Een Facile Protocol voor het genereren van Site-Specifically geacetyleerd eiwitten in Escherichia Coli
9 december 2017
Uitbreiding van de genetische code dient als een krachtig hulpmiddel om te bestuderen van een breed scala aan biologische processen, met inbegrip van eiwit acetylation. Hier tonen we een facile protocol misbruiken van deze techniek voor het genereren van homogeen geacetyleerd eiwitten op specifieke sites in Escherichia coli cellen.
In dit werk zullen we een gemakkelijk protocol demonstreren om homogeen geacetyleerde eiwitten op specifieke locaties te produceren door gebruik te maken van E.coli als expressiegastheer. De omkeerbare lysine-acetylering van eiwitten is een van de meest voorkomende post-translationele modificaties in de natuur. Het speelt een belangrijke rol in een breed scala aan biologische processen, waaronder gentranscriptie, stressrespons, cellulaire differentiatie en metabolisme.
Het genereren van puur geacetyleerde eiwitten op ontwerpposities is erg nuttig voor het bestuderen van eiwitacetylering. Echter, het is moeilijk voor de meeste klassieke methoden. Deze uitdaging is opgelost door de genetische code-uitbreidingstechniek.
Het gebruikt een gemodificeerde pyrrolysyl-tRNA-synthetase variant om tRNA-Pyl met acetyllysine te laden, en gebruikt vervolgens het translationele apparaat van de gastheer om het UAG-stopcodon in het mRNA te onderdrukken, en leidt de incorporatie van acetyllysine op de ontwerppositie van het doeleiwit. Ten eerste moet het amber-stopcodon worden geïntroduceerd op de overeenkomstige positie in het doelgen door gerichte mutagenese. Amplificeer het sjabloonplasmide dat het gen van de wild-type eiwitten bevat, en voer de stopcodonmutatie in vanuit de primers door de PCR-reactie.
Na PCR wordt het geamplificeerde materiaal direct toegevoegd aan de kinase-ligase-Dpn1-enzymmix gedurende een uur op kamertemperatuur voor circularisatie en sjabloonverwijdering. Voeg vijf microliter van de mix toe aan het buisje met 25 microliter ontdooide competente E.coli-cellen. Draai voorzichtig om het mengsel te mengen en plaats de mengsel op ijs gedurende 30 minuten.
Schok het mengsel gedurende 30 seconden op 42 graden Celsius en plaats op ijs voor nog eens vijf minuten. Pipetteer 600 microliter kamertemperatuur SOC-medium in het mengsel. Incubeer gedurende 60 minuten bij 37 graden Celsius met schudden.
Verspreid 100 microliter op de plaat met het overeenkomstige antibioticum, en incubeer overnacht bij 37 graden Celsius. Het plasmide van de enkele kolonie wordt verzonden voor sequencing. De tweede stap is om site-specifiek geacetyleerd eiwit te exprimeren en zuiveren.
Neem een enkele kolonie van de plaat, die het gemuteerde TAG-bevattende doelgen en het acetyllysine-incorporatiesysteem bevat. Inoculeer in 15 milliliter vers LB-medium met overeenkomstige antibiotica overnacht bij 37 graden Celsius. Breng de 15-milliliter overnachtcultuur over naar 300 milliliter vers LB-medium met antibiotica en incubeer bij 37 graden Celsius.
Voeg vijf millimolar acetyllysine en 20 millimolar nicotinamide toe als de uiteindelijke concentraties in groeimedium wanneer de absorbantie 5 is bij 600 nanometer. Laat cellen groeien gedurende nog een uur bij 37 graden Celsius. Voeg vervolgens de inductor toe voor eiwitexpressie en laat cellen groeien bij 25 graden Celsius overnacht.
Verzamel cellen door centrifugeren bij 3.000 g gedurende 15 minuten. Gooi de supernatant weg en bewaar de celpellets bij min 80 graden. Ontdooi de bevroren cellenpellets op ijs en suspendeer met 15 milliliter lysebuffer, vijf microliter beta-mercaptoethanol en één microliter nuclease.
Cellen worden gebroken door sonicatie. Centrifugeer het ruwe extract gedurende 25 minuten bij 20.000 g bij vier graden. Filter het supernatant met een 45-micrometer membraanfilter.
