Name: Detectie van een CDH1 zeldzame Transcript Variant in vers bevroren maagkanker weefsels door Chip gebaseerde digitale PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Leer een chip-gebaseerde digitale PCR-methode om zeldzame CDH1-transcriptvarianten in vers bevroren maagkankerweefsels te detecteren. Deze techniek verbetert de gevoeligheid en reproduceerbaarheid voor laag voorkomende doelen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs bedank Gráinne Tierney voor redactionele ondersteuning.

Het protocol volgt de richtsnoeren van de ethische commissie voor het eerste menselijke onderzoek.
Opmerking: Deze procedure is speciaal ontworpen voor de detectie van een laag aantal cDNA moleculen in vers bevroren weefsels. De weefselsecties zijn gesneden op droog ijs, terwijl nog steeds bevroren, uit eerder gevalideerde patiënt afkomstige maag tumor of normale weefselmonsters.
1. RNA isolatie en zuivering
<ol><li>
RNA extractie Opmerking: RNA isolatie wordt uitgevoerd onder de motorkap met behulp van een specifiek product (Zie Tabel van materialen). Echter, een verscheidenheid van isolatie kits zijn commercieel verkrijgbaar.<ol>
<li>Meng 50-100 mg van fijn gesneden vers bevroren weefsel monster in een 1,5 mL-buis met 1 mL van het RNA isolatie reagens en vortex krachtig voor 15 s. Incubate de buizen bij-80 ° C's nachts.</li>
		<li>Incubeer de buis het monster bij kamertemperatuur voor 5 min en mix bevattende vortexing voor 15 s.</li>
		<li>Houd de buis op ijs, voeg 200 µL van chloroform en vortex krachtig gedurende 15 s.</li>
		<li>Incubeer de buizen bij kamertemperatuur voor 60 s en centrifuge op 12.000 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C.</li>
		<li>Overdracht van de waterfase in een tube van 1,5 mL en voeg toe 20 µg van glycogeen. Opmerking: Het is belangrijk om zorgvuldig te voorkomen dat de interfase of organische laag om de verontreiniging verminderen.</li>
		<li>Voeg 500 µL van isopropanol, omkeren van de buis om te mengen en incubeer op ijs gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Centrifugeer de buis bij 12.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C te precipiteren van RNA. Opmerking: RNA zal in een gel-achtige pellet op de zijkant en onderkant van de buis, vaak onzichtbaar na het centrifugeren aanwezig zijn.</li>
		<li>Verwijder het supernatant zonder verstoring van de neerslag en wassen met 1 mL van 75% ethanol door pipetteren.</li>
		<li>Centrifugeer de buis bij 7.500 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en verwijder de bovendrijvende vloeistof zonder de pellet te verstoren.</li>
		<li>Laat de pellet drogen totdat het precipitaat transparant wordt en los het dan op in 50 µL RNase-gratis water.</li>
		<li>Het bevriezen van de monsters bij-80 ° C ten minste 's nachts vóór kwantificering.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eliminatie van genomic DNA en RNA zuivering Opmerking: Een DNase spijsvertering stap, gevolgd door een kolom gebaseerde RNA zuivering, wordt aanbevolen voor analyses van lage-overvloed doelen om te verteren contaminerende DNA.<ol>
<li>Los van het gelyofiliseerd DNase ik (1.500 Kunitz eenheden) in 550 µL van RNase-vrij water met een injectiespuit, meng zachtjes door het omkeren van de flacon, en de gereconstitueerde stockoplossing in aliquots verdelen.</li>
		<li>Overdracht van de berekende hoeveelheid monster met 15 µg RNA in een tube 1,5 mL, 10 µL van de DNase spijsvertering buffer uit de kit (vermeld in Tabel of Materials), 2,5 µL van DNase ik stockoplossing en RNase-gratis water 100 µL. Incubate bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.</li>
		<li>Voeg 350 µL van weefsel lysis buffer (Zie Tabel van materialenuit de kit) en meng door pipetteren.</li>
		<li>Voeg 250 µL van 100% ethanol en meng door pipetteren.</li>
		<li>Overdracht van het gehele volume (700 µL) in een nieuwe kolom van de spin en centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 15 s.</li>
