Name: Winning van Hemocytes van Drosophila melanogaster larven voor microbiële infectie en analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Leer hemocyt-isolatie uit Drosophila melanogaster-larven voor microbiële infectie-analyse. Deze methode maakt 3D-visualisatie van pathogeeninvasie mogelijk met confocale microscopie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij zijn dankbaar aan Dr Robert Heinzen voor het verstrekken van voorraden van mCherry-uiten Coxiella burnetii. Wij bedanken Dr. Luis Teixeira voor het verstrekken van ongewervelde iriserende virus 6 en de Bloomington voorraad Center voor het verstrekken van vliegen voorraden. Dit project werd gedeeltelijk gefinancierd door NIH grant R00 AI106963 (voor A.G.G.) en Washington State University.

1. ex vivo infectie
<ol><li>Medium en apparatuur<ol>
<li>Bereiden onder steriele condities, verse Drosophila Hemocyte isoleren Medium (DHIM) met 75% Schneiders Drosophila medium met 25% foetale boviene Serum (FBS) en filter steriliseren het.</li>
		<li>Laag 2-3 stukjes van 10 x 10 cm paraffine film onder een stereomicroscoop.</li>
		<li>De glazen viscometerbuizen voor te bereiden. De trekker van de capillaire kachel ingesteld op 55% van de maximale. Trek het capillair tot een scherpe punt van ongeveer 10 µm.</li>
		<li>Aanvulling van de funderingsput het capillair met minerale olie.</li>
		<li>Monteren van gevulde capillaire buis op het nanoinjector (Figuur 1A) en open uiteinde dichtgesmolten capillair door het afbreken van het uiteinde met een tang (Figuur 1B). De buitendiameter van de tip dient 100 µm voor gemakkelijke opname van de hemocytes.</li>
		<li>Uitwerpen van zo veel olie mogelijk van de capillaire buis tip, vul dan met DHIM. Voor eenvoudige visualisatie van de grens van up-genomen Hemolymfe en de olie, bevatten een luchtbel tussen de olie- en DHIM (Figuur 1B').</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hemolymfe extractie<ol>
<li>Kies 3rd instar Drosophila larven van binnenuit muur van voedsel flesjes voorzichtig met een pincet en plaats hen in een 100 µm zeef (Figuur 1C). 3rd instar-larven zijn 3-6 dagen na vruchtbare ei leggen door een volwassen vrouwtje te vinden. Opmerking: Deze experimenten gebruikt het genotype, w1118; P {w+ mC= Hml-GAL4.Δ} 2, P {w+ mC= UAS-2xEGFP} AH2, aangezien hemocytes van deze dieren express verbeterde groen fluorescent proteïne (EGFP) om te helpen bij de identificatie van de cellen door microscopie.</li>
		<li>5 mL steriel water giet larven en schud de zeef voor 5 s. plaats de zeef op taak wissen om het overtollige water te verwijderen (Figuur 1C').</li>
		<li>Breng de larven in een tube van 1,5 mL microcentrifuge. Anesthetize hen met CO2 gas voor 5 s (Figuur 1D).</li>
		<li>Plaats de larven op paraffine film onder de stereomicroscoop, met de dorsale-zijde naar boven(Figuur 2).</li>
		<li>Plaats het glas capillaire licht op het larvale posterieure lichaam op zijn plaats te houden en verstoren de posterieure cuticle openen met behulp van fijn puntige pincet (Figuur 2B).</li>
		<li>Laat de Hemolymfe te stromen naar de paraffine film (Figuur 2C).</li>
		<li>Een pool van Hemolymfe met inbegrip van hemocytes van 20-50 larven op een moment op de paraffine-film te maken.</li>
		<li>Duren gepoolde Hemolymfe met behulp van de glazen capillaire op het nanoinjector (Figuur 2D). Opmerking: Er mag ongeveer 10-20 µL van Hemolymfe.</li>
		<li>Werpen de Hemolymfe in een tube van 1,5 mL microcentrifuge met 500 µL van DHIM(Figuur 2).</li>
		<li>Herhaal de stappen 1.2.4) - 1.2.9) voor elke batch van larven.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het aantal hemocytes te tellen.<ol>
<li>Pipetteer 5 µL van 0.4% Trypan blauw-oplossing in een tube 0,6 mL microcentrifuge om de dode cellen vlek. Voorzichtig mengen de DHIM en de hemocytes in de 1,5 mL-buis met behulp van een precisiepipet, en breng 5 µL van DHIM met inbegrip van de hemocytes aan de 0,6 mL microcentrifuge buis en meng voorzichtig.</li>
		<li>Pipetteer 10 µL van cellen uit het mengsel van 1:1 Trypan blauw: hemocyte in de hemocytometer.</li>
