Name: Beoordeling van extracellulaire vesikel functie tijdens Malaria infectie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: Leer de functie van extracellulaire vesikels tijdens malaria-infectie met Plasmodium falciparum. Deze methode visualiseert vesikelopname door endotheelcellen en onderzoekt de regulerende rol van vesiculair RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd financieel gedeeltelijk ondersteund door de Stichting Novartis voor medisch - biologisch onderzoek (naar PYM), de Gottfried en Julia Bangerter-Rhyner-Stiftung (aan MW en PYM) en het zwembad van het onderzoek van de Universiteit van Freiburg (naar PYM). Aanvullende rechten omvatten de Zwitserse regering Excellence beurzen voor buitenlandse geleerden (KAB en SM). Wij danken Isabelle Fellay en Solange Kharoubi Hess voor technische ondersteuning.

Menselijke RBC werden verkregen uit het bloed van gezonde donoren, overeenkomstig de richtsnoeren van Swissethics (swissethics.ch).
Opmerking: P. falciparum parasiet culturen (3D 7) en EV productie eerder werden beschreven in Mbagwu, et al.. 11 want P. falciparum een menselijke pathogenen is, Raadpleeg de plaatselijke regelgeving voor behandeling. De culturen moeten steriel de hele tijd.
1. fluorescentie Labeling van EVs
Opmerking: De volgende procedure maakt gebruik van de labeling technologie te stabiel nemen een groen fluorescente kleurstof (PKH67) met grote alifatische staarten in de lipide-regio van de EV-membraan. De reactie wordt uitgevoerd in een 200 µL uiteindelijke kleuring van volume met een 20 µM eindconcentratie van PKH67. Voer alle stappen uit bij kamertemperatuur (20-25 ° C)
<ol><li>Plaats 100 µg van het EVW in 1 mL PBS in een microcentrifuge buis.</li>
	<li>Centrifugeer het EVW in een microcentrifuge buis op maximale snelheid (20.000 x g) gedurende 7 minuten naar pellet. Opmerking: Aangezien hemozoin in EVW aanwezig is, moet er een rood-donker bruinachtige pellet worden opgemerkt. Als het supernatant roodachtig, is dan de EVW hebben lysed.</li>
	<li>Gecombineerd het supernatans dat na het centrifugeren, zorgvuldig, om te voorkomen dat het verwijderen van eventuele EVs. Opmerking: Het minimaliseren van de hoeveelheid resterende buffer aanwezig voordat het EVW in verdunningsmiddel C resuspending teneinde de reproduceerbaarheid en de efficiëntie van de kleuring.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet EV in 100 µL van verdunningsmiddel C (2 X EV schorsing) en pipet zachtjes te verzekeren van volledige spreiding.</li>
	<li>Voorbereiden van een nieuwe microcentrifuge-buis en voeg 4 µL van de PKH67 ethanolbevattend kleurstof oplossing aan 100 µL verdunningsmiddel C. Vortex goed te mengen. Bereid dit 2 x kleurstof oplossing (40 µM) onmiddellijk voorafgaand aan de kleuring. Opmerking: Om te voorkomen dat heterogene kleuring, Voeg geen de PKH67 ethanolbevattend kleurstof oplossing rechtstreeks naar de EV-pellet.</li>
	<li>Snel, de 100 µL van 2 X EV schorsing (stap 1.4) te combineren met de 100 µL van 2 X kleurstof oplossing (stap 1.5). Meng vervolgens het monster door pipetteren op en neer 10 keer.</li>
	<li>Incubeer de opschorting van de EV/kleurstof uit stap 1.6 voor 5 min beschermd tegen licht en meng door vortexing 3 - 4 keer tijdens de incubatie 5 min. Opmerking: Het broeden van de opschorting van de EV/kleurstof voor langere tijden biedt geen enkel voordeel, omdat de kleuring zo snel is.</li>
	<li>Stop de kleuring reactie door toevoeging van een gelijk volume (200 µL) serum en incubeer gedurende 1 minuut aan de binding van overtollige kleurstof toestaan. Opmerking: Voordat u stopt de kleuring, afbreken het serum van EVs door centrifugeren bij 20.000 x g gedurende 20 min.</li>
	<li>3 keer wassen met PBS en spin down bij 20.000 x g gedurende 5 min. resuspendeer de EVs in 100 µL van PBS te bereiken een eindconcentratie van 1 µg/µL.</li>
</ol>2. het visualiseren van opname van het EVW door confocale microscopie
Opmerking: Het volgende protocol beschrijft het volgen van EV internalisering door endotheliale cellen geteeld op glas coverslips. De endotheliale cellen zijn semi-vereeuwigd menselijke beenmerg endotheliale cellen zoals beschreven in12.
<ol><li>Werken in een steriele omgeving, jas coverslips met een overmaat van 0,01% poly-L-lysine gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Gecombineerd de poly-L-lysine-oplossing en laat de coverslips volledig drogen.</li>
	<li>Het uitvoeren van een telling van de levensvatbare endothelial cel met behulp van Trypan blauwe uitsluiting en een hemocytometer.</li>
	<li>1 x 105 endotheliale cellen in 1 mL volledige Endothelial cel groeimedium bevattende de Supplement Mix aan de coverslips van poly-L-lysine-coated en laat de cellen groeien tot een enkelgelaagde overbrengen. Opmerking: Het medium bevat groeifactoren waarmee cellen te vormen een enkelgelaagde en strakke kruispunten.</li>
	<li>Zodra de cellen een enkelgelaagde vormen, zorgvuldig gecombineerd van het medium en voeg 1 mL verse medium te wassen van de cellen. Herhaal nogmaals het wassen. Voeg 50 µg PKH67-geëtiketteerden EVs en incubeer gedurende 4 uur. Opmerking: Om te zoeken naar het optimale tijdstip voor opname, een tijd-cursus kan worden uitgevoerd.</li>
	<li>Na 4 uur, gecombineerd het medium, en wassen van de cellen 3 keer met PBS te verwijderen overtollige en niet-afhankelijke EVs. Het herstellen van de cellen met de 3% paraformaldehyde-oplossing in PBS gedurende 15 minuten. Opmerking: Methanol kan verstoren actine tijdens het proces van de fixatie; Daarom is het beste om te voorkomen dat eventuele methanol met fixatives of andere fixatives op basis van oplosmiddelen. Het is aanbevolen om gebruik van methanol-vrije formaldehyde als een hechtmiddel.</li>
	<li>Wassen van de cellen 3 keer met PBS. Voeg zorgvuldig 250 µL van 0,1% Triton X-100 in PBS te permeabilize van de cellen. Incubeer bij RT gedurende 5 min.</li>
	<li>3 keer wassen met PBS. Voeg 400 µL van blokkeerbuffer (5% BSA in PBS) gedurende 30 minuten op RT te blokkeren van niet-specifieke binding.</li>
	<li>Wassen van de cellen een keer met PBS. Bereid de kleurstofoplossing door verdunnen 5 µL van de stockoplossing van de phalloidin in 200 µL PBS/1% BSA per elke cover slip. Pipetteer 200 µL van de kleurstofoplossing op het dekglaasje aan en incubeer gedurende 20 min op RT.</li>