		<li>Breng het filter in een nieuwe collectie buis, 500 µL van 80% ethanol toevoegen aan de kolom en de centrifuge op 12.000 x g gedurende 2 minuten.</li>
		<li>Open het deksel van de spin kolom en centrifuge op 12.000 x g gedurende 5 minuten met een nieuwe collectie buis te drogen van het filter; Breng het filter aan een 1,5 mL-buis.</li>
		<li>14 ÂµL van RNase-gratis water rechtstreeks toevoegen aan de kolom filter en centrifuge op 12.000 x g voor 1 min.</li>
		<li>Houd de monsters op ijs en overgaan tot kwantificering met behulp van 2 µL van het monster op een bank-top spectrofotometer of RNA bij-80 ° C bewaren tot gebruik.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. cDNA synthese
<ol><li>Plaats 1000 ng van RNA, 4 µL van master mix, 1 µL van reverse-transcriptase en RNase-gratis water tot een eindvolume van 20 µL in een steriele PCR-buis. Meng voorzichtig en spin naar beneden.</li>
	<li>Incubeer de mix in een thermische cycler, toepassing van de volgende voorwaarden: 5 min bij 25 ° C, 30 min op 42 ° C, 5 min op 85 ° C.</li>
	<li>De buizen kort centrifugeren en gaat u verder met de analyse van de dPCR of bewaren bij-20 ° C totdat het nodig is.</li>
</ol>3. digitale PCR reactie instellen
<ol><li>
dPCR reactie mix en proef de voorbereiding
	<ol>
<li>Ontdooi de master mix en de test bij kamertemperatuur gedurende ten minste 20 minuten.</li>
		<li>Verdun de cDNA monsters tot een concentratie van 300 ng in 6 ÂµL van water.</li>
		<li>Zachtjes vortex de master mix en de mix in een steriele buis met 8,7 µL van master mix, 0.87 µL van de CDH1a aangepaste ontworpen assay primer en 1,83 ÂµL van nuclease-gratis water voorbereiden een eindvolume van 11.4 µL. Opmerking: Zie de Tabel van materialenvoor CDH1a aangepaste ontworpen assay primer details.</li>
		<li>11.4 µL van het mengsel bereid overbrengen in het monster verdunde cDNA, meng zachtjes en kort centrifugeren. Opmerking: Volumes bevatten 20% teveel om volume verlies van pipetteren te compenseren. De mix voorbereiden op alle monsters en een sjabloon oncontroleerbaar (NTC).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van de chip Opmerking: Voor optimale resultaten laden de chips zo spoedig mogelijk.<ol>
<li>Sluit de lader chip en wacht totdat het indicatorlampje groen.</li>
		<li>Verwijder de dop van de immersie vloeistof spuit door het voorzichtig terugtrekken van de plunjer 1-2 mm en het vrijgeven van het om deze stap te vergemakkelijken, en te vervangen door een tip.</li>
		<li>Neem een nieuwe chip en neem nota van de code die is geschreven op het deksel te koppelen aan het monster.</li>
		<li>Houd het deksel zorgvuldig aan haar zijde, schil weg de beschermende folie, en plaats het deksel met de kleverige gezicht omhoog in de juiste richting.</li>
		<li>Zorgvuldig halen van een chip, verzorging niet te raken van het interne gedeelte, en het op het nest van de chip in de juiste positie te laden door op te drukken beneden de hendel te openen van de klem.</li>
		<li>Een nieuw mes van het laden op de lader laadt en duw voorzichtig om ervoor te zorgen dat er stevig op zijn plaats.</li>
		<li>Breng 14,5 µL van de dPCR reactie mix op het laden-blad zonder luchtbellen of afbuigspiegel het blad, na het indrukken van welke de zwarte knop om te verdelen het volume op de chip te laden.</li>
		<li>Gebruiken de immersie vloeistof spuit voor het overbrengen van ongeveer 20 druppels op het oppervlak van de chip verzorgen niet te raken het oppervlak met de tip. Opmerking: Het is belangrijk ter dekking van het gehele oppervlak zonder het morsen van vloeistof over de randen.</li>
		<li>Draaien van de arm van de lader om de deksel komen in contact met de chip en druk naar beneden voor 15 s.</li>
		<li>Druk op de knop van het deksel vrij te geven van de chip en de arm terug te keren naar zijn standpunt.</li>
