Name: Optimaliseren van de genetische opneming van chemische sondes in GPCRs voor foto-crosslinking kartering en Bioorthogonal scheikunde in levende cellen van zoogdieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 2 s
Description: Leer een fluorescente assay om de opname van niet-canonieke aminozuren in GPCRs te optimaliseren voor foto-crosslinking en bioorthogonale labeling in levende zoogdiercellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk is opgericht door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) onder subsidies CO822/2-1 (Emmy Noether programma) en CO822/3-1 I.C.

De auteurs er geen conflicten optreden te verklaren.

Het protocol beschrijft een eenvoudige en betrouwbare test om te beoordelen van de efficiëntie van orthogonale paren voor de opneming van ncAAs in eiwitten uitgedrukt in zoogdiercellen. Het belangrijkste voordeel van deze methode met betrekking tot de gebruikte testen op basis van FACS is dat het maakt het mogelijk gelijktijdig voorbereiding en meting van grotere aantallen monsters, en gegevens die gemakkelijk worden geanalyseerd met behulp van een gewone software levert. De beschikbaarheid van een middellange-doorvoer-m...

De genetische opneming van chemische sondes in eiwitten is een krachtige methode om onderzoek van structurele en dynamische aspecten van eiwitfunctie rechtstreeks in de oorspronkelijke context van de levende cel. Tegenwoordig kunnen honderden niet-canonieke aminozuren (ncAAs) uitgerust met de meest uiteenlopende chemische groepen worden site-specifically opgenomen in eiwitten door biosynthese1,,2,,3,4. Tussen hen, vindt men lichtgevoelig ncAAs zoals foto-crosslinkers5, foto-caged,6,7,8,9 en foto-schakelbare aminozuren10, 11, aminozuren, rekening houdend met gespannen alkenen en alkynen voor catalyst-gratis bioorthogonal chemie2,12,13,14,15,16 ,17, uitvoering dansyl18en cumarine9,19prodan20,21 fluorophores aminozuren en aminozuren uitgerust met andere biofysische sondes als goed zoals met post vertalende wijzigingen1,2,3,4,22,23,24,25.
De genetische codering van een ncAA is ingeschakeld door een toegewijde amino-acyl-tRNA-synthetase (jaarlijkse Activiteitenverslagen) gekoppeld aan een cognaat suppressor-tRNA, waarin de ncAA in reactie op een amber stop codon tijdens de reguliere ribosomal synthese. ncAARS/tRNA paren zijn ontworpen zodanig orthogonale in het ontvangende organisme, dat wil zeggen niet cross-talk met de endogene paren. De techniek is goed ingeburgerd, zowel in de prokaryote en eukaryote hosts en gemakkelijk toepasbare aan zoogdieren cellen. Paren voor ncAA opneming in zoogdiercellen zijn gebaseerd op de drie belangrijkste orthogonale systemen: het tyrosyl-systeem, dat de TyrRS van E. coli26 met een suppressor tyrosyl amber van B. stearothermophilus27 (EG combineert TyrRS /BstYam paar), de E. coli leucyl systeem (EGLeuRS/tRNALeuCUA paar)6,18,28 en de archaeële pyrrolysyl systeem (PylRS/tRNA Pyl paar)3, waarbij het tRNAPyl is een natuurlijke amber suppressor. In het algemeen wordt elke ncAA herkend door een gespecialiseerde ncAARS. Afhankelijk van de structuur van de ncAA, wordt de ncAARS verkregen via gerichte evolutie van TyrRS, LeuRS of PylRS, hoewel sommige synthetases meer dan één ncAA kunnen aanvaarden.