	<li>3 keer wassen met PBS. Counterstain van het DNA voor 30 s met Hoechst 33342 op een eindconcentratie van 2 µg/mL in 200 µL van PBS.</li>
	<li>Wassen 2 x het dekglaasje aan door het toevoegen van 400 µL van PBS. Zorgvuldig het dekglaasje aan pak met een tang en omkeren van het op de bovenkant van een daling van antifade montage media op een glasplaatje. Verwijder voorzichtig het overtollige medium met een tissue en verzegelen van iedere kant met nagellak.</li>
	<li>Opslaan van de dia's beschermd tegen het licht bij 4 ° C.</li>
	<li>Visualiseren van de cellen met behulp van een confocal microscoop op laser excitaties 405, 488 en 543 nm en een 63 X, 1.3 nb olie doelstelling met fluorescerende emissies bij 450-470 nm (blauw), 505-530 nm (groen) en 620 nm. Opmerking: Typische F-actine kleuring resultaten worden weergegeven in Figuur 1.</li>
</ol>3. endothelial cel permeabiliteit
Opmerking: Endothelial cel permeabiliteit wordt beoordeeld door het meten van de overdracht van rhodamine B isothiocyanaat-dextran (gemiddelde MW 70.000) over de enkelgelaagde endothelial cel. Dextran biedt een uitstekend hulpmiddel om te bestuderen van vasculaire permeabiliteit.
<ol><li>Levensvatbare endotheliale cellen tellen met behulp van 0,4% Trypan blauwe uitsluiting en een hemocytometer.</li>
	<li>Plaat de endotheliale cellen bij een dichtheid van 0,6 x 105 cellen tot samenkomst in 24-well weefselkweek insert (poriegrootte 0.4 µm) en verlof ongestoord gedurende ten minste 5 dagen om te vormen van gedifferentieerde monolayers. Vernieuw het medium elke tweede dag.</li>
	<li>Zodra de cellen een enkelgelaagde bereiken, laden de EVs (50 µg in 1 mL) op de bovenste kamer. De rhodamine-dextran toevoegen aan het hoogste goed op een eindconcentratie van 20 mg/mL. Incubeer de cellen bij 37 ° C met 5% CO2.</li>
	<li>Toezicht op de overdracht van de fluorescerende dextran aan de onderkant goed door het meten van de emissie van de fluorescentie van 40 µL middellange aliquots. Instellen van de multilabel microplate-lezer op 544 nm excitatie en 590 nm emissie voor metingen. Nota: Het bedrag van diffuus dextran kan worden gekwantificeerd aan de hand kalibratiekrommen opgericht met de stockoplossing. Bovendien, kunnen kinetische experimenten worden uitgevoerd door het verwijderen van kleine steekproeven van het buitenste kamer medium tijdens een tijdsverloop (Figuur 2). Zelfs zonder behandeling, zal de dextran verspreiden via de cel enkelgelaagde.</li>
</ol>4. bepalen van de gevoeligheid van de Puromycin
Opmerking: Voordat de transducing van de cellijnen met lentivirus, is het belangrijk om te bepalen van de curve van het doden van een geselecteerde drug voor die bepaalde cel-lijn. Om te bepalen van de minimale hoeveelheid drugs concentratie nodig zijn om te doden alle cellen, een dosis-respons experiment met behulp van incrementele doses van de geselecteerde drug uit te voeren. Omdat elke regel zoogdiercellen een andere gevoeligheid, voor experimenten heeft, moet de optimale concentratie van het antibioticum worden bepaald door de ontwikkeling van de titratie curve doden zoals hieronder beschreven.
<ol><li>Met behulp van de hemocytometer cellen te tellen. Resuspendeer de endotheliale cellen bij een concentratie van 1 x 105 cellen/mL in volledige Endothelial cel groeimedium, met de aanvulling Mix.</li>
	<li>1 x 10 bord4 cellen in een 96-wells-plaat in een eindvolume van 100 µL van het Endothelial cel groeimedium.</li>
	<li>Voeg 100 µL van medium met de antibiotica om te verkrijgen van een concentratie van 0,1-10 µg/mL (Zie Figuur 3).</li>
	<li>Bestuderen van de levensvatbaarheid van de cellen om de 2 dagen onder een lichte Microscoop met behulp van een 20 X doelstelling. Cultuur van de cellen voor 10-14 dagen en vervangt u het medium met puromycin elke 2-3 dagen afhankelijk van de celgroei.</li>
	<li>Voeg 10 µL per putje MTS reagens in elk putje, mix, en incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C in standaard cultuuromstandigheden.</li>
	<li>Schud de plaat kort op een shaker en meten van de extinctie van behandeld en onbehandeld cellen met behulp van een afleesapparaat op 490 nm (Figuur 3).</li>
</ol>5. transductie van endotheliale cellen met lentivirale Vector
<ol><li>5 endotheliale cellen van de plaat 1 x 10 in 1 mL volledige voedingsbodem eergisteren transductie. Transductie uitvoeren wanneer de cellen hebben 50-80% confluentie bereikt.</li>
	<li>Ontdooi de lentivirus op ijs, en maken aliquots van de virale voorraden om te voorkomen dat cycli bevriezen-ontdooien. Spin van het materiaal bij 200 x g voor 30 s, in buizen alvorens te openen om te voorkomen lekkage.</li>
	<li>Hexadimethrine bromide (en) toevoegen aan de cellen op een eindconcentratie van 8 µg/mL. Opmerking: Hexadimethrine bromide (en) helpt de doelmatigheid van de signaaltransductie, maar in sommige gevallen kan het zijn giftig voor de cellen. Daarom is de optimale concentratie moet worden bepaald door het uitvoeren van een curve doden voordat de signaaltransductie.</li>
	<li>Swirl de plaat voorzichtig te mengen. Voeg de juiste hoeveelheid van virale deeltjes (tussen 0,5-2 x 106 deeltjes) op een geschikte veelvoud van infectie (MOI) en de plaat gedurende 30 zachtjes swirl s te mengen.</li>
	<li>Centrifugeer de mix van de cel-virale deeltjes in de centrifuge op RT voor 45 min bij 300 x g de signaaltransductie-efficiëntie te verhogen. Incubeer de cel-virale deeltjes mengsel bij 37 ° C's nachts.</li>
	<li>Verwijder zorgvuldig het virale deeltjes-bevattende medium en op de juiste wijze verwijderen. Verse, voorverwarmde kweekmedium volledig te vervangen.</li>
	<li>Begin de selectie met een puromycin op de tweede dag: het medium verwijderen en vervangen door verse medium met de juiste concentratie van puromycin, eerder bepaald in punt 4 (Figuur 3).</li>
	<li>Oogsten van cellen na puromycin selectie en isoleren van RNA met behulp van een RNA isoleren kit na instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Uitvoeren van cDNA synthese met de geselecteerde miRNAs met behulp van een omgekeerde transcriptie kit (Zie de Tabel van de materialen).</li>
	<li>De reactie van de qPCR volgens het genoemde protocol13instellen.</li>
</ol>