		<li>Houden van de samengestelde chip op een hoek van 45° en zorgvuldig afzien van de immersie vloeistof met de spuit via de poort van de opvulling, draaien de chip iets naar zorg ervoor dat er geen luchtbellen en verwijder alle overtollige vocht met een steriel doekje.</li>
		<li>Zegel van het geval van de chip door voorzichtig peeling weg het label bovenop de deksel van de chip en de pers over de haven van de opvulling voor ten minste 5 s.</li>
		<li>Bewaren de chip in het donker tot klaar om te laden in de thermische cycler. Opmerking: Er is bereid chips dient binnen 2 uur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
dPCR-reactie
	<ol>
<li>Open het deksel en installeer de adapters naar beide blokken, zelfs wanneer een enkel vriesblok wordt gebruikt.</li>
		<li>Plaats de fiches op het monster blok in de juiste positie. Opmerking: De vulling poort moet gericht zijn op de voorkant van de thermische cycler in een verhoogde positie om eventuele luchtbellen te zweven naar de top zonder verstoring van het venster van de chip. Gebruik lege chips naar het evenwicht tussen de twee blokken.</li>
		<li>Leg de thermische pad op het blok van de steekproef te volledig dekken de chips.</li>
		<li>Sluit het deksel en de PCR uitvoert, de volgende voorwaarden toe te passen van het begin: Houd bij 96 ° C gedurende 10 minuten; 45 cycles van 60 ° C gedurende 2 minuten en 98 ° C voor 30 s; Houd bij 60 ° C gedurende 2 min; Houd bij 4 ° C. Uitschakelen van de thermische cycler en ontdooien van de chips bij kamertemperatuur gedurende ten minste 10 minuten. Opmerking: Chip analyse moet worden uitgevoerd binnen één uur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Chip analyse
	<ol>
<li>Open het deksel van het instrument en verwijder de thermal pads en de chips uit de adapters verwijderen. Opmerking: Bewaar de chips in een donkere, schone locatie tot analyse.</li>
		<li>Reinig het oppervlak van de chip met isopropanol en een steriel doekje. Opmerking: Inspecteer elke spaander voor lekken of potentiële problemen.</li>
		<li>Steek de USB in de detector systeem de gegevens op te slaan.</li>
		<li>Open de lade van de spaander van de detector systeem, laden de chip gezicht-up in de juiste positie en sluit de lade.</li>
		<li>Wacht 30 s voor verwerking, dan verwijderen van de chip en de volgende dia invoegen.</li>
		<li>Wacht tot de analyse te worden voltooid voor alle verwerkte chips dan de USB in een computer om de bestanden plaatst. Opmerking: De totale tijd voor analyse is ongeveer 2 tot 3 min/chip.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. data-analyse en interpretatie
<ol><li>Verbinden met de cloud-gebaseerde softwareplatform dat nodig is voor het uitvoeren van alle downstream analyses.</li>
	<li>Een project maken en importeren van alle gegevensbestanden van de chips van belang.</li>
	<li>Voer de naam van het monster; Selecteer de kleurstof en assay gebruikt in het tabblad "Define Chips".</li>
	<li>Bepalen of de chip door het visualiseren van het in het tabblad "Toetsing gegevens" controleren hoe grondig het monster op de chip was geladen en hoeveel gegevenspunten zijn beoordeelbare aanvaardbaar is. Opmerking: Verwerpen chips met minder dan 13.000 beoordeelbare gegevenspunten.</li>
	<li>Ga naar de scatterplot van de geselecteerde chip aan de rechterkant van het scherm; een drempel van 6.000 voor de fluoresceïne amidite (FAM) verslaggever kleurstof signalen (y-as) van toepassing op alle de chips. Opmerking: De drempel instellen kan variëren aan de hand van de testen gebruikt.</li>
	<li>Verwijder geen dubieuze positieve signalen om te voorkomen dat vals-positieve resultaten door het selecteren van de relatieve plek op de scatter plot met behulp van het gereedschap lasso en op "onbepaald" te drukken. Alle resterende positieve plekken wijzen op de aanwezigheid van cDNA exemplaren van de zeldzame doelstelling geanalyseerd.</li>
</ol>