		<li>Het aantal levende hemocytes, die zijn niet gekleurd met Trypan blauw in elk van de velden 4 hoek van de hemocytomter en bereken de concentratie van de hemocytes per milliliter met behulp van de formule: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57077/57077eq1.jpg"> waarbij X staat voor de concentratie van levende hemocytes per milliliter; a, b, c en d zijn het aantal levende cellen (zoals bepaald door Trypan blauwe uitsluiting) in elk 4 velden geteld in de hemocytometer. Deling door 2 van het totale aantal cellen geteld is te wijten aan de verdunning 1:1 van de cellen met blauwe Trypan. Gekleurd met Trypan blauwe cellen worden beschouwd als dood.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ex vivo Infecties<ol>
<li>Bepaal het aantal putten te worden ontpit met cellen op basis van timepoints en biologische repliceert u nodig hebt voor elk experiment. 5.0 × 104 hemocytes zijn wenselijk voor RNA en eiwit zuivering na infectie.</li>
		<li>Bereken het volume van de ziekteverwekker voorraad moeten worden verdund met DHIM voor infectie met behulp van de volgende formule: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57077/57077eq2.jpg"> waar multipliciteit van infectie (MOI) is het aantal virale of bacteriën gewenst per cel. Opmerking: MOI gebruikt hangt af van de individuele experiment en tests uitgevoerd. Hier, 10 genoom equivalenten (GE) / cel C. burnetii, of 10 CFU/cel van Listeria, 1 TCID50distributiedatum van IIV6 werd gebruikt.</li>
		<li>500 µL van pathogen medium voorbereiden door elk putje van de plaat van een 24-well door het juiste volume van DHIM toe te voegen aan het virale of bacteriële volume in een buis.</li>
		<li>Plaats een 12 mm ronde cover glas (nr. 1 dikte) in een put van een 24-well-plate.</li>
		<li>Het splitsen van de DHIM met inbegrip van de hemocytes in de putjes van de plaat van een 24-well.</li>
		<li>500 µL van pathogen medium toevoegen aan hemocytes in een put.</li>
		<li>Centrifugeer de plaat bij 1.000 x g gedurende 5 min.</li>
		<li>Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij 28 ° C. Elke 15 min, zachtjes kantelen de plaat van terug naar voorzijde en links naar rechts voor 5 s met de hand.</li>
		<li>Na de 1 h van invasie/bijlage stap 1.4.8), zachtjes Pipetteer af het pathogeen medium en wassen van de hemocytes met verse DHIM en het vullen met 500 µL van verse DHIM.</li>
		<li>Incubeer de besmette hemocytes gedurende de gewenste tijd. In deze experimenten, C. burnetii- of IIV6-besmet hemocytes worden ge¨ uncubeerd 24u en Listeria-besmette hemocytes worden ge¨ uncubeerd 1, 2 of 4 uur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. in vivo infectie
<ol><li>Infectie<ol>
<li>Warm de Drosophila fruit sap agarplaat bij kamertemperatuur voor 15 min. platen zijn gemaakt zoals eerder beschreven20.<ol>
<li>30 g agar toevoegen aan 700 mL water en autoclaaf voor 40 min.</li>
			<li>Los 0,5 g methyl paraben in 10 mL absolute ethanol.</li>
			<li>Voeg de methyl paraben oplossing tot 300 mL van vruchtensapconcentraat.</li>
			<li>Snel Meng het sap concentraat in de gesteriliseerde met autoclaaf agar-oplossing en 5 mL in 10 × 35 mm petrischalen afzien.</li>
			<li>Nadat de platen zijn afgekoeld gedurende 15 minuten, bewaar ze bij 4 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bereiden van 3rd instar-larven als volgt 1.2.1) - 1.2.3).</li>
		<li>Plaats de gist plakken op een agarplaat. Maak een fijn gesneden in de agarplaat waar de larven migreren kunnen om te voorkomen dat het drogen (Figuur 3A). Monteren van een 0,001 mm puntige wolfraam naald met een pincet gebruik van paraffine film(figuur 3, onderB, C) bedrijf.</li>
		<li>Pipeteer 50 µL van hoge-titer mCherry waarin -C. burnetii (5,95 × 109 GE/mL) op de paraffine film onder de stereomicroscoop en plaats de larven in het zwembad van bacteriën.</li>
		<li>Plaats de larven in het zwembad van bacteriën. De larven prikken met een naald van wolfraam (Figuur 3D). Overdracht van de larven op een bord van de agar (Figuur 3E).</li>
		<li>Overdracht van de resterende pathogen medium op het bord van de agar en verzegel de plaat met paraffine film.</li>
