Onderzoek van RNA-synthese met behulp van de 5-Bromouridine etikettering en Immunoprecipitation
3 mei 2018
Deze methode kan worden gebruikt voor het meten van RNA-synthese. 5-Bromouridine is toegevoegd aan de cellen en opgenomen in gesynthetiseerde RNA. RNA-synthese wordt gemeten door RNA extractie onmiddellijk na de etikettering, gevolgd door 5-Bromouridine-gerichte immunoprecipitation van gelabelde RNA en analyse door omgekeerde transcriptie en kwantitatieve polymerase-kettingreactie.
Het algemene doel van dit experiment is om veranderingen in RNA-synthese te meten door bromouridine-labeling en immunoprecipitatie. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van RNA-metabolisme te beantwoorden door te meten of een verandering in RNA-niveaus wordt veroorzaakt door veranderingen in RNA-synthese. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het kan worden gebruikt op elk gewenst type celcultuur en de gebruikte materialen zijn gemakkelijk toegankelijk.
Om het protocol te beginnen, zaait u 3,5 keer 10 tot de zesde HEK293T-cellen in een 10-centimeter Petri-schaal in 10 milliliter groeimedium om 48 uur later een totaal van meer dan 40 microgram RNA te verkrijgen bij extractie. Houd de cellen op 37 graden Celsius en 5%CO2. 48 uur na het zaaien, aspireert u acht milliliter groeimedium en laat u twee milliliter achter om te voorkomen dat de cellen uitdrogen. Voeg twee millimol bromouridine en behandeling toe aan het groeimedium en verwijder de resterende twee milliliter uit de cellen voordat u de acht milliliter bromouridine-bevattend groeimedium opnieuw aanbrengt.
Vervolgens incubeert u de cellen gedurende één uur. Na incubatie, wast u de cellen in vijf milliliter Hank's buffer en trypsiniseren de cellen met twee milliliter 0,05% trypsine gedurende vijf minuten. Voeg acht milliliter groeimedium toe om de reactie te stoppen, breng de cellen over naar een 15-milliliter buis en centrifugeer de cellen gedurende twee minuten bij 1.000 keer g.
Vervolgens verwijdert u het supernatant en extraheert u totaal RNA uit het celpellet met behulp van een RNA-isolatiekit en elueert u het RNA in RNase-vrij water. Deze techniek is erg gevoelig, en het is daarom belangrijk om met RNA van hoge kwaliteit te werken. De RNA-extractie is daarom een kritische stap, maar het kan ook gemakkelijk worden uitgevoerd met de huidige RNA-extractiekits.
Bereid de bedden in één batch voor voor het aantal te onderzoeken monsters plus één extra om rekening te houden met verlies tijdens pipetteren en wervelmengsel. Resuspendeer anti-Mouse IgG magnetische bedden grondig door wervelmengsel en neem 20 microliter bedden per monster in een RNase-vrije 1,5-milliliter buis. Plaats de 1,5-milliliter buis gedurende 20 seconden in een magnetische stand voor de bedden om zich aan de zijkant te verzamelen.
Verwijder het supernatant, haal de buis uit de magnetische stand en resuspendeer de bedden in 40 microliter van eenmaal bromouridine-IP-buffer door te pipetteren. Centrifugeer de buis gedurende twee seconden in een tafelcentrifuge, plaats deze terug in de magnetische stand en verwijder het supernatant. Vervolgens blokkeert u onspecifieke binding aan de bedden met behulp van heparine.
Resuspendeer de bedden in één milliliter van eenmaal bromouridine-IP plus één milligram per milliliter heparinebuffer en draai de buis gedurende 30 minuten. Was vervolgens de bedden eenmaal. Resuspendeer de bedden in één milliliter van eenmaal bromouridine-IP-buffer en voeg 1,25 microgram per monster van anti-alfa-bromodeoxyuridine-antilichaam toe.
Incubeer de bedden gedurende één uur met draaien. Na incubatie, was de bedden drie keer. Resuspendeer de gewassen bedden in 50 microliter per monster van eenmaal bromouridine-IP-buffer aangevuld met één millimolair bromouridine en laat de bedden gedurende 30 minuten draaien.