<ol><li>van Roy, F., Berx, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell-cell+adhesion+molecule+E-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The cell-cell adhesion molecule E-cadherin.</a> Cell Mol Life Sci. 65 (23), 3756-3788 (2008).</li>
<li>Carneiro, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+dysfunction+in+gastric+cancer%3A+cellular+consequences%2C+clinical+applications+and+open+questions%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">E-cadherin dysfunction in gastric cancer: cellular consequences, clinical applications and open questions.</a> FEBS Lett. 586 (18), 2981-2989 (2012).</li>
<li>Corso, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+mutations+and+deletions+of+the+E-cadherin+gene+predict+poor+survival+of+patients+with+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Somatic mutations and deletions of the E-cadherin gene predict poor survival of patients with gastric cancer.</a> J Clin Oncol. 31 (7), 868-875 (2013).</li>
<li>Pinheiro, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+initiation+arising+from+E-cadherin%2FCDH1+intron2%3A+a+novel+protein+isoform+that+increases+gastric+cancer+cell+invasion+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcription initiation arising from E-cadherin/CDH1 intron2: a novel protein isoform that increases gastric cancer cell invasion and angiogenesis.</a> Hum Mol Genet. 21 (19), 4253-4269 (2012).</li>
<li>Abou Khouzam, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+identifies+changes+in+CDH1+%28E-cadherin%29+transcription+pattern+in+intestinal-type+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Digital PCR identifies changes in CDH1 (E-cadherin) transcription pattern in intestinal-type gastric cancer.</a> Oncotarget. 8 (12), 18811-18820 (2017).</li>
<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+Digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Sci Rep. 7 (1), (2017).</li>
<li>Basu, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+Assays+Part+I%3A+Partitioning+statistics+and+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Technol%22%5BJournal%5D)">Digital Assays Part I: Partitioning statistics and digital PCR.</a> SLAS Technol. 22 (4), 369-386 (2017).</li>
<li>Huggett, J. F., Whale, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+as+a+novel+technology+and+its+potential+implications+for+molecular+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Digital PCR as a novel technology and its potential implications for molecular diagnostics.</a> Clin Chem. 59 (12), 1691-1693 (2013).</li>
<li>Alikian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RT-qPCR+and+RT-Digital+PCR%3A+A+comparison+of+different+platforms+for+the+evaluation+of+residual+disease+in+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">RT-qPCR and RT-Digital PCR: A comparison of different platforms for the evaluation of residual disease in chronic myeloid leukemia.</a> Clin Chem. 63 (2), 525-531 (2017).</li>
<li>Hoshino, T., Inagaki, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+quantification+of+environmental+DNA+using+microfluidics+and+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Syst+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular quantification of environmental DNA using microfluidics and digital PCR.</a> Syst Appl Microbiol. 35 (6), 390-395 (2012).</li>
<li>Salvi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+AR+copy+number+and+outcome+to+enzalutamide+in+docetaxel-treated+metastatic+castration-resistant+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Circulating AR copy number and outcome to enzalutamide in docetaxel-treated metastatic castration-resistant prostate cancer.</a> Oncotarget. 7 (25), 37839-37845 (2016).</li>
<li>Tessitore, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+newly+produced+T+and+B+lymphocytes+by+digital+PCR+in+blood+stored+dry+on+nylon+flocked+swabs%5BTitle%5D)+AND+%22J.Transl.Med%22%5BJournal%5D)">Detection of newly produced T and B lymphocytes by digital PCR in blood stored dry on nylon flocked swabs.</a> J.Transl.Med. 15 (1), (2017).</li>
<li>Sho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+Improves+mutation+analysis+in+pancreas+fine+needle+aspiration+biopsy+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Digital PCR Improves mutation analysis in pancreas fine needle aspiration biopsy specimens.</a> PLoS One. 12 (1), e0170897(2017).</li>
<li>Conte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+to+detect+microRNAs+using+chip-based+QuantStudio+3D+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Novel method to detect microRNAs using chip-based QuantStudio 3D digital PCR.</a> BMC Genomics. 16, 849(2015).</li>
<li>Sanders, R., Mason, D. J., Foy, C. A., Huggett, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+digital+PCR+for+absolute+RNA+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Evaluation of digital PCR for absolute RNA quantification.</a> PLoS One. 8 (9), e75296(2013).</li>
</ol>