		<li>De larven op de plaat in vochtige lucht houden totdat de gewenste tijd na infectie (Figuur 3F). In dit experiment, C. burnetii-geïnfecteerde larven zijn op de plaat voor 24u.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hemolymfe extractie en beplating van hemocytes<ol>
<li>Bereiden van het medium en apparatuur na stap 1.1).</li>
		<li>Plaats een 12 mm ronde cover glas (nr. 1 dikte) in een put van een 24-well-plate. Pipetteer 500 µL van DHIM in de put.</li>
		<li>Extract de Hemolymfe uit de geïnfecteerde larven als volgt 1.2.4) 1.2.8).</li>
		<li>Werpen van de Hemolymfe in goed onderstaande stap 2.2.2).</li>
		<li>Herhaal 2.2.3) en 2.2.4) voor meervoudige batches van larven.</li>
		<li>Centrifugeer de plaat bij 1.000 x g gedurende 5 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. visualisatie
<ol><li>Vaststelling en vlekken<ol>
<li>Na het toestaan van de hemocytes te vestigen op het ronde glas van de cover in de put, zachtjes het medium van elk putje te verwijderen.</li>
		<li>Voeg voorzichtig 200 µL van 4% paraformaldehyde (PFA) aan elk putje van vaste hemocytes. Laat de hemocytes gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur inwerken.</li>
		<li>Verwijderen van de 4% PFA en zachtjes Voeg 200 µL van PBS met 0,1% Triton X-100 en 1% boviene serumalbumine (BSA) aan elk putje. Laat de hemocytes gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur inwerken.</li>
		<li>Verwijder de PBS en zachtjes Voeg 200 µL van 1 × 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) aan elk putje. De hemocytes gedurende 10 minuten in het donker bij kamertemperatuur incuberen.</li>
		<li>Verwijder de DAPI-oplossing en zachtjes PBS toevoegen aan elk putje. Laat de hemocytes gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur inwerken.</li>
		<li>10 µL van het medium antifade montage op een glasplaatje Microscoop neerzet.</li>
		<li>Na het verwijderen van de PBS van elk putje, door de glazen cover uit de 24-well plaat met behulp van fine-puntige pincet te verwijderen. Zachtjes het glas cover op de antifade montage medium op het glasplaatje, met de hemocytes naar beneden te plaatsen.</li>
		<li>Laat de dia te drogen door deze te plaatsen in het donker 's nachts.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Confocale Imaging<ol>
<li>Configureren van de confocal microscoop voor drie kleur beeldvorming van de DAPI EGFP en mCherry. De volgende instellingen gebruiken: DAPI excitatie (ex-) 405 nm, emissie (em) 415-480 nm; EGFP ex 488 nm, em 493-564 nm; mCherry ex 587 nm, em 597-700 nm.</li>
		<li>Leg het monster met de Microscoop en de focus op het monster met behulp van een 63 X / 1.4 numerieke diafragma (nvt) doelstelling. Zoek de gewenste hemocytes in het gezichtsveld voor imaging.</li>
		<li>Aanpassen van de macht en detector winsten laser om te bereiken van de juiste belichting van het monster. Controleer meerdere z-vliegtuigen om ervoor te zorgen dat het niveau van blootstelling is geschikt voor de gehele steekproef dikte.</li>
		<li>Het vinden van de bovenste en onderste positie op de z-as van een hele hemocyte. Deze positie als de begin- en eindposities voor z-afdelen instelt.</li>
		<li>Gebruik alleen scannen zoom om de afbeelding het gebied met de hemocyte. Zoom veelvouden van 3 X worden vaak gebruikt.</li>
		<li>Verzamelen van de serie van de afbeelding op de juiste resolutie, zoals 1024 x 1024 pixels in het x-y vlak en 0,3 µm afstand in de z-dimensie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wederopbouw van het 3D-model Opmerking: Open-sourcesoftware bestaat waarmee veel van de functies die hieronder beschreven voor de wederopbouw van het 3D-model.<ol>
<li>Importeer het bestand van de serie z-gesegmenteerd afbeelding in de software gekoppeld van de confocal microscoop voor de wederopbouw van het 3D-model.</li>
		<li>Selecteer een cel weergegeven: Co lokalisatie van kernen gekleurd met DAPI en mCherry uiten van C. burnetii in een EGFP uiting van hemocyte. Gewas het beeld serie bevat slechts een enkele cel.</li>
		<li>Selecteer de 3D-Viewer optie die Hiermee reconstrueert u het 3D-model met behulp van voorverpakte algoritme van de software. Kies het gewenste type 3D-weergave tussen Blend, oppervlak en gemengde opties. Bij deze methode, worden hemocytes, kernen en C. burnetii weergegeven met behulp van surface modellen.</li>
