Groeiende eiwit kristallen met verschillende afmetingen, met behulp van geautomatiseerde kristallisatie in combinatie met In Situ Dynamische lichtverstrooiing
14 augustus 2018
Hier presenteren we een protocol voor gecontroleerde productie van eiwitten microcrystals. Het proces maakt gebruik van een automatische inrichting waarmee gecontroleerde manipulatie van verschillende parameters van de kristallisatie. De eiwit kristallisatie is uitgevoerd-out door gecontroleerde en automatische toevoeging van kristallisatie oplossingen terwijl monitoring en onderzoek naar de RADIUS-verdeling van de deeltjes in de kristallisatie druppel.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het gebied van eiwitkristallisatie, zoals het tijdstip van nucleatie, het mechanisme van kristalgroei of hoe nano-/microkristallen te bereiden, zoals onderzocht door het Hamburg Center for Ultrafast Imaging. Het grote voordeel van deze techniek is de real-time bewaking van de evolutie van het monster, waardoor waardevolle informatie kan worden verkregen, zoals de radiale verdeling van deeltjes in oplossing in verschillende kristallisatiefasen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in eiwitmicrokristallisatie, kan deze ook worden gebruikt voor eiwitten die worden gebruikt voor klassieke kristallografie of voor de groei van grote eiwitkristallen die worden gebruikt voor neutronendiffractie.
Visuele demonstratie van deze methode is belangrijk, omdat het het werkingsprincipe van een uniek kristallisatieapparaat laat zien. Om te beginnen, filtert u 16 milliliter 1,2 molaire natriumtartraatoplossing en 16 milliliter gedestilleerd water met behulp van een 2 micron steriele spuitfilter. Vul de flesjes met het precipitaat en water met vijf milliliter van de gefilterde oplossingen.
Monteer vervolgens de flesjes in de pomphouders van de experimentele kamer. Stel in het softwarevenster de experimentele parameters in met een temperatuur van 20 graden Celsius, relatieve luchtvochtigheid van 20 en water als oplosmiddel. Open de voordeur van de experimentele kamer en verwijder de dekglasdrager.
Plaats een schoon en gesiliconeerd dekglas op de drager en plaats het terug in het apparaat. Sluit de experimentele kamer om de omgevingscondities te beveiligen. Schakel pomp nul in, gebruik de hoofdpompkenmerken die in het tekstprotocol staan vermeld en creëer een waterstraal.
Stel de waterstraal af, richt de positie op het midden van het dekglas door de aangewezen afstelschroef handmatig te bedienen. Schakel pomp nul uit, schakel vervolgens pomp één in en creëer een vloeistofstraal, zoals eerder. Pas de straalpositie van pomp één aan naar de vaste positie voor pomp nul.
Na het uitschakelen van pomp één, vervangt u het gebruikte dekglas door een nieuw, schoon dekglas voor het kristallisatie-experiment. Maak een nieuw experimenteel bestand aan met behulp van de softwarepakket. Voer in het experimentele bestand het eiwit in als Thaumatin, van Thaumatococcus daniellii;de eiwitconcentratie als 14 milligram per milliliter, het precipitaat als natriumtartraat en de precipitaatconcentratie als 1,2 molair.
Na het laden van het nieuwe experimentbestand om deze informatie te activeren, markeert u de positie op het eiwitdruppel door een kleine waterdruppel toe te voegen met behulp van pomp nul. Druk op de 'Tara'-knop om de microbalans op nul te zetten. Open het bovenste deksel van de experimentele kamer en pipet 8 microliter Thaumatin-oplossing op het waterlandmerk.
Om de nieuwe Thaumatin-druppel te registreren, klikt u eerst op 'Nieuwe druppel' om de beginvoorwaarden van het experimentele bestand toe te schrijven. Klik vervolgens op de 'Constant'-knop om de natuurlijke verdamping van water uit de druppel te compenseren. Gebruik de CCD-camera om te controleren of pomp nul op de eiwitdruppel is gericht.
Pas de positie van pomp nul opnieuw aan als de waterstraal buiten de druppel is gericht. Schakel de DLS-laser in en plaats de laserstraal in de eiwitdruppel door handmatig de afstelschroeven te gebruiken. Voer de DLS-parameters in met een meetduur van 60 seconden, een wachttijd tussen twee metingen van 10 seconden en een aantal metingen van 300.
Klik op de 'Start'-knop om de DLS-metingen te starten. Controleer de kwaliteit van het monster door een van de DLS-grafieken te selecteren. Voer de voorwaarden voor de verdampingsstap in de schematabel in, zoals weergegeven in het tekstprotocol.
Activeer vervolgens de monsterstappe van verdamping door op de 'Automatisering'-knop te klikken. Klik op de 'Stop'-knop wanneer de monsterstappe van verdamping is voltooid. Activeer de constante knop om het gewicht van de druppel constant te houden.