De auteurs melden geen belangenconflicten voor dit werk.

dPCR werd oorspronkelijk ontwikkeld voor DNA moleculaire metingen10,11,12,13 en op tijd die werd deze technologie aangepast voor de kwantificering van microRNAs en RNA afschriften5, 14,,15. In dit protocol hebben we de lijst van toepassingen tot opsporing van zeldzame afschriften afgeleid van vers bev...

Het CDH1 -gen codeert voor E-cadherine, een belangrijke factor die betrokken zijn bij het onderhoud van de normale maag epitheel via de regulering van de cel adhesie, overleving, proliferatie en migratie1. Verlies van E-cadherine eiwitten als gevolg van schadelijke germline of somatische wijzigingen van CDH1 is gekoppeld aan de ontwikkeling van GC2,3. Niet-canonieke afschriften die voortvloeien uit intron 2 van het gen hebben ook zijn veronderstelde om te spelen een rol in de maag carcinogenese4,5. In het bijzonder, een dergelijke transcript, CDH1a, is aangetoond moet worden uitgedrukt in GC cellijnen maar afwezig is uit de normale maag-4. We onlangs ontdekt CDH1a in GC weefselmonsters van GC patiënten met chip gebaseerde dPCR5. dPCR werd gebruikt om te evalueren, voor het eerst, de aanwezigheid van het CDH1a gene transcript in intestinale GC en in normale weefsel.
De gouden standaard methode om te bepalen van genexpressie is kwantitatieve PCR in real time (qPCR). Echter de resulterende gegevens kunnen soms variabele en van slechte kwaliteit, vooral wanneer het niveau van de doelgroep in de steekproef is laag. Deze variabiliteit kan worden veroorzaakt door verontreinigingen, die remming van polymeraseactiviteit en primer gloeien, wat leidt tot niet-specifieke versterking en concurrerende kant reacties6.
Hoewel de biochemische basisprincipes van dPCR vergelijkbaar met die van qPCR zijn, dPCR toont enkele voordelen, waardoor voor zeer nauwkeurige metingen van genomic DNA (gDNA) / complementaire DNA (cDNA) moleculen. Inderdaad, dPCR is een eindpunt reactie die is gebaseerd op de geijkte partitioneren van een monster in duizenden wells, zodat elk goed nul of een één doelmolecule bevat. Versterking vervolgens treedt alleen op in de putjes met een kopie van de doelgroep en wordt aangegeven door een fluorescerende signaal. Het absolute aantal doel moleculen in de oorspronkelijke steekproef kan vervolgens worden berekend door het bepalen van de verhouding van positief naar totale partities met behulp van de binomiale Poisson statistieken7.
Bovendien, de techniek van de dPCR elimineert de noodzaak voor het uitvoeren van een standaard curve en dus de bijbehorende bias en variabiliteit, waardoor een directe kwantificering van de doelstellingen van de8,9; het produceert meer nauwkeurige en reproduceerbare resultaten onafhankelijk van contaminanten en efficiëntie toe te schrijven aan zijn hoge tolerantie voor remmers10; het is meer gevoelig en specifiek zijn dan qPCR, en is dus een betrouwbare methode voor de detectie van een zeldzame doel. Tot slot, het partitioneren van het monster in meerdere reacties vermindert de competitie met achtergrond moleculen en verbetert de limiet van Doelsector Detectie, versterking mogelijk te maken en het vergemakkelijken van de detectie van afzonderlijke moleculen van gDNA/cDNA6 . De detectie en kwantificering van nucleic zuren door chip gebaseerde dPCR is steeds meer toegepast als u wilt kopiëren van nummer variatie, kwantificering van DNA fragmenten en mutatie analyseert11,12,13, gegeven de precisie en lage materiaal ingang eis van de methode. Bovendien, heeft dPCR onlangs zijn geïntegreerd in de analyse van beide microRNAs14 en gene afschriften5,15.

<table><tbody><tr><td>TRIazol Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen 20 mg/ml</td><td>ROCHE</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy MinElute Cleanup kit</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis kit</td><td>BioRad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A26358</td><td></td></tr><tr><td>CDH1a IDT custom designed assay</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td>NA</td><td>F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [dPCR geoptimaliseerde assayconcentraties: 900 nM (F),&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 900 nM (R), 250 nM (P)]</td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Digital PCR 20K Chip Kit v2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A26316</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Biofuge Fresco</td><td>Thermo&nbsp; Scientific</td><td>75002402</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler (Labcycler)</td><td>Sensoquest</td><td>011-103</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N805-0200</td><td></td></tr><tr><td>Dual Flat Block Sample Module</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4425757</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Tilt Base for Dual Flat Block GeneAmp PCR System 9700</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4486414</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Digital PCR Chip Adapter Kit for Flat Block Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4485513</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4482592</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3D Digital PCR Instrument with power cord</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4489084</td><td></td></tr></tbody></table>

detectie van een cdh1 zeldzame transcript variant in vers bevroren maagkanker weefsels door chip gebaseerde digitale pcr

Detection of a CDH1 Rare Transcript Variant in Fresh-frozen Gastric Cancer Tissues by Chip-based Digital PCR