Door eenvoudig met behulp van een plasmide vector wordt de orthogonale paar ingevoerd in de cellen. Meest voorkomende en efficiënte plasmiden zijn bicistronic en coderen van zowel voor de synthetase en de vorming van de orthogonale paar29tRNA. Een tweede plasmide-codering voor de proteïne van rentedragende een amber codon op de site voor wijziging aangewezen is mede-transfected. De ncAA is gewoon toegevoegd aan het groeimedium cel. Echter, verschillende gespecialiseerde clientgroepen gebruiken vaak verschillende varianten van plasmide constructies zelfs voor de opneming van de dezelfde ncAA. Constructies verschillen in de rangschikking van de genen in de vector, de aard van de synthetase, de codon gebruik in de synthetase gen, de promotor gebruik, de variant van het tRNA en aantal tRNA expressie cassettes. Bovendien kan de efficiëntie van de integratie van verschillende ncAAs drastisch variëren als gevolg van de verschillende katalytische efficiëntie van de verschillende synthetases, de kwaliteit van het tRNA, en andere factoren-30. Daarom is het belangrijk om bij de hand hebben een snelle en betrouwbare methode om te evalueren van de doeltreffendheid van een orthogonale paar, zowel om te kiezen van het meest geschikte systeem voor een gewenste toepassing en voor het uitvoeren van sommige optimization stappen dat verbetering van de algehele eiwit expressie opbrengsten.
We hebben een eenvoudige en robuuste fluorescentie gebaseerde bepaling om te evalueren van de doeltreffendheid van orthogonale paren29 (Figuur 1) opgericht. In de analyse, cellen zijn mede transfected met de plasmide-codering voor de orthogonale paar, samen met een bicistronic verslaggever plasmide codering zowel voor de groen fluorescente proteïne, rekening houdend met een amber stop codon op een tolerante positie (EGFPTAG) en de mCherry gen. Rode en groene fluorescentie van geheel-cel lysates worden gelezen in afzonderlijke kanalen op een afleesapparaat in een 96-wells-plaat. De intensiteit van de groene fluorescentie direct correleert met de efficiëntie van amber onderdrukking, overwegende dat de intensiteit van de rode fluorescentie een directe schatting van de grootte van het te meten monster en de efficiëntie van de transfectie geeft. Met betrekking tot soortgelijke testen op basis van fluorescentie voorlezen geassisteerde cell sorting (FACS)31,32, de bepaling geeft een onmiddellijke en uitgebreide beoordeling van eiwit expressie in de cel van de hele bevolking, die meer is representatief zijn voor de gebruikelijke proefomstandigheden, en biedt een eenvoudiger data acquisitie en verwerking met standaard software. Globaal, is het belangrijkste voordeel van de bepaling dat een middellange tot een groot aantal monsters kan worden geanalyseerd in parallel. Met behulp van deze test, hebben wij een rationeel ontworpen bibliotheek van suppressor-tRNAs ter verbetering van de efficiëntie van de Pyl orthogonale systeem30gescreend. Dit werk beschrijft het experimentele protocol om het uitvoeren van deze test en voorbeelden van de toepassing ervan, met inbegrip van de optimalisering van de orthogonale paar voor de opneming van de foto-crosslinking ncAA p-azido-L-fenylalanine (Azi) en de vergelijking van de efficiëntie van de integratie van verschillende aminozuren (Figuur 2).