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.who.int/malaria/publications/world-malaria-report-2015/report/en/">WHO Malaria Report 2015</a>. , (2015).</li>
<li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11832955">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).</li>
<li>Mantel, P. Y., Marti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+extracellular+vesicles+in+Plasmodium+and+other+protozoan+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of extracellular vesicles in Plasmodium and other protozoan parasites.</a> Cell Microbiol. 16 (3), 344-354 (2014).</li>
<li>Couper, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasite-derived+plasma+microparticles+contribute+significantly+to+malaria+infection-induced+inflammation+through+potent+macrophage+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Parasite-derived plasma microparticles contribute significantly to malaria infection-induced inflammation through potent macrophage stimulation.</a> PLoS Pathog. 6 (1), e1000744(2010).</li>
<li>Schofield, L., Grau, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+processes+in+malaria+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunological processes in malaria pathogenesis.</a> Nat Rev Immunol. 5 (9), 722-735 (2005).</li>
<li>Mantel, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria-infected+erythrocyte-derived+microvesicles+mediate+cellular+communication+within+the+parasite+population+and+with+the+host+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system.</a> Cell Host Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).</li>
<li>Regev-Rudzki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+communication+between+malaria-infected+red+blood+cells+via+exosome-like+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell-cell communication between malaria-infected red blood cells via exosome-like vesicles.</a> Cell. 153 (5), 1120-1133 (2013).</li>
<li>Szempruch, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Vesicles+from+Trypanosoma+brucei+Mediate+Virulence+Factor+Transfer+and+Cause+Host+Anemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extracellular Vesicles from Trypanosoma brucei Mediate Virulence Factor Transfer and Cause Host Anemia.</a> Cell. 164 (1-2), 246-257 (2016).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li>
<li>Mantel, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infected+erythrocyte-derived+extracellular+vesicles+alter+vascular+function+via+regulatory+Ago2-miRNA+complexes+in+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Infected erythrocyte-derived extracellular vesicles alter vascular function via regulatory Ago2-miRNA complexes in malaria.</a> Nat Commun. 7, 12727(2016).</li>
<li>Mbagwu, S., Walch, M., Filgueira, L., Mantel, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+Characterization+of+Extracellular+Vesicles+in+Malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Production and Characterization of Extracellular Vesicles in Malaria.</a> Methods Mol Biol. 1660, 377-388 (2017).</li>
<li>Schweitzer, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+newly+established+human+bone+marrow+endothelial+cell+line%3A+distinct+adhesive+properties+for+hematopoietic+progenitors+compared+with+human+umbilical+vein+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Characterization of a newly established human bone marrow endothelial cell line: distinct adhesive properties for hematopoietic progenitors compared with human umbilical vein endothelial cells.</a> Lab Invest. 76 (1), 25-36 (1997).</li>
<li>Wong, W., Farr, R., Joglekar, M., Januszewski, A., Hardikar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probe-based+Real-time+PCR+Approaches+for+Quantitative+Measurement+of+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li>
<li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li>
<li>French, K. C., Antonyak, M. A., Cerione, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+docking+at+the+cellular+port%3A+Extracellular+vesicle+binding+and+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle docking at the cellular port: Extracellular vesicle binding and uptake.</a> Semin Cell Dev Biol. 67, 48-55 (2017).</li>
<li>Montecalvo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+transfer+of+functional+microRNAs+between+mouse+dendritic+cells+via+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes.</a> Blood. 119 (3), 756-766 (2012).</li>
<li>Idro, R., Jenkins, N. E., Newton, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis%2C+clinical+features%2C+and+neurological+outcome+of+cerebral+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis, clinical features, and neurological outcome of cerebral malaria.</a> Lancet Neurol. 4 (12), 827-840 (2005).</li>
<li>Jambou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+adhesion+on+human+brain+microvascular+endothelial+cells+involves+transmigration-like+cup+formation+and+induces+opening+of+intercellular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum adhesion on human brain microvascular endothelial cells involves transmigration-like cup formation and induces opening of intercellular junctions.</a> PLoS Pathog. 6 (7), e1001021(2010).</li>
<li>Zhou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-secreted+miR-105+destroys+vascular+endothelial+barriers+to+promote+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer-secreted miR-105 destroys vascular endothelial barriers to promote metastasis.</a> Cancer Cell. 25 (4), 501-515 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Verscheidene parasieten, waaronder Toxoplasma, Leishmania, Trypanosoma en Trichomonas leiden tot de release van het EVW door de geïnfecteerde gastheercel. Afhankelijk van de ziekteverwekkers, kunnen de vrijgegeven EVs moduleren van de immuunrespons van de gastheer of cellulaire communicatie tussen de parasieten6bemiddelen. Toch is er weinig aanwijzingen hoe deze kleine blaasjes bijdragen aan de ziekte malaria. Hier hebben we verschillende manieren om te onderzoeken van de functie van het EVW tijde...