CDH1a, een niet-canonieke transcript van de CDH1 -gen, is gebleken dat moet worden uitgedrukt in sommige cellijnen van maagkanker (GC), terwijl het is afwezig in normaal maagslijmvlies. Onlangs ontdekt we CDH1a transcript variant in vers bevroren tumor weefsels verkregen van patiënten met GC. De uitdrukking van deze variant in weefselsteekproeven werd onderzocht door de chip gebaseerde digitale PCR (dPCR) hier gepresenteerde benadering. dPCR biedt de mogelijkheid voor een nauwkeurige, robuuste en zeer gevoelige meting van nucleïnezuren en wordt steeds meer gebruikt voor vele toepassingen in verschillende velden. dPCR is geschikt voor het opsporen van zeldzame doelstellingen; dPCR biedt bovendien de mogelijkheid voor absolute en precieze kwantificering van nucleïnezuren zonder de noodzaak voor kalibratoren en standaard curven. In feite, verrijkt de reactie partitionering het doel van de achtergrond, die versterking efficiëntie en tolerantie voor remmers worden. Deze kenmerken maken dPCR een optimale tool voor de detectie van de zeldzame transcript van CDH1a .

Met behulp van de procedure die hier, wij gecontroleerd voor de uitdrukking van de zeldzame transcript variant CDH1a in maag vers bevroren weefsels. De analyse door dPCR werd uitgevoerd op 21-gepaarde normaal en kanker weefselsteekproeven en in 11 extra tumor monsters. CDH1a was in 15 van 32 (47%) tumoren, worden opgespoord, terwijl geen normale weefselsteekproeven de aanwezigheid van deze zeldzame transcript5 toonde. In onze analyse, chips met mi...

Het manuscript beschrijft een chip gebaseerde digitale PCR assay om te ontdekken een zeldzame CDH1 transcript variant (CDH1a) in normale vers bevroren en tumor weefsels verkregen van patiënten met maagkanker.

Detectie van een CDH1 zeldzame Transcript Variant in vers bevroren maagkanker weefsels door Chip gebaseerde digitale PCR

CDH1a, a non-canonical transcript of the CDH1 gene, has been found to be expressed in some gastric cancer (GC) cell lines, whereas it is absent in normal ...