Laad het gefilterde monster op een kolom bevattende één milliliter nikkel NTA-hars, geëquilibreerd met 20 milliliter lysebuffer. Was de kolom met 20 milliliter wasbuffer. Het doeleiwit wordt elueerde met twee milliliter elutiebuffer.
Het gezuiverde eiwit wordt ontzilt door de PD-10-kolom door het toevoegen van 2,5 milliliter monster en verzamel het ontzilte monster met 3,5 milliliter ontziltingsbuffer. De volgende stap is om gezuiverd geacetyleerd eiwit biochemisch te karakteriseren. Denatureer eiwitten met de SDS-monsterbuffer boven 100 graden gedurende vijf minuten.
Centrifugeer het mengsel, laad op de SDS-PAGE-gel en draai gedurende 30 minuten op 200 volt. Was de gel met gedistilleerd water en schud zachtjes. Om de sandwich voor western blotting te maken, is van kathode naar anode spons, filterpapier, overdrachtsbuffer, geweekte SDS-PAGE-gel, methaan-geactiveerd PVDF-membraan, nog een filterpapier, verwijder de bubbels in de sandwich, en nog een spons.
Plaats de stapel in de overdrachtstank. Draai gedurende 45 minuten bij een constante stroom van 350 milliamps. Was het PVDF-membraan gedurende vijf minuten met zachtjes schuddend 25 milliliter TBST-buffer.
Blok het membraan met 5%BSA en de TBST-buffer gedurende een uur bij kamertemperatuur. Incubeer het membraan met verdund HRP-geconjugeerd acetyllysine-antilichaam bij kamertemperatuur gedurende een uur of vier graden overnacht met zachtjes schuddend. Was het membraan gedurende vijf minuten met zachtjes schuddend 20 milliliter TBST-buffer.
Herhaal deze stap vier keer. Breng het chemiluminescentie substraat gedurende één minuut aan op het membraan. Vang het signaal op met een CCD-camera-basis imager.
Dezelfde volumes van elutiefracties en eiwitzuivering werden geladen op de SDS-PAGE-gel. De opbrengst van geacetyleerd eiwit is ongeveer de helft van het wild-type eiwit, wat zeer efficiënt is, en dezelfde expressiestam zonder acetyllysine en groeimedium kan geen eiwitten produceren met detecteerbare hoeveelheid, wat wijst op hoge zuiverheid van geacetyleerd eiwit aangezien er geen canonieke aminozuren zijn ingebouwd op deze specifieke positie. Western blotting toonde aan dat er geen detecteerbare acetylering in wild-type eiwit is, wat wijst op de lage achtergrond van niet-specifieke acetylering van dit expressiesysteem, terwijl geacetyleerd eiwit een duidelijke band had.
Tandem massaspectrometrie bevestigde dat acetylering plaatsvindt op de juiste plaats waarvan de overeenkomstige positie in het gen werd gemutaeerd naar het stopcodon. Om goede opbrengsten en zuiverheid van geacetyleerde
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een protocol voor het genereren van homogeen geacetyleerde eiwitten op specifieke posities met E. coli als expressiegastheer. De techniek maakt gebruik van genetische code-expansie om de uitdagingen te overwinnen die verbonden zijn aan traditionele methoden voor eiwitacetylering.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Biochemie
- Eiwitengineering
- Posttranslationele modificaties
Achtergrond
- Lysine-acetylering is een veelvoorkomige post-translationele modificatie.
- Het is cruciaal voor diverse biologische processen, zoals gentranscriptie en metabolisme.
- Het genereren van geacetyleerde eiwitten op specifieke posities helpt bij het bestuderen van hun functies.
- Traditionele methoden voor acetylering zijn vaak ineffectief.
Doel van de studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het produceren van geacetyleerde eiwitten in E. coli.
- Om de studie naar mechanismen van eiwitacetylering te faciliteren.
- Om het begrip van de rol van acetylering in biologische processen te vergroten.
Gebruikte methoden
- Techniek voor expansie van de genetische code.
- Expressie van eiwitten in Escherichia coli.
- Site-specifieke acetylering van eiwitten.
- Protocolontwikkeling voor homogene acetylering.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle generatie van homogeen geacetyleerde eiwitten.