		<li>Observeren de 3D gereconstrueerde cel vanuit verschillende posities bekijken door de muisknop ingedrukt te houden en de cursor over het scherm te slepen. De cel afdrukstand en positie van de gemodelleerde lichtbron voor het optimaliseren van het beeld aanpassen. Andere opties voor dekking, Minimum en Maximum drempelwaarde, Specular, Ambient, Shineness en Gamma bestaan voor het optimaliseren van het beeld.</li>
		<li>Neem dwarsdoorsneden via het objectmodel met opdrachten clipping en vectorafbeeldingsbestanden te visualiseren de interieur inhoud van de hemocyte.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. toepassing voor gen en/of eiwit analyse
<ol><li>Na de infectie met IIV6 en Listeria, lyse cellen voor latere qRT-PCR of westelijke vlekkenanalyse21 en volgende fabrikant instructies zoals hiervoor is beschreven. Opmerking: Raadpleeg de Tabel van materialen voor de inleidingen voor qRT-PCR en de antilichamen voor westelijke vlek.</li>
	<li>Analyseren van PCR producten door agarose de Elektroforese van het gel, als eerder beschreven22, om ervoor te zorgen de juiste lengte van de versterkte product.</li>
</ol>

<ol><li>Hoffmann, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+response+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The immune response of Drosophila.</a> Nature. 426 (6962), 33-38 (2003).</li>
<li>Regan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid+hormone+signaling+is+essential+to+regulate+innate+immune+cells+and+fight+bacterial+infection+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Steroid hormone signaling is essential to regulate innate immune cells and fight bacterial infection in Drosophila.</a> PLoS Pathog. 9 (10), 1003720(2013).</li>
<li>Yano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+control+of+listeria+through+intracellular+innate+immune+recognition+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Autophagic control of listeria through intracellular innate immune recognition in Drosophila.</a> Nat Immunol. 9 (8), 908-916 (2008).</li>
<li>Bastos, R. G., Howard, Z. P., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+and+Bacterial+Factors+Control+Susceptibility+of+Drosophila+melanogaster+to+Coxiella+burnetii+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Host and Bacterial Factors Control Susceptibility of Drosophila melanogaster to Coxiella burnetii Infection.</a> Infect Immun. 85 (7), (2017).</li>
<li>Kacsoh, B. Z., Schlenke, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+hemocyte+load+is+associated+with+increased+resistance+against+parasitoids+in+Drosophila+suzukii%2C+a+relative+of+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High hemocyte load is associated with increased resistance against parasitoids in Drosophila suzukii, a relative of D. melanogaster.</a> PLoS One. 7 (4), 34721(2012).</li>
<li>Tsuzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+between+humoral+and+cellular+immune+responses+in+Drosophila.+is+guided+by+the+cytokine+GBP%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Switching between humoral and cellular immune responses in Drosophila. is guided by the cytokine GBP.</a> Nat Commun. 5, 4628(2014).</li>
<li>Kurucz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+Drosophila.+hemocyte+subsets+by+cell-type+specific+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biol+Hung%22%5BJournal%5D)">Definition of Drosophila. hemocyte subsets by cell-type specific antigens.</a> Acta Biol Hung. 58, Suppl 95-111 (2007).</li>
<li>Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+study+Drosophila+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Methods to study Drosophila immunity.</a> Methods. 68 (1), 116-128 (2014).</li>
<li>Arefin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+Hemocytes+Induces+a+Shift+in+Effector+Mechanisms+in+the+Drosophila.+Immune+System+and+Leads+to+a+Pro-Inflammatory+State%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in Hemocytes Induces a Shift in Effector Mechanisms in the Drosophila. Immune System and Leads to a Pro-Inflammatory State.</a> PLoS One. 10 (8), 0136593(2015).</li>