De laatste jaren heeft ncAA tools hebben bewezen zeer krachtig te onderzoeken van structurele en functionele aspecten van G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs)33,34,35,,36,,37 , 38. bij de mens, GPCRs vormen een grote familie van membraan receptoren (800 leden) en hoofddoelen voor therapeutische drugs vertegenwoordigen. Directe structurele karakterisering van GPCRs is nog uitdagend en complementaire biochemische methoden zijn zeer nodig voor hun onderzoek. We hebben een pionier in het gebruik van foto-crosslinking ncAAs kaart GPCR oppervlakken en ontdek ligand bindende zakken34. Via ons geoptimaliseerde systeem voor Azi inbouw, wij stelselmatig Azi opgenomen in het domein van de hele juxtamembrane van een GPCR rechtstreeks in de cellen van levende zoogdieren. Bij UV-bestraling vormt Azi een zeer reactieve nitrene soorten die covalent naburige moleculen vangt. Wanneer de ligand wordt toegevoegd aan het systeem, fungeert Azi als een sonde van de nabijheid te onthullen welke posities van de receptor komen dicht bij de afhankelijke ligand. Op deze manier werd de bindende wijze van het neuropeptide hormoon Urocortin (Ucn1) op de klasse B GPCR corticotropin-releasing-factor receptor itype 1 (CRF1R)33 voor het eerst onthuld. De laatste tijd hebben we verschillende bindende patronen van agonisten en antagonisten op de dezelfde receptor38vermeld. Een soortgelijke aanpak is toegepast door anderen te onthullen van de orthosteric en allosteric bandplaatsen van andere peptides en klein molecuul liganden op andere GPCRs39,40,41,42. Dit manuscript beschrijft het experimentele protocol toegepast in ons lab voor foto-crosslinking toewijzing van GPCR oppervlakken. De methode is relatief snel, eenvoudig en vereist geen speciale apparatuur, zodat zij is van toepassing in standaard biochemie labs. Nog belangrijker is, de aanpak biedt een waardevol instrument, niet alleen om te identificeren ligand bandplaatsen waar 3D Landeninformatie schaars zijn, maar ook ter aanvulling van de bestaande in vitro gegevens met informatie van volledig post-translationally gemodificeerde receptoren in de fysiologische omgeving van de levende cel.
De recente ontwikkeling van roman ncAAs invloed op de kant keten chemische groepen geschikt voor ultrasnelle katalysator-vrije bioorthogonal chemie heeft opengesteld van de mogelijkheid om te installeren van de laatste generatie fluorophores voor super-resolutie beeldvorming in eiwitten direct aan de levende cellen2,43. Dergelijke chemische ankers zijn gespannen cyclooctyne in SCOK14, bicyclo [6.1.0] nonyne in BCNK12,17, en trans-cyclooctenes in TCO * K13,15,17 onder andere ncAAs herbergen een Norborneen16,17,44 of cyclopropeen45,46 deel daarvan. Omvangrijk ncAAs voor de bioorthogonal scheikunde middels een variant van de PylRS meestal aangeduid als PylRSAF zijn opgenomen (die aangeeft mutatie Y271A en Y349F in de M. barkeri PylRS), maar ook door andere ad hoc geëvolueerd ncAARSs17 , 44. de ankers van bioorthogonal reageren met tetrazine reagentia47 via omgekeerde elektron-vraag Diels-Alder cycloadditie geven hoge labeling opbrengsten binnen een paar minuten43,48. Toepassing van deze krachtige aanpak op etiket GPCRs heeft echter zijn uitdagend als gevolg van een lage algemene efficiëntie van de orthogonale ncAA opneming systeem. Via ons uitgebreide Pyl systeem, hebben we onlangs aangetoond hoog rendement opneming van dergelijke aminozuren in GPCRs en ultrasnelle GPCR etiketten op het oppervlak van levende cellen van zoogdieren30. Gelabelde receptoren waren nog steeds functioneel, als ze fysiologisch geïnternaliseerd bij het activeren van de receptor met een agonist. Het experimentele protocol voor de opneming van bioorthogonal ankers in GPCRs en labeling volgt worden hier beschreven. GPCRs met kleine heldere fluorophores om uit te rusten is de eerste essentiële stap naar de studie van GPCR structurele dynamica in de levende cel via geavanceerde microscopie technieken.