Volgens de World Health Organization, er waren 212 miljoen nieuwe gevallen van malaria wereldwijd in 2015 en ongeveer 429,000 mensen zijn omgekomen, voornamelijk kinderen jonger dan vijf jaar leeftijd1. De mechanismen die leiden tot een ernstige aandoening, die vaak geassocieerd met vasculaire dysfunctie wordt, blijven vaag2. Plasmodium- iRBCs afscheiden kleine bi-lipide membraan bollen extracellulaire blaasjes (EVs) genoemd. Het is bekend dat deze EVs potentieel relevant zijn aan het proces van de infectie en aan de immuunrespons van de gastheer voor infectie; echter, er is weinig bekend over de exacte functie van deze kleine blaasjes tijdens malaria infectie3. Het is mogelijk dat zij twee belangrijke rollen spelen: aan de ene kant kunnen ze bijdragen aan de pathogenese door activering van macrofagen4,5; en aan de andere kant, ze cellulaire communicatie tussen parasieten en tussen parasieten en host6,7zou kunnen bemiddelen. In feite, kunnen parasieten overbrengen eiwitten of nucleïnezuren tussen elkaar via EVs. Bijvoorbeeld, Trypanosoma brucei rhodesiense EVs virulentiefactor Serum Resistance-Associated (SRA) kunt overbrengen, en zowel andere T. brucei en gastheer erytrocyten8kunt richten. Bovendien, P. falciparum- iRBCs communicatie tussen elkaar door de overdracht van nucleïnezuren binnen EVs. Hierdoor is de parasieten te optimaliseren en haar groei te synchroniseren. EVs kunnen in feite worden de belangrijke regulator van gametocyt conversie en dragen dus bij tot de regulering van de transmissie fase7.
Niet alleen doen EVs regelen de parasieten, ze ook bemiddelen parasiet-gastheer interacties. Onlangs ontdekten we dat EVs van iRBCs host-afgeleide microRNAs (miRNAs; kleine soorten van de RNA in het bereik van 21-25 nucleotiden9) die in beslag door menselijke endotheliale cellen genomen waren bevatten. De miRNAs in de EVs vormen een stabiele complex met Ago2 (een lid van de RNA-geïnduceerde silencing complex), die zodra geleverd aan de ontvangende cellen, in staat is van specifiek monddood maken van de expressie van genen en invloed op de eigenschappen van de barrière van de cellen10. Standaard protocollen zijn ontwikkeld voor het onderzoek naar de functie van het EVW. Hier beschrijven we eerst een protocol waarmee de fluorescerende labeling van het EVW te onderzoeken hun acceptatie door de ontvangende cellen. Bovendien, met behulp van een confocal microscoop, is het mogelijk om bij te houden van de EV lot in de cel. Verschillende fluorescente kleurstoffen kunnen worden gebruikt voor het bijhouden van EVs. De amine-reactieve kleurstof, 5-(and-6)-Carboxyfluorescein-DIACETAAT-Succinimidyl Ester (CFSE) en calceïne-AM geworden TL eenmaal binnen de blaasjes. Wij graag gebruiken het amfifiele label, PKH, want het geeft een helderder en meer uniforme signaal. Deze aanpak geeft belangrijke informatie om te begrijpen van de interacties tussen het EVW en ontvangende cellen. Terwijl in sommige gevallen EVs aan het oppervlak van de cellen binden, worden sommige blaasjes snel opgenomen. Bij opname leveren EVs hun lading aan de cellen, waarin zij hun regelgevende taken uitoefenen.
Hier beschrijven we een protocol voor het meten van de barrièrefunctie van de endotheliale cellen in vitro door het kwantificeren van de overdracht van een fluorescerende dextran via een cellulaire enkelgelaagde. Gevoeliger traceurs kunnen worden gebruikt zoals radiolabeled markeringen. Ze vereisen echter speciale voorzorgsmaatregelen voor gebruik. Andere testen bestaan voor het meten van de barrièrefunctie in vitro zoals signaalcomplexen elektrische weerstand (TEER), die tight junction integriteit meet. Tot slot het visualiseren van ZO-1, een strakke junction eiwit, met immunofluorescentie kunt beoordeling van strakke junction betrouwbaarheid als goed10. Aangezien EVs complexe en heterogene entiteiten met verschillende ladingen met potentiële regelgevende karakteristiek zijn, is het nuttig om te overexpress een specifieke RNA om te bestuderen van de gevolgen daarvan voor de ontvangende cel. Daarom, definiëren we ook een protocol dat gericht is op het genereren van stabiele cellijnen uiten de miRNA van belang10.

