Multimodale hiërarchische beeldvorming van seriële secties voor het vinden van specifieke cellulaire doelen binnen grote Volumes

Het algemene doel van deze workflow is om bepaalde doelen te identificeren voor ultrastructurele beeldvorming binnen een weefsel met behulp van lichtmicroscopie, gevolgd door 3D-beeldvorming in een SEM met zeer hoge resolutie. De hier geïntroduceerde beeldvormingsworkflow kan helpen om belangrijke vragen over cellulaire of weefselultrastructuur in een aantal gebieden te beantwoorden, zoals celbiologie, ontwikkelingsbiologie, neurowetenschap of zelfs pathologie. Het grote voordeel van de techniek, die eigenlijk gebaseerd is op arraytomografie, is dat het snijden van weefsel in arrays van seriële secties het gemakkelijk maakt om doelstructuren te identificeren, zelfs als ze aanvankelijk begraven zijn in het oorspronkelijke monstervolume.

Arraytomografie werd oorspronkelijk geïntroduceerd in een neurowetenschappelijke context, maar het kan ook worden toegepast op een breed scala van andere systemen, waaronder bacteriën, planten, dieren en zelfs monsters van patiënten in een pathologie-setting. Personen die nieuw zijn met deze methode zullen worstelen omdat het verzamelen van veel seriële secties erg moeilijk is. Werken zonder extra ondersteuning kan leiden tot verlies van secties of verstoring van de linten.

Gebruik een kleine borstel gevormd uit een paar haren bevestigd aan een tandenstoker om voorzichtig de voor- en achterkant van een voorgesneden blok te coaten met een kleefmengsel. Voer deze stap snel uit omdat het oplosmiddel van deze mengsel binnen enkele seconden verdampt. Terwijl de monsters drogen, snijd stukken siliciumwafels tot een grootte die in het mesboot past en markeer ze met een diamantschrijver.

Vervolgens reinig de siliciumwafel handmatig met isopropanol en pluisvrij weefsel. Bevestig het substraat aan een uiteinde van de dragerplaat met behulp van een verwijderbare kleefstof. Eenmaal vast, activeer het substraat met plasma door gebruik te maken van gloeigasontlading met lucht om een ​​hydrofiele oppervlakte te verkrijgen.

Met het gemonteerde substraat dichter bij de mesrand, plaats de drager in de klem van de substraathouder. Plaats vervolgens een jumbo diamantmes in de meshouder en stel de helderheidshoek in op nul graden. Vul vervolgens de mesboot met gedestilleerd water.

Breng het mes dichterbij zodat het een tot twee millimeter van het monster afstaat. Vervolgens, laat het substraat zakken in het water met behulp van schroeven één tot drie van de substraathouder. Controleer dat de waterlijn zich in het bovenste derde van het substraat bevindt.

Omdat het moeilijk is om de grondhelderheid te zien wanneer een siliciumwafel wordt gebruikt, laat het substraat zakken totdat u het voelt raken de vloer. Vervolgens, verhoog het substraat een kleine hoeveelheid. Zorg ervoor dat noch het substraat noch de drager het mesboot zullen raken tijdens het snijden.

Gebruik vervolgens een spuit of pipet om het waterniveau in de boot aan te passen. Terwijl u door de binoculair kijkt, voegt u water toe of verwijdert u het totdat het volledige gebied van het wateroppervlak een homogene weerspiegeling van de bovenste lichtverlichting van de ultramicrotoom laat zien. Zodra de setup voltooid is, begint u met het doorsnijden van het monster.

Wanneer een aantal secties zijn gesneden, stopt u het snijproces en laat u het lint los van de mesrand door voorzichtig over de mesrand te strijken met een wimper of een zeer zachte kattenhaar. Manipulat de lint naar het substraat en duw voorzichtig de eerste sectie van het lint om het aan de droge kant van het substraat te bevestigen. Ga door met het doorsnijden van het monster en het bevestigen van de linten aan het substraat.

Begin aan één kant van het substraat en beweeg geleidelijk naar de andere met elke nieuwe lint. Wanneer het substraat volledig bedekt is met linten, tilt u het substraat voorzichtig uit de mesboot met behulp van de micromanipulatorschroeven van de substraathouder. Laat het lintarray drogen en bewaar het vervolgens in een stofvrije omgeving.

Na het drogen, verwijdert u het substraat dat is bevestigd met kleefstof zo snel mogelijk van de drager. Bepaal vervolgens uw monster voor lichtmicroscopie zoals beschreven in het begeleidende tekstprotocol en voer beeldvorming uit. Vervolgens, bepaal het monster voor elektronenmicroscopie en monteer het op aluminium stubs met een plakbare koolstofpad.

Beeld deze arrays nu af in de veld emissie scanning elektronenmicroscoop. Gebruik primaire elektronenenergieën van drie kV of lager en een bundelstroom tussen 50 en 800 picoampère om opladen te voorkomen. Wanneer u ITO-gecoate glazen dekjes gebruikt, verbindt u het geleidende oppervlak met de microscoopdrager met kopertape en zilververf.

De eerste stap in de hiërarchische beeldvormingscascade is het genereren van een overzicht van de array op een zodanige manier dat de individuele secties kunnen worden herkend. Definieer eerst de vier hoeken van uw array door een afbeelding van elke hoek bij lage vergroting, ongeveer 100x, te tekenen, en creëer vervolgens een ROI die de hele array omsluit. Wijs een beeldvormingsprotocol toe aan deze ROI met de volgende parameters.

Gebruik de secundaire elektronendetector voor snelle beeldvorming met behulp van een korte verblijfstijd van ongeveer 0,2 microseconden. Kies een grote afbeeldingspixelgrootte en een tegelgrootte van 2000 bij 2000 pixels. Het resultaat is een zeer lawaaierige afbeelding, maar zelfs hier is het weefsel binnen de sectie zichtbaar.

Genereer vervolgens een sectieset door een interessegebied te maken, waarbij alleen het weefsel in de eerste sectie wordt omlijnd. Kloon het naar alle volgende secties met behulp van de stempeltool. Draai de interessegebieden indien nodig om rekening te houden met gebogen linten.

Wijs een protocol toe aan de sectie die het beste de substructuur van het weefsel weergeeft. Hier werd een tussenliggende pixelgrootte van 60 nanometer, een tegelgrootte van 12000 bij 12000 pixels en een verblijfstijd van 3,2 microseconden gebruikt. Vanwege slechte kwaliteit werd een tweede sectieset gemaakt die een select paar cellen omlijn