<table><tbody><tr><td>Chemicaliën</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acryamide/Bisacrylamide 30% (37,5:1)</td><td>Carl Roth</td><td>3029.1</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfaat (APS)</td><td>Carl Roth</td><td>9592.2</td><td></td></tr><tr><td>p-Azidofenylalanine (Azi)</td><td>Bachem</td><td>F-3075.0001</td><td></td></tr><tr><td>Boorzuur</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>Bromfenolblauw</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumine (BSA)</td><td>Carl Roth</td><td>8076.2</td><td></td></tr><tr><td>Carbobenzyloxy-L-lysine (Lys(Z))</td><td>NovaBiochem</td><td>8540430100</td><td></td></tr><tr><td>Cyclooctyn-L-lysine (SCOK)</td><td>Sichem</td><td>SC-8000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>41966052</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Carl Roth</td><td>A994.2</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Carl Roth</td><td>6908.1</td><td></td></tr><tr><td>enhanced chemiluminescence reagent (ECL)&nbsp;</td><td>zelfgemaakt</td><td></td><td>10 mg/l luminol in 0,1 M Tris-HCl pH 8,6 ; 1100 mg/l&nbsp; p-courmarinezuur in DMSO ; 30&nbsp;% H2O2 (1.000 : 100 : 0,3)</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.1</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Carl Roth</td><td>3054.1</td><td></td></tr><tr><td>endo-bicyclo[6.1.0]nonyn-L-lysine (BCNK)</td><td>Sichem</td><td>SC-8014</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Carl Roth</td><td>7533.1</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Carl Roth</td><td>3908.3</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>9105.3</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth</td><td>6781.3</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Luminol</td><td>Applichem</td><td>A2185,0005</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Carl Roth</td><td>0082.3</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Carl Roth</td><td>2189.2</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>HN00.2</td><td></td></tr><tr><td>Na-Lactaat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71718-10G</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Grüssing</td><td>121551000</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493-1L</td><td></td></tr><tr><td>p-Coumarinezuur</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9008-1G</td><td></td></tr><tr><td>poly-D-lysine hydrobromide</td><td>Corning</td><td>354210</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>11548876 (15140-122)</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Carl Roth</td><td>6367.1</td><td></td></tr><tr><td>PNGase F</td><td>NEB</td><td>P0704L</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>PVDF membrane Immobilon-P</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Skim Milk Powder&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat (SDS)</td><td>Carl Roth</td><td>CN30.2</td><td></td></tr><tr><td>Tetrazine-Cy3</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-014-05</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethyleendiamine (TEMED)</td><td>Carl Roth</td><td>2367.3</td><td></td></tr><tr><td>trans-Cycloocteen-L-lysine (TCO*K)</td><td>Sichem</td><td>SC-8008</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Carl Roth</td><td>3051.4</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine 2,5%</td><td>Thermo Fisher (Gibco)</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Carl Roth</td><td>9127.2</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid (30%)</td><td>Merck</td><td>1.07210.0250</td><td></td></tr><tr><td>Cellijnen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293 cellen</td><td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td><td>ACC-305</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T cellen</td><td>German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ)</td><td>ACC-635</td><td></td></tr><tr><td>Apparatuur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crosslinker Bio-Link 365 nm</td><td>Bio-Budget Technologies GmbH</td><td>40-BLX-E365</td><td>5 x 8 Watt tubes</td></tr><tr><td>Plate Reader BMG LABTECH FLUOstar Omega&nbsp;</td><td>BMG LABTECH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmiden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmid E2AziRS</td><td>Het gehumaniseerde gen voor E2AziRS werd gesynthetiseerd door Geneart (Life Technologies)</td><td></td><td>Plasmid met 4 tandem kopieën van de suppressor tRNA Bst-Yam aangedreven door de humane U6 promotor en één kopie van een gehumaniseerd gen voor de verbeterde variant van de Azi-tRNA synthetase (EAziRS) aangedreven door een PGK promotor</td></tr><tr><td>POI-TAG mutante plasmiden</td><td></td><td></td><td>Plasmid dat codeert voor het POI aangedreven door de CMV promotor, C-terminaal gefuseerd met de FLAG-tag, met een TAG codon op de gewenste positie&nbsp;</td></tr><tr><td>CRF1R-95TAG-EGFP</td><td></td><td></td><td>Gekloond in de MCS van pcDNA3.1</td></tr><tr><td>HA-PTH1R-79TAG-CFP</td><td></td><td></td><td>Gekloond in de MCS van pcDNA3.1</td></tr><tr><td>Arrestin3-FLAG</td><td>Gesynthetiseerd door Genart (Life Technologies)</td><td></td><td>Gekloond in de MCS van pcDNA3.1</td></tr><tr><td>Antilichamen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG-HRP M2 antilichaamconjugaat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8592&nbsp;</td><td>monoklonaal, geproduceerd in muisklon M2</td></tr><tr><td>Goat-anti-rabbit-HRP antilichaam</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit-anti-CRF antilichaam</td><td>zelfg

