Hoge resolutie respirometrie voor het meten van mitochondriale functie van Intact Beta-cellen in de aanwezigheid van natuurlijke verbindingen
23 januari 2018
Het doel van dit protocol is voor het meten van het effect van glucose-gemedieerde wijzigingen in mitochondriale ademhaling in de aanwezigheid van natuurlijke verbindingen op intact 832/13 beta cellen met behulp van hoge-resolutie respirometrie.
Het algemene doel van deze aanpak is om de ademhalingsfunctie van pancreatische bètacellen direct te beoordelen onder insuline-stimulerende omstandigheden. Dit kan ook worden gebruikt om het effect van verschillende verbindingen op de ademhalingsfunctie van bètacellen te observeren. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van de fysiologie van pancreatische bètacellen te beantwoorden, zoals of een bepaalde verbinding de functie van pancreatische bètacellen beïnvloedt via veranderingen in de ademhaling.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het kan worden gebruikt om de ademhalingsfunctie direct te beoordelen in pancreatische bètacellen, onder basale en insuline-stimulerende omstandigheden. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, omdat de stappen voor celbereiding en machinegebruik moeilijk te leren zijn vanwege de vereiste precisie in celbereiding en meting van ademhaling. Om te beginnen, kweek INS-1-afgeleide 832/13 bètacellen in aangevuld RPMI 1640.
Verwijder de cellen uit een T75-kolf door twee milliliter 0,25% trypsine toe te voegen en in te cuberen bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. Neutraliseer vervolgens de trypsine door acht milliliter compleet RPMI 1640-medium toe te voegen. Verdun 100 microliters van het celvolume in 900 microliters PBS en tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
Plateer vervolgens de cellen met een dichtheid van een miljoen cellen per milliliter in een 10 centimeter schotel. Kweek de cellen in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius en 5% CO2, voordat u begint met ademhalingsexperimenten. Ververs het medium 24 uur na plateren en kweek de 832/13 cellen in een bevochtigde incubator bij 37 graden Celsius en 5% CO2.
Behandel vervolgens de cellen met voertuigcontrole of cacao-afgeleid, epicatechinemonomeer, voor een uiteindelijke concentratie van 100 nanomolair. Volg de toevoeging van behandeling met cultuur gedurende nog eens 24 uur in een bevochtigde incubator, bij 37 graden Celsius en 5% CO2. Was vervolgens de cellen in 1x lage glucosesecretie buffer, of SAB gedurende vijf minuten.
Aspibeer de buffer en incubeer de cellen in 1x lage glucose SAB gedurende drie uur, waarbij de buffer elke uur wordt ververst. Na incubatie, verwijder de cellen uit de schotel met één milliliter 0,25% trypsine. Combineer de cellen in trypsine van de schotel behandeld met voertuigcontrole, met vier milliliters SAB in een 15 milliliter conische buis.
Combineer op vergelijkbare wijze de schotel behandeld met de verbinding van belang, met een buffer. Verdun 100 microliters van het celvolume in 900 microliters PBS en tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Verdun 100 microliters van het celvolume in 900 microliters PBS en tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
De gegevens tonen aan dat een concentratie van een miljoen cellen per milliliter het meest effectief is. Na het voorbereiden van de high-resolutie respirometer zoals beschreven in het tekstprotocol, voeg 2,4 milliliter 1x lage glucose SAB-buffer toe aan elke oxygraafkamer. Roer de buffer continu met behulp van magnetische roerstaven in de kamer op 750 rpm en 37 graden Celsius, met een data-opname interval van 2,0 seconden.
Selecteer hiervoor de F7-knop en open het tabblad gelabeld systemen. Duw de zuigers helemaal naar binnen en trek ze vervolgens terug naar de moer-beluchtingsinstelling. Laat de machine minimaal een uur equilibreren totdat een stabiele zuurstofflux is verkregen.
Stel vervolgens de Machine in op 37 graden Celsius gedurende de duur van het experiment. Druk op de F7-knop en open het tabblad gelabeld, Zuurstof O2, om de polarisatiespanning in te stellen op 800 millivolt met een versterking van twee. Equilibreer de zuurstofconcentratie van de SAB-buffer gedurende ten minste 30 minuten, totdat de verandering in zuurstofconcentratie stabiel is.
Selecteer vervolgens een gebied waar de verandering in zuurstofconcentratie stabiel is om een achtergrondmeting van de verandering in zuurstofconcentratie vast te stellen, door op de shift-toets te drukken, links te klikken op de muis en de muis over het geselecteerde gebied te slepen. Klik op de letter die is gekoppeld aan het geselecteerde gebied en verander deze in R1 voor elk spoor dat overeenkomt met elk van de twee kamers. Dubbelklik op het O2-kalibratievakje in de linkeronder- en rechterhoek van het scherm.
Klik op de knop Selecteer markering voor de luchtkalibratie als R1 en selecteer vervolgens kalibreren en kopiëren naar het klembord voor beide kamers. Laad vervolgens 2,4 milliliter monster in elke kamer, waarbij één kamer wordt geladen met de controle-voertuigbehandelde cellen en één kamer met compound-behandelde cellen in 1x lage glucose SAB. Duw de zuiger helemaal in en aspireer het resterende volume.
Roer de cellen gedurende het experiment continu op 750 rpm en 37 graden Celsius voor alle volgende stappen. Maak een markering door op F4 te klikken en label de markering als cellen wanneer monsters zijn geladen. Meet de monsters gedurende 30 minuten.
Na signaalstabilisatie, selecteer een gebied van de verandering in zuurstofconcentratie die overeenkomt met de lage glucose-omstandigheden. Voeg vervolgens 12,5 microliter van een 45% steriele glucose-oplossing toe aan elke kamer via de titanium laadpoort met behulp van een spuit. Maak een markering gelabeld glucose, wanneer de behandeling wordt toegevoegd.
