCCP en Antimycin A zoals beschreven in 3.3.1.</li>
		<li>Binnen de respirometer analyseprogramma, exporteert u de lezingen voor elke kamer na invoeren van eiwitconcentratie en selecteren van de juiste gemiddelde waarden voor elke behandeling tijdens de meting van de ademhaling. Dit wordt gedaan door te klikken op F2 en vervolgens duwen het "kopiëren naar Klembord-functie". Zo exporteert u de gegevens voor gebruik in andere programma's van analyse. De "O2 helling neg."-waarden gebruiken voor berekeningen.</li>
		<li>Gegevens verzamelen voor 3-5 onafhankelijke loopt van voertuig behandeld besturingselementen en natuurlijke verbindingen behandelde cellen om te bepalen van het effect op intact cellulaire ademhaling van INS-1 832/13 beta cellen.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Mueckler, M., Thorens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SLC2+%28GLUT%29+family+of+membrane+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Aspects+Med%22%5BJournal%5D)">The SLC2 (GLUT) family of membrane transporters.</a> Mol Aspects Med. 34 (2-3), 121-138 (2013).</li>
<li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444 (7121), 840-846 (2006).</li>
<li>Weir, G. C., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five+stages+of+evolving+beta-cell+dysfunction+during+progression+to+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Five stages of evolving beta-cell dysfunction during progression to diabetes.</a> Diabetes. 53 Suppl 3, S16-S21 (2004).</li>
<li>Strat, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+by+which+cocoa+flavanols+improve+metabolic+syndrome+and+related+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanisms by which cocoa flavanols improve metabolic syndrome and related disorders.</a> J Nutr Biochem. 35, 1-21 (2016).</li>
<li>Rowley, T. J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomeric+cocoa+catechins+enhance+%CE%B2-cell+function+by+increasing+mitochondrial+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr+Biochem%22%5BJournal%5D)">Monomeric cocoa catechins enhance β-cell function by increasing mitochondrial respiration.</a> J Nutr Biochem. 49, 30-41 (2017).</li>
<li>Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+Respirometry+to+Assess+Mitochondrial+Function+in+Permeabilized+and+Intact+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells.</a> J Vis Exp. (120), (2017).</li>
<li>Reynolds, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Cell+deletion+of+Nr4a1+and+Nr4a3+nuclear+receptors+impedes+mitochondrial+respiration+and+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">beta-Cell deletion of Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors impedes mitochondrial respiration and insulin secretion.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 311 (1), E186-E201 (2016).</li>
<li>Hals, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Respiration+in+Insulin-Producing+beta-Cells%3A+General+Characteristics+and+Adaptive+Effects+of+Hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Respiration in Insulin-Producing beta-Cells: General Characteristics and Adaptive Effects of Hypoxia.</a> PLoS One. 10 (9), e0138558(2015).</li>
<li>Ray, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nkx6.1-mediated+insulin+secretion+and+beta-cell+proliferation+is+dependent+on+upregulation+of+c-Fos%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Nkx6.1-mediated insulin secretion and beta-cell proliferation is dependent on upregulation of c-Fos.</a> FEBS Lett. 590 (12), 1791-1803 (2016).</li>
<li>Schisler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+human+and+rat+islet+beta-cell+proliferation+with+retention+of+function+by+the+homeodomain+transcription+factor+Nkx6.1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1.</a> Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).</li>
<li>Tessem, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nkx6.1+regulates+islet+beta-cell+proliferation+via+Nr4a1+and+Nr4a3+nuclear+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nkx6.1 regulates islet beta-cell proliferation via Nr4a1 and Nr4a3 nuclear receptors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (14), 5242-5247 (2014).</li>
<li>Hobson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+Kinase+A+is+critical+for+the+Nkx6.1+mediated+beta-cell+proliferation+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Aurora Kinase A is critical for the Nkx6.1 mediated beta-cell proliferation pathway.</a> Islets. 7 (1), e1027854(2015).</li>
<li>Draney, C., Hobson, A. E., Grover, S. G., Jack, B. O., Tessem, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdk5r1+Overexpression+Induces+Primary+beta-Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">Cdk5r1 Overexpression Induces Primary beta-Cell Proliferation.</a> J Diabetes Res. 2016, 6375804(2016).</li>
<li>Rouse, M., Younes, A., Egan, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resveratrol+and+curcumin+enhance+pancreatic+beta-cell+function+by+inhibiting+phosphodiesterase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Resveratrol and curcumin enhance pancreatic beta-cell function by inhibiting phosphodiesterase activity.</a> J Endocrinol. 223 (2), 107-117 (2014).</li>
<li>Ma, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+reduces+beta-cell+mitochondria+and+induces+distinct+morphological+abnormalities%2C+which+are+reproducible+by+high+glucose+in+vitro+with+attendant+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Diabetes reduces beta-cell mitochondria and induces distinct morphological abnormalities, which are reproducible by high glucose in vitro with attendant dysfunction.</a> Islets. 4 (3), 233-242 (2012).</li>
<li>Chavanelle, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+high-intensity+interval+training+and+moderate-intensity+continuous+training+on+glycaemic+control+and+skeletal+muscle+mitochondrial+function+in+db%2Fdb+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Effects of high-intensity interval training and moderate-intensity continuous training on glycaemic control and skeletal muscle mitochondrial function in db/db mice.</a> Sci Rep. 7 (1), 204(2017).</li>
<li>Jelenik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Insulin+Resistance+in+Primary+and+Secondary+Nonalcoholic+Fatty+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Insulin Resistance in Primary and Secondary Nonalcoholic Fatty Liver.</a> Diabetes. 66 (8), 2241-2253 (2017).</li>
<li>Spacek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-stimulated+insulin+secretion+of+insulinoma+INS-1E+cells+is+associated+with+elevation+of+both+respiration+and+mitochondrial+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Glucose-stimulated insulin secretion of insulinoma INS-1E cells is associated with elevation of both respiration and mitochondrial membrane potential.</a> Int J Biochem Cell Biol. 40 (8), 1522-1535 (2008).</li>
<li>Jezek, J., Dlaskova, A., Zelenka, J., Jaburek, M., Jezek, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4623989/">H2O2-Activated Mitochondrial Phospholipase iPLAgamma Prevents Lipotoxic Oxidative Stress in Synergy with UCP2, Amplifies Signaling via G-Protein-Coupled Receptor GPR40, and Regulates Insulin Secretion in Pancreatic beta-Cells.</a> Antioxid Redox Signal. 23 (12), 958-972 (2015).</li>
<li>Johnson, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppressed+insulin+signaling+and+increased+apoptosis+in+CD38-null+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Suppressed insulin signaling and increased apoptosis in CD38-null islets.</a> Diabetes. 55 (10), 2737-2746 (2006).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De doelstelling van dit protocol is te gebruiken met een hoge resolutie respirometrie voor het meten van respiratoire tarieven in intact alvleesklier beta-cellen. Met deze methode kan de meting van de bèta cel-reactie op meer glucoseniveaus. Het protocol voorziet ook de voorbehandeling met verschillende verbindingen, zoals blijkt uit dit protocol met de natuurlijk voorkomende monomeer Epicatechine of curcumine4,5. Behandeling met ...