optimaliseren van de genetische opneming van chemische sondes in gpcrs voor foto-crosslinking kartering en bioorthogonal scheikunde in levende cellen van zoogdieren

Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

De genetische opneming van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) via amber stop codon onderdrukking is een krachtige techniek om te installeren van kunstmatige sondes en reactieve wordt op eiwitten rechtstreeks in de levende cel. Elke ncAA is verwerkt door een speciale orthogonale suppressor-tRNA/amino-acyl-tRNA-synthetase (jaarlijkse Activiteitenverslagen) paar die is geïmporteerd in het ontvangende organisme. De efficiëntie van de integratie van verschillende ncAAs kan sterk verschillen, en in sommige gevallen ontoereikend. Orthogonale paren kunnen worden verbeterd door het manipuleren van de jaarlijkse Activiteitenverslagen van of het tRNA. Gerichte evolutie van tRNA of jaarlijkse Activiteitenverslagen met behulp van grote bibliotheken en dood/levend Selectiemethoden zijn echter niet haalbaar in zoogdiercellen. Hier, wordt een facile en robuuste fluorescentie gebaseerde bepaling aan de evaluatie van de doeltreffendheid van orthogonale paren in zoogdiercellen gepresenteerd. De bepaling kan screening van tientallen tot honderden varianten van de jaarlijkse Activiteitenverslagen/tRNA met een matige inspanning en binnen een redelijke termijn. Gebruik van deze test voor het genereren van nieuwe tRNAs die aanzienlijke verbetering van de efficiëntie van de orthogonale systeem van pyrrolysine wordt beschreven, samen met de toepassing van ncAAs aan de studie van de G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCRs), die zijn uitdagend objecten voor ncAA mutagenese. Ten eerste, door het systematisch opnemen van een foto-crosslinking ncAA gedurende het extracellulaire oppervlak van een receptor, bandplaatsen van verschillende liganden op de intact receptor worden toegewezen rechtstreeks in de levende cel. Ten tweede, door de integratie van ncAAs van de laatste generatie in een GPCR, ultrasnelle catalyst-gratis receptor labelen met een fluorescente kleurstof wordt aangetoond, die exploiteert bioorthogonal stam-bevorderd inverse Diels-Alder cycloadditie (SPIEDAC) op de levende cel. Als ncAAs kan over het algemeen worden toegepast op elke proteïne onafhankelijk van de grootte, is de methode van algemeen belang voor een aantal toepassingen. Bovendien, ncAA opname niet vereist geen speciale apparatuur en gemakkelijk in standaard biochemie labs wordt uitgevoerd.

De omtrek van de fluorescentie-bepaling is afgebeeld in Figuur 1. De bepaling is werkzaam in drie toepassingen. Op de eerste plaats, worden een aantal tRNA varianten voor opneming van Lys(Boc) door de Pyl orthogonale paar gescreend. Lys(BOC) is een sterically vergelijkbaar met Pyl aminozuur. Zoals Pyl niet commercieel beschikbaar is, wordt Lys(Boc) meestal gebruikt als een standaard substraat voor de PylRS. De afgeschermde tRNAs zijn gebaseerd op het tRNA<sup...