Deze functie compenseert voor de eventuele natuurlijke verdamping van het monster en zorgt ervoor dat er geen concentratieveranderingen kunnen plaatsvinden totdat verdere actie wordt ondernomen. Voer vervolgens de voorwaarden voor de toevoegingsstap van het precipitaat in de schematabel in, zoals vermeld in het tekstprotocol. Activeer de toevoegingsstap van het precipitaat door op de 'Automatisering'-knop te klikken.
Om de evolutie van de kristallisatie druppel in de tijd bij te houden, controleert u het uiterlijk van de Thaumatin-kristallen met behulp van de CCD-camera. Controleer de deeltjesgrootteverdeling met behulp van de DLS-grafieken. Controleer ook de evolutie van gewicht en experimentele parameters met behulp van het displayvenster.
Alle informatie die in dit venster wordt weergegeven, wordt in realtime berekend en weergegeven, op basis van de gewichtsveranderingen tijdens kristallisatie, die online worden geregistreerd door de ultragevoelige weegschaal. Bekleed een schone standaard Terasaki-plaat door 3 milliliter paraffineolië toe te voegen aan de plaat. Verspreid de paraffineolië op de plaatputjes door de plaat op verschillende hoeken voorzichtig te bewegen zodat de olie alle 72 putjes bedekt.
Verwijder het overtollige paraffineolië door alle olie die op de plaat drijft weg te gieten. Klik op de 'Stop'-knop om het kristallisatie-experiment te beëindigen. Haal voorzichtig de monstersdrager met de kristallisatie druppel eruit.
Plaats met behulp van een pipet twee microliter aliquots van de kristallisatie druppel in de putjes van de Terasaki-plaat. Door de kristallisatie druppel in een plaat onder olie te herstellen, kan het monster periodiek worden gecontroleerd op stabiliteit in kristalgroei met behulp van een microscoop of andere diolist-technieken die werken met Terasaki-platen. Hier wordt een straalplotverdeling weergegeven die de groei van de deeltjesgrootte in de eiwitdruppel tijdens het gehele kristallisatieproces van monomere eiwitten tot de vorming van nucleï, nanokristallen en microkristallen toont.
Hier vertegenwoordigen grafieken de evolutie over tijd voor het gewicht van de eiwitdruppel, samen met de berekende eiwitconcentratie en precipitaatconcentratie. Hier wordt een opgenomen foto van Thaumatin-microkristallen aan het ein
Overzicht
Dit artikel presenteert een gepatenteerd geautomatiseerd kristallisatieapparaat dat is ontworpen voor de nauwkeurige monitoring en controle van proteïnekristallisatie. Het systeem integreert in situ Dynamic Light Scattering (DLS) en real-time microscopische beeldvorming, waardoor gedetailleerde observatie van nucleatie- en kristalgroeiprocessen mogelijk is. Het protocol stelt onderzoekers in staat om de kristallisatiecondities te optimaliseren voor het produceren van proteïnekristallen van de gewenste grootte, variërend van grote kristallen die geschikt zijn voor neutronendiffractie tot micro- en nanokristallen voor geavanceerde structurele studies.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Proteïnekristallisatie
- Structurele biologie
- Biofysische methoden
Achtergrond
- Proteïnekristallisatie is essentieel voor structurele bepaling met behulp van röntgendiffractie en andere technieken.
- Het beheersen van nucleatie en kristalgroei is uitdagend, maar cruciaal voor het verkrijgen van kristallen met een geschikte grootte en kwaliteit.
- Traditionele methoden missen vaak real-time feedback, waardoor optimalisatie moeilijk is.
- In situ DLS biedt waardevolle informatie over de deeltjesgrootteverdeling tijdens de kristallisatie.
Doel van de studie
- Om een geautomatiseerde, interactieve aanpak voor proteïnekristallisatie met behulp van real-time monitoring te demonstreren.
- Om nauwkeurige controle over de nucleatie- en kristalgroeifasen mogelijk te maken.
- Om de productie van zowel grote kristallen als microkristallen voor diverse downstream-toepassingen te faciliteren.
Gebruikte methoden
- Bereiding van gefilterde natriumtartraat- en wateroplossingen voor gebruik als precipitant en oplosmiddel.
- Geautomatiseerde toevoeging van eiwit, precipitant en water met behulp van programmeerbare pompen binnen een gecontroleerde omgevingskamer.
- Real-time monitoring van de kristallisatiedruppel met behulp van een CCD-camera en in situ DLS.
- Geautomatiseerde stappen voor waterverdamping, toevoeging van precipitant en monsterverdunning om oververzadiging en nucleatie te manipuleren.
- Gegevensacquisitie van druppelgewicht, eiwit- en precipitantconcentratie en deeltjesgrootteverdeling gedurende het experiment.
Belangrijkste resultaten
- Real-time DLS en imaging maakten een precieze identificatie van nucleatiegebeurtenissen en kristalgroeifasen mogelijk.
- Geautomatiseerde controle maakte de productie van zowel grote proteïnekristallen als overvloedige microkristallen mogelijk.