Het primaire doel van de alvleesklier beta cel is om systeem normoglycemia door glucose-gestimuleerd insuline secretie. De beta-cellen zin fysiologische veranderingen in het circulerende glucose grotendeels te wijten aan de lage affiniteit, hoge capaciteit glucose transporter GLUT2 (Glucose Transporter 2, Km 16.7 mM)1. Als bloedsomloop glucoseniveaus stijgen, vergemakkelijkt deze hoge capaciteit laag-affiniteit vervoerder een evenredige toename van de intracellulaire glucose binnen de beta-cel. Glucose wordt gemetaboliseerd door glycolyse, de TCA cyclus (tricarboxylic acid cyclus) en de mitochondriale ademhaling, wat resulteert in verhoogde cellulaire concentraties van de ATP (adenosinetrifosfaat). De verhoogde concentratie van ATP blokkeert de ATP gevoelige K+ kanalen, leidt tot membraan depolarisatie. Membraan depolarisatie zorgt ervoor dat de opening van de spanning gated Ca2 + kanalen en latere release van vesikel gebonden insuline korrels2. Beta cel dysfunctie is een kenmerk van Type 2 Diabetes (T2D), en resulteert in verminderde en slecht gecontroleerde insuline secretie en uiteindelijk bèta cel dood3. Mechanismen die handhaven of te verbeteren van beta cel functie kunnen worden gebruikt als een behandeling voor T2D.
Studies hebben aangetoond dat de gunstige effecten van natuurlijk voorkomende stoffen op basis van planten op de alvleesklier bèta cel4. Deze verbindingen hebben hun effect door toenemende beta celproliferatie, overleving, of de glucose-gestimuleerd insuline secretie. Als voorbeeld, hebben recente studies aangetoond dat monomeer Epicatechine glucose-gestimuleerd insuline secretie verbetert door verhoging van de mitochondriale ademhaling en verhoging van cellulaire ATP5niveaus. Daarom begrijpen hoe deze samenstellingen kunnen het verhogen van functionele bèta cel massa is belangrijk om de invloed van deze stoffen als potentiële therapeutics.
Cellular respiration kan worden gemeten door middel van een aantal tools. Gebruik van een hoge-resolutie respirometer zorgt voor de titratie van chemische modulatoren naar een permeabel of intact cel bevolking6. Dit hulpprogramma staat de toevoeging van verschillende stoffen, bij verschillende concentraties, waardoor een breed scala van informatie.
Gezien de intieme verbinding tussen glucose metabolisme en bèta-cel functie, staan metingen van cellulaire ademhaling kritisch tegenover. Metingen van cellulaire ademhaling kunnen worden gedaan met dat permeabel ofwel intact beta-cellen, elk met een eigen set van voordelen en nadelen van de7,8. Terwijl permeabilization van beta cellen kan men meet verschillende aspecten van de keten elektronentransport, doet zij dit zonder betrekking tot het mechanisme voor de ademhaling in het beta-cel, de glucose-opname en het metabolisme induceren. Dus, gebruik van unpermeabilized bèta cel ademhaling is een zeer handige techniek om te bepalen van de reactie van de beta-cellen op verschillende niveaus van de bloedglucose, met behulp van zuurstofverbruik als de uitlezing.
Het doel van deze techniek is voor het meten van zuurstofverbruik in intact INS-1 afgeleide 832/13 beta cellen. Deze techniek laat toe te bepalen van de reactie van de beta-cellen op voorwaarden van de unstimulatory glucose (2.5 mM glucose) en stimulerend glucose voorwaarden (16.7 mM glucose). Terwijl de unpermeabilized cellen niet toestaan ons te testen afzonderlijk complex I, II of III van het elektron vervoeren keten, de techniek staat u toe om metingen te maken met complexe IV remming (Oligomycin A), rekken ademhaling (FCCP-Carbonyl cyanide- 4- phenylhydrazone (trifluormethoxy)), en volledig geremd ademhaling (Antimycin A). Deze studie toont aan dat de werkzaamheid van het meten van de ademhaling in intact unpermeabilized alvleesklier beta cellen, alsmede het effect van twee natuurlijk voorkomende verbindingen, monomere epicatechine en curcumine, op bèta cel ademhaling.