Een facile fluorescentie-bepaling is bedoeld om te evalueren van de doeltreffendheid van amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA paren integratie van niet-canonieke aminozuren (ncAAs) in eiwitten uitgedrukt in zoogdiercellen. De toepassing van ncAAs op het bestuderen van de G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCRs) wordt beschreven, met inbegrip van foto-crosslinking toewijzing van bindende sites en bioorthogonal GPCR etiketten op levende cellen.

Optimaliseren van de genetische opneming van chemische sondes in GPCRs voor foto-crosslinking kartering en Bioorthogonal scheikunde in levende cellen van zoogdieren

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

Het algemene doel van dit protocol is om de incorporatiesnelheid van niet-canonieke aminozuren in zoogdiercellen te verbeteren om biologische vragen in levende celinstellingen aan te pakken, inclusief het in kaart brengen van eiwit-eiwit interactieoppervlakken en bioorthogonale markering van oppervlaktereceptoren. Door gebruik te maken van amber codon onderdrukking, worden verschillende niet-canonieke aminozuren met verschillende efficiënties opgenomen. We hebben een fluorescentietest ontwikkeld om gemakkelijk de opname van niet-canonieke aminozuren in zoogdiercellen binnen een korte tijd te vergelijken.De systematische opname van foto-crosslinking, niet-canonieke aminozuren door onze GPCR oppervlakken maakt het mogelijk om ligand bindingsplaatsen in kaart te brengen en levert waardevolle informatie op over de intake receptor rechtstreeks uit de levende cel. Door de laatste generatie, niet-canonieke aminozuren voor bioorthogonale chemie op te nemen, bereiken we locatie-specifiek, supersnel, katalysatorvrij markeren van GPCR's met kleine, heldere fluoroforen voor hoogwaardige beeldvormingstoepassingen in levende zoogdiercellen. Zaai eerst 600.000 HEK 293 cellen in twee milliliter vo

optimizing-genetic-incorporation-chemical-probes-into-gpcrs-for-photo

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Door het gebruik van een spectraal opgelost twee-foton microscopie imaging-systeem, zijn pixel-niveau kaarten van Förster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiëntie verkregen voor cellen die membraanreceptoren verondersteld dat homo-oligomere complexen vormen. Van de efficiëntie kaarten FRET, we zijn in staat om stoichiometrisch informatie over het oligomeer complex schatting in studie.

In vivo Kwantificering van G-eiwit gekoppelde receptor interacties met behulp van spectraal Opgelost Twee-foton microscopie

We genetisch coderen natuurlijk aminozuur, p-azido-L-fenylalanine op verschillende gerichte posities in GPCRs en tonen de veelzijdigheid van de azidogroep in verschillende toepassingen. Deze omvatten een gerichte fotoverknoping technologie om resten in de ligand-bindingsplaats van een GPCR te identificeren, en de site-specifieke bioorthogonal modificatie van GPCR's met een peptide-epitoopmerker of fluorescente probe.

Genetisch gecodeerde Molecular Probes aan G-eiwit gekoppelde receptoren Studie

We beschrijven hier een methode voor de identificatie van klein molecuul-bindende eiwitten met behulp van fotoaffiniteitslabeling. Het voordeel van deze techniek is dat binding en covalente labeling van de doeleiwitten plaatsvindt binnen de levende cellulaire omgeving, waardoor het risico van verstoring van de native eiwitstructuur en bindingscondities bij cellyse wordt geëlimineerd.

Identificatie van kleine synthetische molecules bindende eiwitten in een Inheemse cellulaire omgeving door live-cell fotoaffiniteitslabeling

Hier presenteren we een protocol te analyseren van cel naar cel overdracht van oscillerende informatie door optogenetic control en live monitoring van genexpressie. Deze aanpak biedt een uniek platform om te testen een functionele betekenis van dynamische gen expressie programma's in meercellige systemen.