- Plots van de straalverdeling onthulden de overgang van monomerisch proteïne naar nuclei, nanokristallen en microkristallen.
- De methode leverde inzichten in de tweestap-nucleatietheorie, waarbij DLS dubbele deeltjesgrootteverdelingen liet zien voorafgaand aan de kristalgroei.
Conclusies
- Het geautomatiseerde crystallisatieapparaat biedt een robuust platform voor gecontroleerde proteïnekristallisatie.
- In situ DLS-monitoring is essentieel voor het optimaliseren van nucleatie en kristalgroei, waardoor de productie van kristallen met een specifieke grootte mogelijk wordt.
- Deze aanpak ondersteunt downstream-applicaties zoals cryo-EM en elektrondiffractie voor submicrometer-kristallen.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Geautomatiseerde proteïnekristallisatie met in situ dynamische lichtverstrooiing (DLS) maakt nauwkeurige real-time controle over nucleatie en kristalgroei mogelijk, waarmee direct een cruciale flessenhals in de structurele biologie en biopharma-ontdekking wordt aangepakt. Deze mogelijkheid vergroot het voorspellend vertrouwen bij het produceren van kristallen met gedefinieerde afmetingen, wat zowel de structuurbepaling met hoge resolutie als downstream analytische workflows ondersteunt. De integratie van kwantitatieve monitoring en automatisering positioneert deze benadering als een herbruikbaar platform voor vroege ontdekking, screening en translationele onderzoekspijplijnen.
Strategische toepassingen in biopharma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt realtime onderzoek naar nucleatiegebeurtenissen en kristalgroeimechanismen mogelijk.
- Ondersteunt functionele targetvalidatie door kristallen te produceren die geschikt zijn voor diverse structurele analyses.
- Faciliteert mechanische risicoreductie via kwantitatieve monitoring van fasetransities.
Screening & assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde proteïnekristallen voor voor downstream screening en biofysische assays.
- Standaardiseert crystallisatiecondities, waardoor de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid tussen experimenten worden verbeterd.
- Levert kwantitatieve DLS-outputs voor robuuste assayontwikkeling en evaluatie van verbindingen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijgt de productie van kristallen af op de vereisten voor geavanceerde beeldvormings- en diffractietechnieken.
- Maakt continuïteit mogelijk van kristallisatie in de ontdekkingsfase tot preklinische structurele validatie.
- Ondersteunt risico-gecorrigeerde voortgang door hoogwaardige kristallen te leveren voor translationeel onderzoek.
Integratie van Pipeline en Workflow
Dit geautomatiseerde kristallisatie- en DLS-platform is geïntegreerd van vroege ontdekking tot lead-identificatie en preklinisch onderzoek, ter ondersteuning van iteratieve hypothesetesten en structurele validatie.
- Discovery Biology: Kwantitatieve DLS-monitoring verduidelijkt de timing van nucleatie en groeipaden, waardoor mechanische ambiguïteit wordt verminderd.
- Screening: Geautomatiseerde, reproduceerbare workflows garanderen dat assays gereed zijn en maken high-throughput kristalproductie mogelijk.
- Analytics: Real-time meting van partikelgrootte, concentratie en gewicht biedt bruikbare gegevens voor het vergelijken van condities.
- Translationeel onderzoek: Produceert kristallen die compatibel zijn met cryo-EM, elektrondiffractie en neutronendiffractie, ter ondersteuning van biomarker- en targetvalidatie.
- Enterprise hergebruik: De automatiserings- en monitoringfuncties van het platform maken een brede toepasbaarheid over verschillende eiwit-targets en projectteams mogelijk.
Operationele en ondernemingsbrede impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert ambiguïteit bij de vorming en groei van kristallen.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, schaalbare en reproduceerbare workflows voor kristallisatie.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go besluitvorming en de kapitaalefficiëntie door snelle, datagestuurde optimalisatie mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering en de voortgang van discovery-programma's die gebaseerd zijn op structurele inzichten.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in eiwitbehandeling, DLS-bediening en kristallisatieprotocollen.
- Toegang tot geautomatiseerde kristallisatie-instrumentatie en real-time analytische infrastructuur is noodzakelijk.
- Vereist standaardisatie van experimentele parameters en data-interpretatie tussen teams.
- Aanpasbaar aan diverse eiwitdoelen en kristallisatiecondities door optimalisatie van het protocol.
- Afhankelijk van nauwkeurige uitlijning en kalibratie van DLS- en imagingsystemen voor betrouwbare resultaten.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Chapters in this video
0:04
Title
0:56
Parameters, Solution Setup, and Micro-dosage Systems Adjustment
2:42
Seeing a Thaumatin Drop in the Experimental Chamber and in Situ Measurements
4:48
Sample Evaporation, Precipitant Addition, and Tracking the Evolution of the Crystallization Droplet Over Time
6:12
Recovery of Crystallization Droplet
7:09
Results: Formation of Protein Microcrystals from T. daniellii Thaumatin
7:57
Conclusion