Het algemene doel van deze methode is om zeldzame transcriptvarianten in vers-bevroren weefsels te detecteren door middel van chip-gebaseerde digitale PCR. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het onderzoek naar kanker, zoals de detectie van zeldzame transcriptvarianten die betrokken kunnen zijn bij carcinogenese. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de detectie van lage abundantie doelwitten mogelijk maakt, waardoor de precisie en reproduceerbaarheid ten opzichte van de gouden standaard kwantitatieve PCR wordt verbeterd.Hoewel deze methode inzicht kan geven in de detectie van een laag aantal cDNA-moleculen in menselijk vers-bevroren weefsel, kan het ook worden toegepast op andere soorten biologische monsters. Over het algemeen zullen individuen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat het noodzakelijk is om enige vaardigheid te verwerven in het voorbereiden van de chips en het definiëren van parameters voor de analyse. Laat om te beginnen de mastermix en het assay gedurende minimaal 20 minuten op kamertemperatuur ontdooien.Laad vervolgens 0,5 milliliterbuisjes met zes microliter aliquoten van de cDNA-monsters. Maak ook een controlebuisje zonder sjabloon. Vorens, meng de mastermix voorzichtig en pipet 8,7 microliter per reactie in een steriele buis.Voeg vervolgens voor elke reactie 0,87 microliter van de aangepaste assayprimer toe en voeg 1,83 microliter nuclease-vrij water toe. Meng de combinatie voorzichtig en breng 11,4 microliter over naar elke buis met cDNA en naar de controlebuis zonder sjabloon. Roer vervolgens de buisjes voorzichtig en verzamel de inhoud van de buisjes met behulp van pulse centrifugatie.Voor optimale resultaten, laad de chips zo snel mogelijk. Sluit de chiplader aan en wacht tot de indicatorlicht rood wordt. Bereid vervolgens de onderdompeling vloeistof spuit voor door voorzichtig de zuiger naar één tot twee millimeter te trekken, verwijder vervolgens de dop en voeg de tip toe.Let vervolgens op de code die op het deksel van een nieuwe chip staat geschreven. Houd het deksel voorzichtig aan de zijkant vast, trek de beschermfolie eraf en plaats het in het dekselnest met de klevende kant omhoog. Druk nu op de hendel om de klem te openen en laad voorzichtig de chip in het chipsnest.Plaats vervolgens een nieuw laadmes in de lader. Duw het voorzichtig om ervoor te zorgen dat het stevig op zijn plaats zit. Breng nu 14,5 microliter reactiemengsel over op het laadmes.Maak geen luchtbellen en laat het mes niet afbuiglen. Druk vervolgens op de zwarte laadknop om het volume op de chip te verdelen. Het is belangrijk om te bevestigen dat het laadmes op zijn plaats is.Terwijl u het mes vult, drukt u de pijp niet tot de tweede stop in, om luchtbellen te voorkomen. Buig ook het mes niet af met de tip. Gebruik vervolgens de spuit om ongeveer 20 druppels onderdompeling vloeistof op het oppervlak van de chip aan te brengen.Zorg ervoor dat u het oppervlak niet aanraakt met de tip en bedek het oppervlak volledig zonder het te overspoelen. Draai vervolgens de laarmede om de dop in contact met de chip te brengen en druk 15 seconden lang op de dop. Druk vervolgens op de dopknop om de chip los te laten en breng de laarmede terug in zijn rustpositie.Open nu de klem en houd de geassembleerde chip onder een hoek van 45 graden om de onderdompeling vloeistof voorzichtig via de vulpoort door een spuit te doseren. Draai vervolgens de chip lichtjes om luchtbellen te verwijderen en verwijder vervolgens eventueel overtollig vloeistof met een steriele doek. Vermijd het morsen van onderdompeling vloeistof op de rand van de chip.Als dat gebeurt, verwijder voorzichtig het overtollige voordat u afsluit. Verzegeld ten slotte de chipbehuizing door voorzichtig het label op het deksel af te pellen en vervolgens de vulpoort minimaal vijf seconden te blokkeren. Gebruik de chip nu binnen twee uur en bewaar deze in het donker tot die tijd.Om de reactie op te zetten, open de dop en installeer de adapters op beide blokken, zelfs wanneer een enkel blok wordt gebruikt. Plaats vervolgens een chip op de monstersblokken en richt de vulpoorten naar de voorkant van de thermische cycler, en verhoog de poort iets. Gebruik lege chips om de twee blokken in balans te brengen.Leg vervolgens de thermische pad over de opstelling om de chips volledig te bedekken. Programmeer vervolgens de cycli, sluit de deksel en start de reactie. Wanneer de reactie voorbij is, zet de thermische cycler uit, verwijder de thermische pads en verwijder vervolgens de chips.Laat de chips gedurende minimaal 10 minuten op kamertemperatuur ontdooien in het donker en analyseer ze binnen een uur. Reinig het oppervlak van de chip met isopropanol terwijl u ze inspecteert op lekken of andere problemen. Om de gegevens op te slaan, steekt u een USB-stick in het detectorsysteem, waar de gegevens kunnen worden opgeslagen.Open vervolgens de chiplade van het detectorsysteem en laad de chip met de zijde naar boven. Sluit de lade en wacht 30 seconden tot de gegevens zijn verwerkt. Verwijder vervolgens de chip en herhaal het proces voor de volgende chip.Verplaats vervolgens de USB-stick van de detector naar een computer en breng de bestanden over. Open de cloud-gebaseerde software, maak vervolgens een project aan en importeer alle gegevensbestanden voor de chips van belang. Selecteer vervolgens onder het tabblad Chips definiëren de kleurstof en het assay dat is gebruikt.Bepaal of de chip acceptabel is door deze te visualiseren in het tabblad Gegevens bekijken. Als het monster goed is geladen, zouden er ten minste 13.000 punten bruikbaar moeten zijn. Bekijk vervolgens de spreidingsgrafiek voor de geselecteerde chip.Pas daar een drempelwaarde toe die is gedefinieerd door het type assay. Voor het signaal van de fluoresceïne amiditekleurstof gebruikt u een drempelwaarde van 6.000. Verwijder nu alle twijfelachtige signalen die tot valse positieven kunnen leiden.Selecteer de twijfelachtige plek op de spreidingsgrafiek met behulp van het

detection-cdh1-rare-transcript-variant-fresh-frozen-gastric-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

This video demonstrates the utility of digital PCR in a chip-in-a-tube format for the detection of single nucleotide variations in DNA samples. A single PCR reaction is partitioned into chambers that act as independent PCR reactions, and the detection of fluorescence signals from the amplified targets in the chambers is used to compute the frequency of the variant allele in the sample.