<table><tbody><tr><td>O2k Core: Oxygraph-2k</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>Instrument voor hoge resolutie respirometrie</td></tr><tr><td>DatLab 6 Program</td><td>Oroboros Instruments</td><td>27141-01</td><td>Computerprogramma voor het analyseren van hoge resolutie respirometrie</td></tr><tr><td>INS-1 832/13 cellijn</td><td>Duke University Medical Center</td><td>NONE</td><td>Beta cellijn, geschenk van Dr. Christopher Newgard</td></tr><tr><td>Curcumine</td><td>Sigma</td><td>C7727</td><td>Voorbereiding van beta cellen</td></tr><tr><td>Cocoa epicatechine monomeer</td><td>Virginia Polytechnic Institute and State University</td><td>NONE</td><td>Voorbereiding van beta cellen, geschenk van Dr. Andrew Neilson</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td>Voor celcultuur</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>832/13 beta cel media</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>832/13 beta cel media component</td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P4458</td><td>832/13 beta cel media component</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3662</td><td>832/13 beta cel media component/ 1x SAB Buffer</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Caisson</td><td>GLL01</td><td>832/13 beta cel media component</td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Sigma</td><td>S8636</td><td>832/13 beta cel media component</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>832/13 beta cel media component</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271</td><td>Component van 10x SAB buffer</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>Component van 10x SAB buffer</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>Component van 10x SAB buffer</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td>Component van 10x SAB buffer</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose oplossing</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>Component van 1x SAB buffer, chemisch voor ademhalingstest</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C5670</td><td>Component van 1x SAB buffer</td></tr><tr><td>35% BSA oplossing</td><td>Sigma</td><td>A7979</td><td>Component van 1x SAB buffer</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Component van 1x SAB buffer</td></tr><tr><td>200 proof ethanol</td><td>Sigma</td><td>459844</td><td>Wassen van Oxygraph O2k Kamers</td></tr><tr><td>Oligomycine A</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td>Chemicaliën voor ademhalingstest</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td>Chemicaliën voor ademhalingstest</td></tr><tr><td>Antimycine A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td>Chemicaliën voor ademhalingstest</td></tr><tr><td>BCA Proteïne Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>23225</td><td>Voor het bepalen van de proteïneconcentratie</td></tr></tbody></table>

