Een Protocol voor het laboratorium huisvesting van Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

Het algemene doel van dit protocol is om met succes een laboratoriumkolonie van turkoois killivisjes op te voeden om veroudering en leeftijdsgebonden ziekten op een snelle en snel doorvoerende manier te bestuderen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van veroudering, zoals of enkele genmutaties of omgevingsinterventies het verouderingsproces bij gewervelde soorten kunnen moduleren. Het grote voordeel van deze techniek is dat door het volgen van onze basisprotocollen, verschillende laboratoria nu experimenten kunnen uitvoeren met turkoois killivisjes.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen, aangezien het houden van killivisjes enkele unieke kenmerken heeft. Bijvoorbeeld, embryo's worden op een droog substraat grootgebracht voorafgaand aan het uitkomen, wat heel anders is dan canonieke vismodellen zoals zebravissen. Om te beginnen, zet 9,5 liter foktanks op met elk een vijf weken oude mannetje en twee zes tot zeven weken oude vrouwtjes.

Vul vervolgens een plastic bak met geautoclaveerde zand ongeveer twee tot drie centimeter diep en plaats de zandbak in het midden van de foktank. Laat de turkoois killivisjes continu paren en oogst embryo's eens per week voor embryo-incubatie. Om eencellig stadium embryo's te oogsten voor injectie en het genereren van transgene lijnen, zet een foktank op met één mannetje en twee vrouwtjes zoals net gedemonstreerd.

Twee dagen voorafgaand aan de embryo-verzameling, zet het mannetje in een individuele tank en houd het in zichtcontact met de volwassen vrouwtjes. Op de dag van verzameling, voeg het mannetje en een zandbak toe aan de foktank en laat de vissen twee uur paaien. Na het paaien en het verwijderen van de zandbak uit de tank, leeg de zandbak in een zeef en spoel het met systeemwater.

Dompel vervolgens de zeef gedeeltelijk in systeemwater en slinger het zachtjes zodat de embryo's zich in het midden groeperen. Gebruik een twee milliliter Pasteur-pipet om de embryo's te verzamelen en breng ze over in een 90 millimeter petrischaal met ongeveer 40 milliliter systeemwater. Inspecteer de embryo's in de petrischaal onder een lichtmicroscoop en verwijder degenen met een gescheurde chorion en tekenen van schade.

Na het bleken van de embryo's volgens het tekstprotocol, inspecteer en verwijder eventuele dode embryo's die blauw zouden worden gekleurd. Zodra de embryo's zijn toegestaan om te incuberen in verse methyleenblauw oplossing, controleer of de ontwikkelde embryo's zichtbare zwarte ogen hebben. Gebruik vervolgens een wegwerp Pasteur-pipet of fijne gebogen pincet om embryo's over te brengen naar een filterpapierplaat.

Bewaar onontwikkelde embryo's in methyleenblauw en monitor ze dagelijks. Zodra zwarte ogen zijn ontwikkeld, breng ze over naar vast substraat medium. Verspreid de embryo's met pincet ongeveer vijf millimeter uit elkaar tot 100 embryo's per 90 millimeter plaat.

Gebruik vervolgens paraffine om de schaal te verzegelen en incubeer de embryo's bij 28 graden Celsius gedurende twee tot drie weken totdat ze volledig ontwikkelde gouden irissen hebben en klaar zijn voor het uitkomen. Voor langdurige opslag tot één jaar, volgend op incubatie in methyleenblauw oplossing gedurende drie dagen, zet embryo's over naar vast substraat medium platen zoals zojuist gedemonstreerd en incubeer ze bij 17 graden Celsius. Om de vissen uit te komen, gebruik fijne gebogen pincet om voorzichtig 50 tot 100 ontwikkelde embryo's over te brengen naar de uitkomstbox en dompel ze volledig onder in humuszuur oplossing niet dieper dan twee centimeter bij vier graden Celsius.

Een kritieke stap in dit protocol is het uitkomen van killivisjes embryo's, wat wordt bereikt door embryo's die zijn geïncubeerd op een droog substraat over te brengen naar een uitkomoplossing die humuszuur bevat, voorzien van voldoende beluchting. Bedek de uitkomstbox met een deksel en incubeer deze bij 28 graden Celsius in een uitkomst incubator. Om voldoende beluchting te leveren, sluit de box aan op een luchttoevoer met slangen.

Om adequate waterkwaliteit in de uitkomstbox te behouden, eenmaal per dag vanaf de dag na het uitkomen, vul de box aan met een een-op-een verhouding van geautoclaveerd systeemwater waarbij een einddiepte van twee centimeter wordt gehandhaafd. Breng onuitgekomen embryo's terug naar het vast substraat en probeer een week later te laten uitkomen. Om juveniele en volwassen vissen te kweken vijf dagen na het uitkomen, verplaats de juvenielen naar het waterrecirculatiesysteem door wegwerp plastic pipetten of een plastic lepel te gebruiken om voorzichtig vijf juvenielen per 0,8 liter tank uitgerust met een 400 micrometer kuitgaas over te brengen.

Op 14 dagen leeftijd, breng juveniele vissen over naar een 2,8 liter tank uitgerust met een 850 micrometer kuitgaas. Vanaf dit punt verder, label elke tank met een vis ID. Voor overlevingsonderzoek, huisvest elke vis individueel in een enkele tank. Vissen die worden grootgebracht voor overlevingsonderzoek worden ook individueel gehuisvest in een 2,8 liter tank.

Voor de volgende zeven dagen, voer juvenielen twee keer per dag met vijf milliliter pekelkreeftjes aangevuld met een tot drie levende bloedwormen. Op vier weken leeftijd, voer elke vis twee keer per dag pekelkreeftjes en een milliliter bloedwormen. In dit stadium, zorg ervoor dat de vis volledige seksuele rijpheid bereikt door te controleren op de aanwezigheid van grote dorsale, anale en caudale vinnen met tekenen van kleuring bij mannetjes en ronde buiken vol eieren bij vrouwtjes.

Hier getoond is een representatieve overlevingscurve voor 70 mannelijke turkoois killivisjes. Goede huisvesting resulteert in mediane overleving variërend van 12 tot 28 weken in de GRZ-stam. Variaties in mediane overleving zijn afhankelijk van dieet, voerfrequentie en huisvestingstemperatuursomstandigheden.

De overlevingscurve voor vissen die onder slechte huisvesting zijn grootgebracht, toont een toename van vroege sterfte en herha