Chip-in-a-Tube-Based Digital PCR for Quantification of Single Nucleotide Variants

This video demonstrates chip-based digital PCR — a variation of the digital PCR technique that is useful in detecting rare transcript variants. The PCR reaction is partitioned into the chambers of a nanofluidic chip, each of which acts as an independent reaction. The detection of fluorescence signals from the chambers with amplified targets confirms the presence of rare transcript variants in the sample.

Chip-Based Digital PCR to Detect Rare Transcript Variants Using a Nanofluidic Chip

Dit manuscript beschrijft een techniek voor het opsporen van mutaties van lage frequentie in ctDNA, ER-Seq. Deze methode is onderscheiden zich door het unieke gebruik van twee-directionele foutcorrectie, een speciale achtergrond filter en efficiënte moleculaire verwerving.

Detectie van zeldzame mutaties in CtDNA met behulp van de volgende generatie Sequencing

Digitale polymerase-kettingreactie (PCR) is een nuttig hulpmiddel voor het opsporen van hoog-gevoeligheid van één nucleotide varianten en DNA kopie nummer varianten. Hier tonen we belangrijke overwegingen voor het meten van zeldzame varianten in het menselijk genoom digitale PCR met de chip-in-a-tube-indeling.

Digitale Polymerase Chain Reaction Assay voor de genetische variatie in een sporadische familiale adenomateuze Polyposis patiënt met behulp van de Chip-in-a-tube-indeling

Hier presenteren we een protocol voor het opsporen van tumor somatische mutaties in het Circulerend DNA dat aanwezig is in patiënt biologische vloeistoffen (biovloeistoffen). Onze druppel digitale polymerase kettingreactie (dpcr)-gebaseerde methode maakt kwantificering van de tumor mutatie allel Frequency (MAF) mogelijk, waardoor een minimaal invasieve aanvulling op de diagnose en temporele monitoring van de tumorrespons wordt vergemakkelijkt.

Detectie en monitoring van tumor geassocieerd Circulerend DNA bij patiënt biovloeistoffen

Hierin beschrijven we een procedure voor genoombrede analyse van DNA-methylatie bij maag-darmkanker. De procedure is van belang voor studies die onderzoeken relaties tussen methylatiepatronen van genen en factoren die bijdragen aan carcinogenese bij maag-darmkanker.

Genoombrede analyse van DNA-methylatie bij maag- en darmkanker

Hier wordt een protocol gepresenteerd waarin meerdere bio-informaticatools worden gecombineerd om de biologische functies van TMEM200A bij kanker te bestuderen. Daarnaast valideren we ook experimenteel de bioinformatica voorspellingen.

Multiomics-analyse van TMEM200A als een pan-kanker biomarker

Dit protocol stelt holistische laboratoriumprocedures voor die nodig zijn om single nucleotide polymorfismen te detecteren in maagkankermonsters op basis van een ionenhalfgeleidersequencingplatform. De doelsequenties, ligatieadapters, bibliotheekversterking en -zuivering en kwaliteitscontrolecriteria worden ook in detail beschreven.

Detectie van multi-gen single nucleotide polymorfisme bij maagkanker op basis van Ion Semiconductor Sequencing Platform

Het protocol beschrijft een tandem-immunofluorescentiehybridisatietest met in formaline gefixeerd in paraffine ingebed weefsel om microRNA en gemultiplexte eiwitten tegelijkertijd te detecteren en te kwantificeren.

MicroRNA-amplificatie en -herkenning door middel van locked-nucleic-acid in situ hybridisatie als een nieuwe detectie- en kwantificeringsmethode

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling van een in vitro menselijke preklinische model van osteoclastogenesis uit perifeer bloed monocyten gekweekt met borst kanker cellijnen na te bootsen de kanker cel-osteoclast interactie. Het model kan worden gebruikt om verdere van ons begrip van metastase biomineralisatie en therapeutische opties te verbeteren.

Ontwikkeling van een menselijke preklinische Model van Osteoclastogenesis uit perifeer bloed monocyten mede gekweekt met borst kanker cellijnen

Leer een chip-gebaseerde digitale PCR-methode om zeldzame CDH1-transcriptvarianten in vers bevroren maagkankerweefsels te detecteren. Deze techniek verbetert de gevoeligheid en reproduceerbaarheid voor laag voorkomende doelen.

Detectie van een CDH1 zeldzame Transcript Variant in vers bevroren maagkanker weefsels door Chip gebaseerde digitale PCR

Meer video's verkennen