Na rotatie, was de bedden drie keer en resuspendeer de bedden in 50 microliter per monster van eenmaal bromouridine-IP-buffer. Meet RNA-concentraties in de RNA-extracten met behulp van ultraviolet-zichtbare spectrofotometrie en verdun 40 microgram RNA van elk monster in RNase-vrij water tot een totaal volume van 200 microliter. Na het denatureren van het RNA gedurende twee minuten bij 80 graden Celsius, centrifugeer de monsters kort in een tafelcentrifuge.
Na het centrifugeren, voegt u 200 microliter van tweemaal bromouridine-IP plus BSA, RNase-remmer toe. Voeg vervolgens 50 microliter van de geresuspendeerde en voorbereide bedden toe aan elk monster en draai de monsters gedurende één uur. Na incubatie, was de bedden vier keer.
Resuspendeer de bedden in 200 microliter elutiebuffer om het RNA elueren en voeg snel 200 microliter pH 6,6 fenol toe om eventuele niet-RNA-moleculen uit het monster te verwijderen. Wervel het monster om te mengen en centrifugeer het gedurende drie minuten bij 25.000 keer g in een tafelcentrifuge. Aspirant vervolgens zoveel mogelijk van de bovenste fase, ongeveer 190 microliter, en verplaats het naar een buis met 200 microliter pH 6,6 fenol-chloroform.
Zorg ervoor dat u dezelfde hoeveelheid over monsters aspireert. Wervel het monster en centrifugeer het. Na de centrifuge, voert u chloroform-extractie uit door de waterige bovenste fase, ongeveer 180 microliter, te aspireren en deze over te brengen naar een buis met 200 microliter chloroform.
Wervel en centrifugeer vervolgens het monster. Aspireer de waterige bovenste fase, ongeveer 170 microliter, en breng deze over naar een buis met 17 microliter van drie molaire pH zes natriumacetaat om het RNA uit de waterige oplossing te neutraliseren en te bezinken. Voeg vervolgens twee microliter glycogeen toe, dat met het RNA zal bezinken en de pellet zichtbaarder zal maken.
Voeg 500 microliter 96% ethanol toe om de binding tussen de zout-ionen en het RNA te verhogen en meng door de buis een paar keer te kantelen. Laat de buis overnacht op minuus 20 graden Celsius of gedurende 15 minuten op droog ijs. Centrifugeer het gekoelde monster, gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren en was de pellet in 185 microliter 75% ethanol om eventuele resterende zout te verwijderen.
Vervolgens centrifugeert u het monster gedurende 25.000 keer g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Gooi het supernatant volledig weg zonder de pellet te verstoren en laat de pellet gedurende vijf tot tien minuten drogen met het deksel open. Resuspendeer de pellet in 10 microliter RNase-vrij water dat op de zijkant van de buis wordt aangebracht om verstoren van de pellet te
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze methode kan worden gebruikt om RNA-synthese te meten via bromuuridine-labeling en immunoprecipitatie. Het helpt bepalen of veranderingen in RNA-niveaus het gevolg zijn van wijzigingen in de RNA-synthese.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- RNA-metabolisme
- Celkweektechnieken
- Kwantitatieve analyse
Achtergrond
- RNA-synthese is een essentieel proces voor de cellulaire functie.
- Bromuuridine is een nucleoside-analoog die wordt gebruikt voor het labelen van RNA.
- Immunoprecipitatie maakt de isolatie van gelabeld RNA mogelijk.
- Deze techniek is toepasbaar op verschillende celtypen.
Doel van de studie
- Om veranderingen in de RNA-synthese te meten.
- Om de relatie tussen RNA-niveaus en synthesesnelheden te onderzoeken.
- Om gebruik te maken van een methode die toegankelijk en aanpasbaar is voor verschillende celculturen.
Gebruikte methoden
- Zaai HEK293T-cellen uit in een Petrischaal.
- Voeg bromouridine toe aan het groeimedium.
- Extraheer RNA na een vastgestelde incubatieperiode.