- Aangetoond van de effectiviteit van de techniek voor expansie van de genetische code.
- Biedt een nieuw instrument voor het bestuderen van eiwitacetylering.
- Verbeterd begrip van de rol van acetylering bij biologische functies.
Conclusies
- Het ontwikkelde protocol vereenvoudigt de productie van geacetyleerde eiwitten.
- Deze methode kan worden toegepast op diverse studies naar eiwitmodificaties.
- Toekomstig onderzoek kan deze techniek benutten om acetyleringsgerelateerde processen te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor executives
Site-specifieke acetylering van eiwitten in Escherichia coli maakt nauwkeurige analyse mogelijk van posttranslationele modificaties die cruciaal zijn voor targetvalidatie en mechanistisch de-risking in de vroege ontdekkingsfase. Dit protocol pakt langlopende uitdagingen aan bij het genereren van homogeen gemodificeerde eiwitten, wat bijdraagt aan voorspellende betrouwbaarheid en translationele continuïteit binnen R&D-portfolio's.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt directe toetsing van acetyleringsafhankelijke hypothesen op gedefinieerde eiwitplaatsen mogelijk.
- Faciliteert mechanische risicoreductie door de functionele impact van specifieke lysine-acetyleringsgebeurtenissen te isoleren.
- Ondersteunt robuuste targetvalidatie door zuivere, plaats-specifiek gemodificeerde eiwitten te leveren voor downstream-assays.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Biedt gestandaardiseerde, reproduceerbare geacetyleerde proteïnereagentia voor kwantitatieve biochemische en biofysische assays.
- Verbetert de betrouwbaarheid van de assay door achtergrondruis van aspecifieke acetylering te elimineren.
- Maakt schaalbare productie van gemodificeerde proteïnen mogelijk voor high-throughput screeningplatforms.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijmt in vitro biochemische bevindingen met ziekterelevante post-translationele modificaties waargenomen in vivo.
- Ondersteunt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door functionele studies van acetylering in modelsystemen mogelijk te maken.
- Vermindert het translationele risico door de biologische gevolgen van specifieke acetyleringsgebeurtenissen te verduidelijken.
Integratie van Pipeline & Workflow
Dit protocol is geïntegreerd in het continuüm van ontdekking tot preklinisch onderzoek door het mogelijk maken van de generatie van site-specifiek geacetyleerde eiwitten voor hypothesetoetsing, assayontwikkeling en mechanistische studies.
- Discovery Biology: Ondersteunt het testen van nulhypothesen door directe vergelijking mogelijk te maken van wild-type en geacetyleerde eiwitvarianten.
- Screening: Levert reproduceerbare, hoogzuivere reagentia voor de ontwikkeling van kwantitatieve assays en de evaluatie van verbindingen.
- Analytics: Maakt nauwkeurige meting van acetylatie-afhankelijke functionele veranderingen mogelijk met behulp van western blotting en massaspectrometrie.
- Translational Research: Faciliteert de afstemming van in vitro bevindingen met in vivo acetylatiepatronen die relevant zijn voor ziektemodellen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het genereren van diverse site-specifiek gemodificeerde eiwitten voor meerdere targets.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit bij doelwitvalidatie.
- Operationele waarde: Standaardiseert de productie van gemodificeerde eiwitten met een hoge efficiëntie en zuiverheid.
- Strategische waarde: Maakt betere go/no-go-beslissingen mogelijk door de functionele impact van acetylering te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van doelwitten en signaalpaden op basis van robuust biochemisch bewijs.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in moleculaire klonering, eiwitexpressie en analyse van posttranslationele modificaties.
- Toegang tot E. coli-expressiesystemen, hulpmiddelen voor site-directed mutagenese en analytische platforms zoals western blotting en massaspectrometrie is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie van protocollen tussen teams voor reproduceerbaarheid en vergelijkbaarheid van gegevens.
- Kan aanpassing vereisen voor verschillende eiwitdoelen of expressiegastheren, afhankelijk van de projectbehoeften.
- Opbrengst en zuiverheid zijn afhankelijk van de optimalisatie van het acetyllysine-incorporatiesysteem en de selectie van de gastherenstam.
