Een eenvoudige en efficiënte methode voor In Vivo Cardiac-specifieke genetische manipulatie door Intramyocardial injectie in muizen

Het algemene doel van deze procedure is om in vivo hartspecifieke genmanipulatie te bereiken, door intramyocardial adenovirusinjectie bij volwassen muizen. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het veld van cardiovasculair onderzoek te beantwoorden over de moleculaire mechanismen en het uitlijnen van hartschade, en de werkzaamheid van gentherapie. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het vrij is van ventilatie, dat de muizen snel herstellen van de operatie en dat het reproduceerbaar en gemakkelijk uit te voeren is.

Dus laten we nu beginnen. Op de dag van de procedure, verwarm de gezuiverde adenovirusvectoroplossing van minachting 80 graden Celsius, bewaar op ijs. Wanneer het adenovirus is ontdooid, zet een mondmasker op, een steriele jas en steriele handschoenen.

En spuit het adenovirusbuisje met 75%ethanol. Breng het virus over naar een steriele laminar flow-kap en zuig 50 microliter van de virusoplossing op in een gesteriliseerde Hamilton-spuit van 50 microliter. Bevestig een naald van 30 gauge aan de spuit.

Draai de spuit in de rechtopstaande positie. Druk voorzichtig op de zuiger, totdat er een druppel oplossing zichtbaar is aan de naaldpunt, om de naaldpunt met virus te vullen. Zuig vervolgens voorzichtig nog eens 30 microliter adenovirusoplossing in de spuit en plaats de spuit op ijs.

Om het adenovirus in een muizenhart te injecteren, bevestig het juiste niveau van sedatie door gebrek aan reactie op teenprik, en breng zalf aan op de ogen van het dier. Scheer de bovenborst en buik van het dier. Breng commercieel verkrijgbare ontharingscrème aan op de blootgestelde huid.

Gebruik natte gaas om de crème en eventueel achtergebleven haar na één minuut te verwijderen. Gebruik drie antiseptica op basis van jodium chloorhexidine om de onderste linkerkant van de borst te steriliseren. Bedek vervolgens het dier met een chirurgische doek, met een gat boven het operatiegebied, en trek een nieuw paar steriele handschoenen aan.

Gebruik vervolgens, met behulp van steriele techniek en instrumenten, een 0,5 centimeter huidsnede van het xiphoïd naar de oksel en gebruik forceps en een Micro Mosquito hemostaat om de grote en kleine borstspieren stomp te disseceren. Trek de grote en kleine borstspieren terug om de intercostale ruimte bloot te leggen. En gebruik de Micro Mosquito hemostaat om door te prikken en de vierde intercostale ruimte te openen.

Druk voorzichtig met de wijsvinger van de niet-dominante hand tegen de rechterkant van de borstwand om het hart naar de snede te bewegen. Bevestig vervolgens het externiseerde hart voorzichtig met de wijsvinger en duim van dezelfde hand en gebruik de dominante hand om 10 microliter adenovirusoplossing te injecteren in het myocardium van elk de ventrale, dorsale en laterale wanden van de linker ventrikel. Na de laatste injectie, breng het hart onmiddellijk terug naar de intrathoracale ruimte.

En druk voorzichtig de borstwand naar de incisieplaats, om handmatig alle lucht uit de intrathoracale ruimte te verdrijven. Sluit de huid met een draad van vijf ott zijde, in een horizontaal matraspatroon, en plaats de muis op een warmtepad van 37 graden Celsius met monitoring tot volledige herstel. Steriliseer vervolgens de gebruikte Hamilton-spuit en 30 gauge naald in een hoogtemperatuur, hoogdruk sterilisator en gooi de gesteriliseerde naald weg in een geschikte container voor scherpe voorwerpen.

Vijf dagen na intramyocardial injectie van adenovirus dat luciferase omsluit, geeft in vivo beeldvorming een robuuste overexpressie van luciferase aan, specifiek in het hart, die kan worden bevestigd door Western blot-analyse, wat de afwezigheid van niet-doelorgaantransductie suggereert. Western blot-analyse geeft ook een significant verhoogde vitamine D-receptorexpressie aan. En de linker ventrikel van muizen geïnjecteerd met adenovirus dat codeert voor vitamine D-receptor.

Met een verminderde expressie van de receptor duidelijk in dieren geïnjecteerd met adenovirus dat codeert voor kortharig haar pin targeting RNA vitamine D-receptor. In tegenstelling, vitamine D-receptorexpressie is niet significant veranderd in de rechter ventrikels van beide links geïnjecteerde dieren. Eenmaal onder de knie, kan deze methode binnen twee minuten worden voltooid, als deze correct wordt uitgevoerd.

Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals hartcelinjectie, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de werkzaamheid van specifieke celtherapieën bij hartinfarcten.