- Voer immunoprecipitatie uit en analyseer het RNA via kwantitatieve PCR.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle incorporatie van bromuuridine in gesynthetiseerde RNA.
- Kwantitatieve meting van de bereikte RNA-synthese.
- Aantoonbare toepasbaarheid van de methode over verschillende celtypen heen.
- Inzicht geboden in de dynamiek van het RNA-metabolisme.
Conclusies
- Deze methode is effectief voor het bestuderen van RNA-synthese.
- Het kan helpen bij het verhelderen van mechanismen van het RNA-metabolisme.
- Toegankelijke materialen en technieken vergroten het nut ervan in onderzoek.
Veelgestelde Vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Directe meting van RNA-synthese met behulp van 5-bromouridine-labeling en immunoprecipitatie stelt biofarmaceutische teams in staat om onderscheid te maken tussen transcriptionele productie en RNA-degradatie, een kritiek kantelpunt bij target-validatie en mechanistische risicoreductie. Deze aanpak ondersteunt het voorspellende vertrouwen in de vroege ontdekkingsfase door te verduidelijken of waargenomen veranderingen in het RNA-niveau te wijten zijn aan gewijzigde synthesesnelheden. De compatibiliteit van de methode met diverse cellsystemen en downstream kwantitatieve analyses vergroot de toepasbaarheid binnen de gehele portfolio.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe bevraging van transcriptionele activiteit mogelijk voor functionele validatie van targets.
- Ondersteunt mechanistische risicoreductie door onderscheid te maken tussen RNA-veranderingen die worden aangestuurd door synthese versus degradatie.
- Faciliteert voorspellend vertrouwen in studies naar pathway-modulatie en target-engagement.
Screening & assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde RNA-synthese-uitlezingen voor voor downstream kwantitatieve workflows.
- Maakt assay-standaardisatie en reproduceerbaarheid mogelijk via gedefinieerde labelings- en immunoprecipitatiestappen.
- Ondersteunt schaalbare screening van effecten van verbindingen op de RNA-productie in verschillende celtypen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Sluit aan bij ziekterelateerde modellen door de meting van RNA-synthese in diverse cellsystemen mogelijk te maken.
- Zorgt voor continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door kwantitatieve biomarkeranalyse te ondersteunen.
- Vermindert het risico op falen in een laat stadium door transcriptionele mechanismen ten grondslag aan fenotypische veranderingen te verhelderen.
Integratie van Pipeline & Workflow
Deze methode integreert in het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek door een directe uitlezing van de RNA-synthese te bieden, wat zowel hypothese-toetsing als kwantitatieve analyses ondersteunt.
- Discovery Biology: Verduidelijkt of modulatie van het target de RNA-productie of -stabiliteit beïnvloedt, wat bijdraagt aan de analyse van signaalpaden.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve gegevens over RNA-synthese die geschikt zijn voor de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Maakt downstream qPCR en sequencing mogelijk voor een robuuste meting van nieuw gesynthetiseerd RNA.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt de afstemming van biomarkers door de synthese van ziekterelevante RNA's te meten.
- Enterprise Reuse: Biedt een breed toepasbare workflow voor studies naar het RNA-metabolisme over verschillende programma's heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij targetvalidatie.
- Operationele waarde: Standaardiseert de meting van RNA-synthese met toegankelijke reagentia en protocollen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door transcriptionele mechanismen in een vroeg stadium van de pipeline te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk door onderscheid te maken tussen RNA-veranderingen gedreven door synthese en veranderingen gedreven door degradatie.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in RNA-handling en immunoprecipitatietechnieken.
- Toegang tot celcultuur, magnetische bead-gebaseerde immunoprecipitatie en kwantitatieve analyseplatforms is noodzakelijk.
- Strikte RNA-kwaliteitscontrole is vereist om reproduceerbaarheid en sensitiviteit te garanderen.
- Aanpassingen kunnen nodig zijn voor RNA's die traag worden gesynthetiseerd of snel worden afgebroken vanwege de korte labelingsvensters.
- Praktische beperkingen omvatten de mogelijke onderrepresentatie van bepaalde RNA-soorten op basis van synthese- en degradatiekinetiek.