Een Optogenetic methode te controleren en analyseren van gen expressiepatronen in cel-naar-cel interacties

GPCR-β-vanger-interacties zijn een opkomende veld in GPCR-geneesmiddelen ontdekking. Nauwkeurige, nauwkeurige en eenvoudig te stellen methoden zijn nodig om dergelijke interacties in levende systemen te monitoren. We vertonen een structurele complementatie test om de interacties van GPCR-β-de-vanger in real-time levende cellen te monitoren, en deze kan worden uitgebreid naar elke GPCR.

Monitoren van GPCR-β-arrestin1/2 interacties in real-time levende systemen om de geneesmiddelen ontdekking te versnellen

Kinetische cross-linking en analyse van cDNA is een methode die onderzoek mogelijk maakt naar de dynamiek van eiwit-RNA interacties in levende cellen met een hoge temporele resolutie. Hier wordt het protocol in detail beschreven, inclusief de groei van gistcellen, UV-crosslinking, oogsten, eiwitzuivering en voorbereidingsstappen voor de volgende generatie sequencingbibliotheek.

Monitoring van eiwit-RNA interactiedynamica in vivo bij hoge temporele resolutie met behulp van χCRAC

Het betrouwbaar controleren van lichtgevoelige zoogdiercellen vereist de standaardisatie van optogenetische methoden. In de richting van dit doel schetst deze studie een pijplijn van gencircuitconstructie, celtechnologie, optogenetische apparatuur en verificatietests om de studie van door licht geïnduceerde genexpressie te standaardiseren met behulp van een negatief feedback optogenetisch gencircuit als casestudy.

Betrouwbare engineering en controle van stabiele optogenetische gencircuits in zoogdiercellen

We presenteren een experimenteel protocol en data-analyseworkflow om live cell dual-color fluorescentie cross correlation spectroscopie (FCCS) uit te voeren in combinatie met Förster Resonance Energy transfer (FRET) om membraanreceptordynamica in levende cellen te bestuderen met behulp van moderne fluorescentielabeltechnieken.

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy om eiwit-eiwitinteractie en eiwitdynamica in levende cellen te bestuderen

Dit artikel biedt een eenvoudig en duidelijk protocol om Salmonella-uitgescheiden effectoren te labelen met behulp van genetische code-uitbreiding (GCE) site-specifiek en de subcellulaire lokalisatie van uitgescheiden eiwitten in HeLa-cellen in beeld te brengen met behulp van directe stochastische optische reconstructiemicroscopie (dSTORM)...

Superresolutiebeeldvorming van bacteriële uitgescheiden eiwitten met behulp van genetische code-uitbreiding

In dit werk wordt een high-throughput, intracellulaire calciumfluorescentietest voor 384-well platen beschreven om kleine molecuulbibliotheken te screenen op recombinante G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCR's). Het doelwit, de kininereceptor van de runderkoortsteek, Rhipicephalus microplus, komt tot expressie in CHO-K1-cellen. Deze test identificeert agonisten en antagonisten die dezelfde cellen gebruiken in één "dual-addition" assay.

Een "Dual-Addition" Calcium Fluorescentie Assay voor de High-Throughput Screening van Recombinant G Protein-Coupled Receptors

Deze studie beschrijft een methode voor experimenten met hoge doorvoer met behulp van een 3D-geprinte LED-array om licht-induceerbare genexpressie in HEK293T cellen te optimaliseren.

Snelle optimalisatie van een licht-induceerbaar systeem om de genexpressie van zoogdieren te beheersen

Leer een fluorescente assay om de opname van niet-canonieke aminozuren in GPCRs te optimaliseren voor foto-crosslinking en bioorthogonale labeling in levende zoogdiercellen.

Optimaliseren van de genetische opneming van chemische sondes in GPCRs voor foto-crosslinking kartering en Bioorthogonal scheikunde in levende cellen van zoogdieren (Video) | JoVE Journal

Optimaliseren van de genetische opneming van chemische sondes in GPCRs voor foto-crosslinking kartering en Bioorthogonal scheikunde in levende cellen van zoogdieren

Meer video's verkennen