<table><tbody><tr><td>PKH67 Green Fluorescent Cell Linker Mini Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Diluent C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8278</td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher - Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin CF594</td><td>Biotium</td><td>#00045</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher</td><td>P36934</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine B isothiocyanate&ndash;Dextran</td><td>ThermoFisher</td><td>R9379-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Insert with PET membrane transparent Falcon&nbsp;for plate 24 wells</td><td>Falcon</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth&nbsp;Medium MV</td><td>Promocell</td><td>C-22020</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin dihydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620-10ML</td><td></td></tr><tr><td>MTS Cell Proliferation Colorimetric Assay Kit</td><td>Biovision</td><td>K300-500</td><td></td></tr><tr><td>hexadimethrine bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td></td></tr><tr><td>MISSION&nbsp;Lenti microRNA, Human hsa-miR-451a</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HLMIR0583</td><td></td></tr><tr><td>MISSION Lenti microRNA, ath-miR416, Negative Control 1 Transduction Particles</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NCLMIR001</td><td></td></tr><tr><td>MISSION&nbsp;Lenti microRNA, Human</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NCLMIR0001</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 1000 reactions</td><td>ThermoFisher</td><td>4366597</td><td></td></tr><tr><td>hsa-mir-451a&nbsp;RT/750 PCR rxns</td><td>ThermoFisher</td><td>001141</td><td></td></tr><tr><td>U6 snRNA</td><td>ThermoFisher</td><td>001973</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, with UNG</td><td>ThermoFisher</td><td>4440038</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR System</td><td>ThermoFisher</td><td>4376600</td><td></td></tr></tbody></table>