hoge resolutie respirometrie voor het meten van mitochondriale functie van intact beta-cellen in de aanwezigheid van natuurlijke verbindingen

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

Hoge resolutie respirometrie zorgt voor het meten van zuurstofverbruik van geïsoleerde mitochondriën, cellen en weefsels. Beta-cellen spelen een cruciale rol in het lichaam door de controlerende bloedglucosespiegels door insuline secretie in reactie op verhoogde glucose concentraties. Insuline secretie wordt gecontroleerd door het glucose metabolisme en mitochondriale ademhaling. Daarom is het essentieel om de verbetering van de bèta-cel functie als een behandeling voor diabetes te kunnen meten intact bèta cel ademhaling. Met behulp van intact 832/13 INS-1 afgeleid beta cellen kunnen we het meten van het effect van de toenemende concentratie van glucose op cellulaire ademhaling. Dit protocol laat ons toe om bèta cel ademhaling meten in de aanwezigheid of afwezigheid van verschillende stoffen, zodat naar het vaststellen van het effect van de gegeven verbindingen op intact cel ademhaling. We laten hier zien het effect van twee natuurlijk voorkomende verbindingen, monomere epicatechine en curcumine, op bèta cel ademhaling onder de aanwezigheid van laag (2,5 mM) of hoge glucose (16.7 mM) voorwaarden. Deze techniek kan worden gebruikt om te bepalen van het effect van de verschillende verbindingen op intact bèta cel ademhaling in de aanwezigheid van verschillende concentraties van de glucose.

INS-1 832/13 beta cellen die worden voorbereid en geoogst zoals beschreven in het protocol demonstreer modulatie in zuurstofverbruik op basis van de verschillende chemische interventies (figuur 1A). Wanneer de concentratie glucose wordt verhoogd tot 16.7 mM Glucose (figuur 1B) zal een toename van de ademhaling in acht worden genomen. Ademhaling zal dalen wanneer de onbeschadigde cellen worden behandeld met Oligomycin A. Deze ademhaling staat bekend als het lek, ...