Laat het signaal stabiliseren en registreer de cellulaire ademhaling totdat een stabiele zuurstofflux is bereikt. Op dit punt, selecteer het gebied van de verandering in zuurstofconcentratie om de 16,7 millimolair glucose-lezing te vertegenwoordigen, die overeenkomt met stimulerende omstandigheden. Nadat signaalstabilisatie is bereikt, voegt u één microliter van vijf millimolair Oligomycine A toe aan elke kamer via de laadpoort.
Maak een markering gelabeld OligoA, wanneer de behandeling wordt toegevoegd. Laat het signaal stabiliseren en registreer de cellulaire ademhaling to
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol is gericht op het beoordelen van de ademhalingsfunctie van pancreatische bètacellen, met name onder insulinestimulerende omstandigheden. Het evalueert de impact van verschillende verbindingen op mitochondriale ademhaling in intacte 832/13 bètacellen met behulp van hoge resolutie respirometrie.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celfysiologie
- Metabolisch onderzoek
Achtergrond
- Het begrijpen van de functie van pancreatische bètacellen is cruciaal voor diabetesonderzoek.
- Ademhalingsfunctie is een belangrijke indicator van cellulaire gezondheid en metabolisme.
- Natuurlijke verbindingen kunnen de ademhaling en functie van bètacellen beïnvloeden.
- Hoge resolutie respirometrie maakt nauwkeurige meting van mitochondriale activiteit mogelijk.
Doel van het onderzoek
- Om glucose-gemedieerde veranderingen in mitochondriale ademhaling te meten.
- Om de effecten van natuurlijke verbindingen op de functie van bètacellen te evalueren.
- Om inzichten te geven in de fysiologie van pancreatische bètacellen.
Gebruikte methoden
- Kweek INS-1-afgeleide 832/13 bètacellen in aangevuld RPMI 1640.
- Gebruik hoge resolutie respirometrie voor het meten van ademhaling.
- Beoordeel de ademhalingsfunctie onder zowel basale als insuline-gestimuleerde omstandigheden.
- Visuele demonstraties om te helpen bij celbereiding en machinegebruik.
Belangrijkste resultaten
- Directe beoordeling van de ademhalingsfunctie in pancreatische bètacellen.
- Observatie van de impact van verbindingen op de ademhaling.
- Inzichten in de fysiologische reacties van bètacellen op glucose.
- Identificatie van belangrijke factoren die het metabolisme van bètacellen beïnvloeden.
Conclusies
- Deze methode is cruciaal voor het begrijpen van de fysiologie van bètacellen.
- Hoge resolutie respirometrie levert waardevolle gegevens over mitochondriale functie.
- Verder onderzoek kan het therapeutische potentieel van natuurlijke verbindingen verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Assessing mitochondrial respiration in intact pancreatic beta cells provides critical mechanistic insights into glucose-stimulated insulin secretion, a core pathway in diabetes pathophysiology. This approach enables de-risking of natural compound effects on beta cell bioenergetics, supporting target validation and lead identification in metabolic disease programs. By quantifying oxygen flux under defined glucose and compound conditions, the method delivers predictive confidence for prioritizing modulators of beta cell function in early discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking compound exposure to changes in mitochondrial respiration, a key driver of insulin secretion.
- Operational Value: Enables functional validation of targets in a physiologically relevant, intact cell system under basal and stimulatory glucose conditions.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that enhance or inhibit basal, leak, or maximal respiration states in beta cells.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantitative oxygen consumption data that can be normalized to cell count for reproducible compound screening.
- <Scalability: Supports testing of natural compounds like epicatechin and curcumin across glucose concentrations to define structure-activity relationships.
- Platform Reuse: Establishes a respirometry-based workflow applicable to other mitochondrial-dependent systems such as hepatocytes or myocytes.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects mitochondrial function to insulin secretion, offering a translational biomarker for beta cell health in diabetes models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether compounds affect beta cell function via respiratory changes, reducing ambiguity in mechanism of action.
- <Preclinical Continuity: Provides mechanistic readouts that can inform follow-up assays like glucose-stimulated insulin secretion for integrated functional validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, particularly for metabolic disease programs focused on beta cell preservation or enhancement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring how compounds alter mitochondrial respiration in intact beta cells under insulin-stimulatory conditions.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative oxygen flux outputs that enable comparison of compound effects across glucose levels.
- Analytics: Provides normalized respiration metrics (basal, leak, ETS states) that allow teams to rank compounds by bioenergetic impact.
- Translational Research: Links mitochondrial measurements to functional outcomes like insulin secretion, enabling risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized respirometry platform for evaluating mitochondrial modulators across multiple cell types and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving mechanistic ambiguity around compound effects on beta cell respiration.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible quantification of mitochondrial function using high-resolution respirometry with defined calibration and normalization steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, mechanism-linked respirometry data that reduces late-stage failure risk in metabolic programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on basal, ATP-linked, and maximal respiration in beta cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture, trypsinization, and hemocytometer-based counting to ensure consistent cell density (1x10⁶ cells/mL).
- Dependent on high-resolution respirometer instrumentation with precise temperature, stir speed, and oxygen calibration controls.
- Necessitates cross-team standardization of SAB buffer preparation, glucose titration, and inhibitor injection protocols (Oligomycin A, FCCP, Antimycin A).
- Involves adaptation considerations when transferring the assay to other cell types, including optimization of cell density and substrate/inhibitor concentrations.
- Limited by the need for meticulous cell preparation and machine equilibration, as signal stability is critical for accurate respiration measurement.