beoordeling van extracellulaire vesikel functie tijdens malaria infectie

Evaluation of Extracellular Vesicle Function During Malaria Infection

Malaria is een levensbedreigende ziekte veroorzaakt door Plasmodium parasieten, met P. falciparum is de meest voorkomende op het Afrikaanse continent en die verantwoordelijk is voor de meeste malaria sterfgevallen wereldwijd. Verschillende factoren, met inbegrip van vastlegging van de parasiet in de weefsels, vasculaire dysfunctie en inflammatoire reacties beïnvloedt de ontwikkeling van de ziekte malaria-geïnfecteerd mensen. P. falciparum-geïnfecteerde rode bloedcellen (iRBCs) vrij kleine extracellulaire blaasjes (EVs) met verschillende soorten lading moleculen die pathogenese en mobiele communicatie tussen parasieten en host bemiddelen. EVW zijn efficiënt opgepakt door cellen waarin zij hun functie moduleren. Hier bespreken we strategieën om de rol van het EVW in de parasiet-gastheer interacties. Eerst beschrijven we een eenvoudige methode voor het benoemen en tracking EV internalisering door endotheliale cellen, met behulp van een groene cel linker kleurstof. Ten tweede, rapporteren we een eenvoudige manier om te meten permeabiliteit over een enkelgelaagde endothelial cel met behulp van een fluorescently geëtiketteerde dextran. Tot slot laten we zien hoe te onderzoeken van de rol van kleine niet-coderende RNA-moleculen in functie endothelial cel.

We beschrijven hier protocollen voor het onderzoek naar de interacties van EVW met cellen van de gastheer. De opname van fluorescently geëtiketteerde EVs wordt gecontroleerd door confocale microscopie (Figuur 1). EVs, duren endotheliale cellen efficiënt maar de incubatietijd met EVs kan worden geoptimaliseerd voor het bijhouden van de opname. Voor een betere localisatie van het EVW in de cellen, vlek actine met phalloidin. Vervolgens gebruiken we een membraan...

In dit werk beschrijven we protocollen voor het onderzoek naar de rol van extracellulaire blaasjes (EVs) uitgebracht door Plasmodium falciparum geïnfecteerd erytrocyten. In het bijzonder richten we ons op de interacties van EVW met endotheliale cellen.

Beoordeling van extracellulaire vesikel functie tijdens Malaria infectie

Malaria is a life-threatening disease caused by Plasmodium parasites, with P. falciparum being the most prevalent on the African continent and responsible ...