Het doel van dit protocol is voor het meten van het effect van glucose-gemedieerde wijzigingen in mitochondriale ademhaling in de aanwezigheid van natuurlijke verbindingen op intact 832/13 beta cellen met behulp van hoge-resolutie respirometrie.

Hoge resolutie respirometrie voor het meten van mitochondriale functie van Intact Beta-cellen in de aanwezigheid van natuurlijke verbindingen

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

Het algemene doel van deze aanpak is om de ademhalingsfunctie van pancreatische bètacellen direct te beoordelen onder insuline-stimulerende omstandigheden. Dit kan ook worden gebruikt om het effect van verschillende verbindingen op de ademhalingsfunctie van bètacellen te observeren. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van de fysiologie van pancreatische bètacellen te beantwoorden, zoals of een bepaalde verbinding de functie van pancreatische bètacellen beïnvloedt via veranderingen in de ademhaling.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het kan worden gebruikt om de ademhalingsfunctie direct te beoordelen in pancreatische bètacellen, onder basale en insuline-stimulerende omstandigheden. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de stappen voor celbereiding en machinegebruik moeilijk te leren zijn vanwege de vereiste precisie in celbereiding en meting van ademhaling. Om te beginnen, kweek INS-1-afgeleide 832/13 bètacellen in aangevuld RPMI 1640.Verwijder de cellen uit een T75-kolf door twee milliliter 0,25% trypsine toe te voegen en in te cuberen bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. Neutraliseer vervolgens de trypsine door acht

high-resolution-respirometry-to-measure-mitochondrial-function-intact

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Methoden voor biopsie van vastus lateralis, de voorbereiding van gezuiverde mitochondria, en respirometrische profilering worden beschreven. Het gebruik van kleine spiermassa maakt deze techniek geschikt voor onderzoekstoepassingen.

Voorbereiding en Respirometrische Beoordeling van Mitochondriën geïsoleerd van spierweefsel Verkregen door percutane naaldbiopsie

Hoge-resolutie respirometrie wordt gebruikt om mitochondriale zuurstofconsumptie bepalen. Dit is een eenvoudige techniek om mitochondriale ademhalingsketen complexen (I-IV) ademhalingssnelheid, maximale mitochondriale elektronentransport systeemcapaciteit en buitenste mitochondriale membraan integriteit te bepalen.

High-resolution respirometrietest aan mitochondriale functie beoordelen in gepermeabiliseerde en intacte cellen

Hier wordt een quadricepsspiermonster genomen van een geanesthetiseerd varken en mitochondriën worden geïsoleerd door differentiële centrifugatie. Vervolgens worden de ademhalingssnelheden van mitochondriale ademhalingsketencomplexen I, II en IV bepaald met behulp van hoogwaardige respirometrie.

Isolatie van Intact Mitochondriën zijn van skeletspieren door differentiële centrifugatie voor High-resolution respirometrietest Metingen

Het beoordelen van oxidatieve fosforylering met behulp van respirometers met hoge resolutie is een integraal onderdeel geworden van de functionele analyse van mitochondriën en cellulair energiemetabolisme. Hier presenteren we protocollen voor de analyse van cellulair energiemetabolisme met behulp van kamer- en microplaatgebaseerde respirometers met hoge resolutie en bespreken we de belangrijkste voordelen van elk apparaat.

Respirometrie met hoge resolutie om bio-energetica in cellen en weefsels te beoordelen met behulp van respirometers op basis van kamer en platen

Hoge resolutie respirometrie gekoppeld aan fluorescentiesensoren bepaalt mitochondriaal zuurstofverbruik en reactieve zuurstofsoorten (ROS) generatie. Het huidige protocol beschrijft een techniek om mitochondriale ademhalingssnelheden en ROS-productie in de gepermeabiliseerde heupzenuw te beoordelen.

