Beoordeling van extracellulaire vesikel functie tijdens Malaria infectie

Het algemene doel van deze procedure is om de functie van extracellulaire vesicles onderzocht te krijgen die vrijkomen door Malaria parasiet geïnfecteerde rode bloedcellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van Malaria, zoals hoe de parasieten de communicatie tussen parasiet en gastheer reguleren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de visualisatie van vesiculaire arbitage door indoterot cellen onder studie van de regulatorische functie van het vesiculaire RNA door indoterot cellen.

Het demonstreren van de procedure zullen Mya Alondez, Smartin Bagu en Bayo Babatunde zijn, allemaal afstudeerstudenten uit mijn laboratorium. Voeg in een microcentrifugebuisje 100 microgram extracellulaire vesicles en een milliliter fosfaat gebufferd zoutoplossing toe. Centrifugeer vervolgens de extracellulaire vesicles bij een maximale snelheid van 20.000 keer g gedurende zeven minuten om een pellet te vormen.

Zodra de centrifugatie voorbij is, gooi de supernatant weg zonder het pellet te verstoren. Los vervolgens het pellet van de extracellulaire vesicles op in 100 microliters dilumate C. Om volledige menging te garanderen, pipet het meerdere keren. Vervolgens, in een nieuw microcentrifugebuisje, voeg vier microliters van de PKH67 ethanolische kleurstofoplossing toe aan 100 microliters dilmant C. Mix de oplossing vervolgens goed door elkaar.

Bereid de 40 micromolar 2XPKH67 kleurstofoplossing net voor het kleuringsproces. Combineer vervolgens snel 100 microliters van twee keer de extracellulaire vesiculaire suspensie met een gelijk volume van de PKH67 ethanolische kleurstofoplossing. Pipet de mixtuur vervolgens 10 keer om een goede menging te garanderen.

Na volledige menging, incubeer de extracellulaire vesiculaire en PKH67 ethanolische kleurstofoplossing gedurende vijf minuten weg van het licht. Tijdens het incuberen, blijf de mixtuur drie tot vier keer door elkaar mengen. Om de kleuringsreactie te stoppen, voeg 200 microliters serum toe aan de mixtuur en incubeer gedurende een minuut voor de overtollige kleurstof om te binden.

Was vervolgens de extracellulaire vesicles drie keer met fosfaat gebufferde zoutoplossing. Na het wassen, centrifugeer het monster bij 20.000 keer g gedurende vijf minuten. Los vervolgens het pellet van de extracellulaire vesicles op in 100 microliters fosfaat gebufferde zoutoplossing om een uiteindelijke concentratie van één microgram per microliter te bereiken.

Breng de endotheelcellen over in één milliliter volledig endotheelcel groeimedium naar een poly-elithene bekleed dekselglasje. Laat de cellen een monolaag op het dekglasje laten groeien. Nadat de monolaag is gevormd, verwijder voorzichtig het medium en voeg één milliliter vers medium toe om de cellen twee keer te wassen.

Voeg vervolgens 50 microgram PKH67 gekleurde extracellulaire vesicles toe aan het dekglasje en incubeer gedurende vier uur. Na het incuberen, aspireer het medium. Om alle ongebonden extracellulaire vesicles te verwijderen, was de cellen drie keer met fosfaat gebufferde zoutoplossing.

Er moet grote zorgvuldigheid worden betracht tijdens het manipuleren van de dekglasjes tijdens het kleuren door fijne tang te gebruiken om celverlies en breken van het dekglasje te voorkomen. Na het wassen, gebruik drie procent paraformaldehyde oplossing in fosfaat gebufferde zoutoplossing om de cellen gedurende 15 minuten te fixeren. Was de cellen opnieuw drie keer met fosfaat gebufferde zoutoplossing en voeg 250 microliters van 0,1 procent tritan x 100 toe in fosfaat gebufferde zoutoplossing om de cellen te permeabiliseren en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Was vervolgens de cellen drie keer met fosfaat gebufferde zoutoplossing en voeg 400 microliters blokkerende buffer toe aan de cellen. Incubeer vervolgens de cellen gedurende dertig minuten bij kamertemperatuur om niet-specifieke binding te voorkomen. Na het blokkeren, was de cellen eenmaal met fosfaat gebufferde zoutoplossing.

Verdun vervolgens vijf microliters van de phalloiden stockoplossing in 200 microliters fosfaat gebufferde zoutoplossing met één procent bovien serumalbumine om de kleuroplossing voor elk dekglasje voor te bereiden. Voeg vervolgens 200 microliters van de kleuroplossing toe op het dekglasje en incubeer gedurende twintig minuten bij kamertemperatuur. Zodra de incubatie voorbij is, was de cellen drie keer met fosfaat gebufferde zoutoplossing.

Gebruik vervolgens de uiteindelijke concentratie van twee microgram per milliliter van hooksed 3342 in 200 microliters fosfaat gebufferde zoutoplossing om het DNA gedurende 30 seconden tegenkleuren. Na het kleuren, voeg 400 microliters fosfaat gebufferde zoutoplossing toe om het dekglasje twee keer te wassen. Til vervolgens voorzichtig het dekglasje op met behulp van een pincet en draai het om op de top van een druppel antifade montage medium op een glasplaatje.

Gebruik een doekje om voorzichtig eventueel overtollig medium te verwijderen en verzegel vervolgens de omringende ruimte met nagellak. Er moet ook grote zorgvuldigheid worden betracht om de cellen niet te veel bloot te stellen aan de kleurstof tijdens microscopie om celbleken te voorkomen. In een 24 wels weefselkweekinzet met 0,4 micromolair poriegrootte, zaai endotheelcellen.

Laat de cellen vervolgens vijf dagen in de cultuur groeien zonder te worden gestoord om een gedifferentieerde monolaag te vormen. Ververs het medium elke tweede dag. Zodra de monolaag is gevormd, zaai 50 microgram in één milliliter extracellulaire vesicles op de bovenste kamer.

Voeg vervolgens 20 milligram per milliliter rotomine dextran toe aan de bovenste put en incubeer bij 37 graden Celsius met vijf procent koolstofdioxide. Volg de migratie van de fluorescerende dextran naar de bodem van de put door de fluorescentiemissie van 40 microliters medium te meten. Programmeer vervolgens de excitatiegolflengte op 544 nanometer en emissiegolflengte op 590 nanometer voor een multi-label microplaatlezer.

Gebruik een hemocytometer om het a