Het algemene doel van deze procedure is om de functie van extracellulaire vesicles onderzocht te krijgen die vrijkomen door Malaria parasiet geïnfecteerde rode bloedcellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van Malaria, zoals hoe de parasieten de communicatie tussen parasiet en gastheer reguleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de visualisatie van vesiculaire arbitage door indoterot cellen onder studie van de regulatorische functie van het vesiculaire RNA door indoterot cellen.Het demonstreren van de procedure zullen Mya Alondez, Smartin Bagu en Bayo Babatunde zijn, allemaal afstudeerstudenten uit mijn laboratorium. Voeg in een microcentrifugebuisje 100 microgram extracellulaire vesicles en een milliliter fosfaat gebufferd zoutoplossing toe. Centrifugeer vervolgens de extracellulaire vesicles bij een maximale snelheid van 20.000 keer g gedurende zeven minuten om een pellet te vormen.Zodra de centrifugatie voorbij is, gooi de supernatant weg zonder het pellet te verstoren. Los vervolgens het pellet van de extracellulaire vesicles op in 100 microliters dilumate C. Om volledige menging te garanderen, pipet het meerdere keren. Vervolgens, in een nieuw microcentrifugebuisje, voeg vier microliters van de PKH67 ethanolische kleurstofoplossing toe aan 100 microliters dilmant C. Mix de oplossing vervolgens goed door elkaar.Bereid de 40 micromolar 2XPKH67 kleurstofoplossing net voor het kleuringsproces. Combineer vervolgens snel 100 microliters van twee keer de extracellulaire vesiculaire suspensie met een gelijk volume van de PKH67 ethanolische kleurstofoplossing. Pipet de mixtuur vervolgens 10 keer om een goede menging te garanderen.Na volledige menging, incubeer de extracellulaire vesiculaire en PKH67 ethanolische kleurstofoplossing gedurende vijf minuten weg van het licht. Tijdens het incuberen, blijf de mixtuur drie tot vier keer door elkaar mengen. Om de kleuringsreactie te stoppen, voeg 200 microliters serum toe aan de mixtuur en incubeer gedurende een minuut voor de overtollige kleurstof om te binden.Was vervolgens de extracellulaire vesicles drie keer met fosfaat gebufferde zoutoplossing. Na het wassen, centrifugeer het monster bij 20.000 keer g gedurende vijf minuten. Los vervolgens het pellet van de extracellulaire vesicles op in 100 microliters fosfaat gebufferde zoutoplossing om een uiteindelijke concentratie van één microgram per microliter te bereiken.Breng de endotheelcellen over in één milliliter volledig endotheelcel groeimedium naar een poly-elithene bekleed dekselglasje. Laat de cellen een monolaag op het dekglasje laten groeien. Nadat de monolaag is gevormd, verwijder voorzichtig het medium en voeg één milliliter vers medium toe om de cellen twee keer te wassen.Voeg vervolgens 50 microgram PKH67 gekleurde extracellulaire vesicles toe aan het dekglasje en incubeer gedurende vier uur. Na het incuberen, aspireer het medium. Om alle ongebonden extracellulaire vesicles te verwijderen, was de cellen drie keer met fosfaat gebufferde zoutoplossing.Er moet grote zorgvuldigheid worden betracht tijdens het manipuleren van de dekglasjes tijdens het kleuren door fijne tang te gebruiken om celverlies en breken van het dekglasje te voorkomen. Na het wassen, gebruik drie procent paraformaldehyde oplossing in fosfaat gebufferde zoutoplossing om de cellen gedurende 15 minuten te fixeren. Was de cellen opnieuw drie keer met fosfaat gebufferde zoutoplossing en voeg 250 microliters van 0,1 procent tritan x 100 toe in fosfaat gebufferde zoutoplossing om de cellen te permeabiliseren en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Was vervolgens de cellen drie keer met fosfaat gebufferde zoutoplossing en voeg 400 microliters blokkerende buffer toe aan de cellen. Incubeer vervolgens de cellen gedurende dertig minuten bij kamertemperatuur om niet-specifieke binding te voorkomen. Na het blokkeren, was de cellen eenmaal met fosfaat gebufferde zoutoplossing.Verdun vervolgens vijf microliters van de phalloiden stockoplossing in 200 microliters fosfaat gebufferde zoutoplossing met één procent bovien serumalbumine om de kleuroplossing voor elk dekglasje voor te bereiden. Voeg vervolgens 200 microliters van de kleuroplossing toe op het dekglasje en incubeer gedurende twintig minuten bij kamertemperatuur. Zodra de incubatie voorbij is, was de cellen drie keer met fosfaat gebufferde zoutoplossing.Gebruik vervolgens de uiteindelijke concentratie van twee microgram per milliliter van hooksed 3342 in 200 microliters fosfaat gebufferde zoutoplossing om het DNA gedurende 30 seconden tegenkleuren. Na het kleuren, voeg 400 microliters fosfaat gebufferde zoutoplossing toe om het dekglasje twee keer te wassen. Til vervolgens voorzichtig het dekglasje op met behulp van een pincet en draai het om op de top van een druppel antifade montage medium op een glasplaatje.Gebruik een doekje om voorzichtig eventueel overtollig medium te verwijderen en verzegel vervolgens de omringende ruimte met nagellak. Er moet ook grote zorgvuldigheid worden betracht om de cellen niet te veel bloot te stellen aan de kleurstof tijdens microscopie om celbleken te voorkomen. In een 24 wels weefselkweekinzet met 0,4 micromolair poriegrootte, zaai endotheelcellen.Laat de cellen vervolgens vijf dagen in de cultuur groeien zonder te worden gestoord om een gedifferentieerde monolaag te vormen. Ververs het medium elke tweede dag. Zodra de monolaag is gevormd, zaai 50 microgram in één milliliter extracellulaire vesicles op de bovenste kamer.Voeg vervolgens 20 milligram per milliliter rotomine dextran toe aan de bovenste put en incubeer bij 37 graden Celsius met vijf procent koolstofdioxide. Volg de migratie van de fluorescerende dextran naar de bodem van de put door de fluorescentiemissie van 40 microliters medium te meten. Programmeer vervolgens de excitatiegolflengte op 544 nanometer en emissiegolflengte op 590 nanometer voor een multi-label microplaatlezer.Gebruik een hemocytometer om het a

evaluation-of-extracellular-vesicle-function-during-malaria-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We tonen de methode voor het uitvoeren van intravitale microscopie van de milt met behulp van GFP transgene malariaparasieten en de kwantificering van de parasiet de mobiliteit en de bloedstroom binnen dit orgaan.