Beoordeling van mitochondriale functie in heupzenuw door middel van hoge resolutie respirometrie

De metabole status van menselijke retinale pigmentepitheelcellen (H-RPE) weerspiegelt hun gezondheid en functie. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor het onderzoeken van de real-time metabole flux van H-RPE met behulp van respirometrie met hoge resolutie.

Real-time analyse van bio-energetica in primaire menselijke retinale pigmentepitheelcellen met behulp van respirometrie met hoge resolutie

De analyse van de mitochondriale functie van sperma door middel van respirometrie met hoge resolutie maakt het mogelijk om het zuurstofverbruik van vrij bewegende spermatozoa in een gesloten kamersysteem te meten. De techniek kan worden toegepast om de ademhaling in menselijke spermatozoa te meten, wat informatie geeft over de mitochondriale kenmerken en integriteit van sperma.

Respirometrie met hoge resolutie om de mitochondriale functie in menselijke spermatozoa te beoordelen

Hier beschrijven we een uitgebreide methode voor het meten van mitochondriale oxidatieve fosforylering in verse gepermeabiliseerde skeletspiervezels van menselijke of muizenspieren. Deze methode maakt de real-time kwantificering van de mitochondriale ademhaling en de beoordeling van brandstofvoorkeur en metabole flexibiliteit mogelijk, met behoud van bestaande mitochondriale netwerken en membraanintegriteit.

Meting van mitochondriale ademhaling in skeletspiervezels van mens en muis door middel van respirometrie met hoge resolutie

Methoden voor het bestuderen van mitochondriale bio-energetica onder fysiologisch relevante substraatconcentraties in immuuncellen zijn beperkt. We bieden een gedetailleerd protocol dat gebruik maakt van fluorespirometrie met hoge resolutie om veranderingen in de reactie van het mitochondriale membraanpotentieel op de energievraag in menselijke T-cellen, monocyten en perifere mononucleaire cellen te beoordelen.

Fluorespirometrie met hoge resolutie om dynamische veranderingen in het mitochondriale membraanpotentiaal in menselijke immuuncellen te beoordelen

Hier laten we zien dat de kamer van 0,5 ml voor respirometrie met hoge resolutie resultaten laat zien die consistent zijn met die van de kamer van 2,0 ml als de juiste instrumentele O2-achtergrondcorrectie wordt toegepast. Er is minder monster nodig, wat gunstig is voor studies met een beperkte beschikbaarheid of een lage ademhalingscapaciteit.

Spirometrie met hoge resolutie in een kamer met een klein volume

We presenteren een niet-invasieve realtime methode voor het monitoren van mitochondriale gezondheid met behulp van Resonance Raman Spectroscopie (RRS). We gebruikten RRS om mitochondriale redoxtoestanden te kwantificeren en ontwikkelden een metriek voor mitochondriale gezondheid, de Resonance Raman verlaagde mitochondriale ratio (3RMR), die een snellere respons op veranderingen in zuurstofvoorziening laat zien dan traditionele bloedgasanalyten.

Real-time, niet-invasieve evaluatie van mitochondriale functie met behulp van resonantie Raman-spectroscopie

Leer hoe je hoge-resolutie respirometrie toepast om mitochondriale functie te meten in intacte 832/13 bètacellen onder insuline-stimulerende omstandigheden. Deze methode helpt onderzoekers de effecten van natuurlijke verbindingen op celademhaling te evalueren.

Hoge resolutie respirometrie voor het meten van mitochondriale functie van Intact Beta-cellen in de aanwezigheid van natuurlijke verbindingen (Video) | JoVE Journal

Hoge resolutie respirometrie voor het meten van mitochondriale functie van Intact Beta-cellen in de aanwezigheid van natuurlijke verbindingen

Meer video's verkennen