Intravitale Microscopie van de milt: Kwantitatieve Analyse van Parasite Mobiliteit en Blood Flow

Een<em&gt; In vitro</em&gt; Co-infectie model om te onderzoeken<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-HIV-1 Interacties in menselijke primaire monocyt-afgeleide immuuncellen

Deze werkwijze onderzoekt de bloedplaatjes-gemedieerde samenklontering...

A Simple Protocol voor bloedplaatjes-gemedieerde Klontvormende van<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt;-Geïnfecteerde erytrocyten in een Slechte Setting Resource

Werkwijze voor isolatie van hechtende inflammatoire leukocyten uit hersenen...

Isolatie en analyse van Brain-afgezonderd Leukocyten uit<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-geïnfecteerde muizen

Het meten van antilichaam-functie is de sleutel tot het begrijpen van immuniteit tegen Plasmodium falciparum malaria. Deze methode beschrijft de zuivering van levensvatbare merozoïeten en meting van opsonisatie-afhankelijke fagocytose door flowcytometrie.

High Yield Zuivering van<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Merozoïeten Voor gebruik in opsoniserende antilichaamassays

De malariaparasiet binnenvalt en herhalingen binnen de rode bloedcellen. Nauwkeurige vaststelling van de merozoïet invasie en parasitemia is daarom van cruciaal belang bij de beoordeling van het verloop van de malaria-infectie. Hier beschrijven we een flowcytometrie gebaseerd protocol voor het meten van deze parameters in een muismodel van malaria.

In vivo evaluatie van het knaagdier Plasmodium parasitemia en merozoïet Invasion van flowcytometrie

Menselijk dubbele infectie is moeilijk te repliceren in vitro. Echter, menselijke malariaparasieten kunnen gemakkelijk worden gekweekt in vitro, net als vers geïsoleerde humane perifere bloedmononucleaire cellen die natuurlijk besmet zijn met HIV. Dit biedt een uitstekend model voor het bestuderen van vroege immuunresponsen op malariaparasieten in de context van HIV-co-infectie.

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model voor het meten van immuunrespons op Malaria in de context van HIV Co-infectie

Menselijk microRNA transloceert van gastheer erytrocyten naar Plasmodium falciparum parasieten. Hier worden de technieken beschreven die worden gebruikt om synthetische microRNA's in gastheer erytrocyten te transfecteren en alle RNA's uit P. falciparum te isoleren. Daarnaast zal dit artikel een methode voor polysoomisolatie in P. falciparum beschrijven om de ribosomale bezetting en translationele potentieel van parasiet transcripten te bepalen.

Methoden om de regulerende rol van kleine RNA&#39;s en Ribosomaal bezetting van Onderzoek<em&gt; Plasmodium falciparum</em

We beschrijven hier een protocol voor het isoleren van myeloïde cellen uit muizenhuid en drainerende lymfknoop na intradermale injectie van Plasmodium sporozoïeten. Stroomcytometrie van de verzamelde cellen biedt een betrouwbare test om de ontstekingsreactie in de huid en de drainerende lymfknoop op de parasiet te karakteriseren.

Myeloïde Cell Isolatie van Mouse Skin en aftappen lymfkliertest Na Intradermal Immunisatie met levende verzwakte<em&gt; Plasmodium</em&gt; sporozoieten

Het algemene doel van dit protocol is om instructies te geven over het meten van de capaciteit van antilichamen aanwezig in sera of plasma van individuen, van nature blootgesteld aan Plasmodium falciparum infectie, om fagocytose van de parasiet-geïnfecteerde erytrocyten (IEs) te opsoniseren en induceren.

Het meten van natuurlijk verworven phagocytose-inducerende antilichamen tegen Plasmodium falciparum parasieten door een Flow Cytometrie-Gebaseerde Test

Hier beschrijven we een nieuwe methode om de mechanismen van cellulaire immuniteit tegen Plasmodium tijdens het bloedstadium van infectie op te helderen. Dit is een in vitro test die geïnfecteerde rode bloedcellen dodental door cytotoxische lymfocyten meet.

In vitro Bepaling van plasmodium-geïnfecteerde rode bloedceldoding door cytotoxische lymfocyten

Leer de functie van extracellulaire vesikels tijdens malaria-infectie met Plasmodium falciparum. Deze methode visualiseert vesikelopname door endotheelcellen en onderzoekt de regulerende rol van vesiculair RNA.

Beoordeling van extracellulaire vesikel functie tijdens Malaria infectie

Meer video's verkennen