<li>Rus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+pattern+of+Filamin-240+in+Drosophila+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr+Patterns%22%5BJournal%5D)">Expression pattern of Filamin-240 in Drosophila blood cells.</a> Gene Expr Patterns. 6 (8), 928-934 (2006).</li>
<li>Kurucz, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemese%2C+a+hemocyte-specific+transmembrane+protein%2C+affects+the+cellular+immune+response+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila.</a> P Natl Acad Sci USA. 100 (5), 2622-2627 (2003).</li>
<li>Markus, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sessile+hemocytes+as+a+hematopoietic+compartment+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (12), 4805-4809 (2009).</li>
<li>Bretscher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nimrod+transmembrane+receptor+Eater+is+required+for+hemocyte+attachment+to+the+sessile+compartment+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster.</a> Biol Open. 4 (3), 355-363 (2015).</li>
<li>Zettervall, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+directed+screen+for+genes+involved+in+Drosophila+blood+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (39), 14192-14197 (2004).</li>
<li>Flynt, A., Liu, N., Martin, R., Lai, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicing+of+viral+replication+intermediates+during+silencing+of+latent+Drosophila+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dicing of viral replication intermediates during silencing of latent Drosophila viruses.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (13), 5270-5275 (2009).</li>
<li>Jovel, J., Schneemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+Drosophila+cells+persistently+infected+with+Flock+House+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of Drosophila cells persistently infected with Flock House virus.</a> Virology. 419 (1), 43-53 (2011).</li>
<li>Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+protocol+for+extracting+hemocytes+from+wild+caterpillars%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars.</a> J Vis Exp. (69), e4173(2012).</li>
<li>Sampson, C. J., Williams, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+ex+vivo+incubation+of+Drosophila+primary+post-embryonic+haemocytes+for+real-time+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Protocol for ex vivo incubation of Drosophila primary post-embryonic haemocytes for real-time analyses.</a> Methods Mol Biol. 827, 359-367 (2012).</li>
<li>Nehme, N. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+bacterial+intestinal+infections+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster.</a> PLoS Pathog. 3 (11), 173(2007).</li>
<li>Drosophila fruit juice egg plates. <a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full?text_only=true">Cold Spring Harbor Protocols</a>. (9), pdb.rec11113 (2007).</li>
<li>Ahlers, L. R., Bastos, R. G., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invertebrate+Iridescent+Virus+6%2C+a+DNA+Virus%2C+Stimulates+a+Mammalian+Innate+Immune+Response+through+RIG-I-Like+Receptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Invertebrate Iridescent Virus 6, a DNA Virus, Stimulates a Mammalian Innate Immune Response through RIG-I-Like Receptors.</a> PLoS One. 11 (11), 0166088(2016).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
<li>Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+Blood+Cell+Populations+of+the+Drosophila+melanogaster+Larva%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva.</a> J Vis Exp. (105), (2015).</li>
<li>Figliozzi, R. W., Chen, F., Chi, A., Hsia, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+inverse+Poisson+distribution+to+calculate+multiplicity+of+infection+and+viral+replication+by+a+high-throughput+fluorescent+imaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+Sin%22%5BJournal%5D)">Using the inverse Poisson distribution to calculate multiplicity of infection and viral replication by a high-throughput fluorescent imaging system.</a> Virol Sin. 31 (2), 180-183 (2016).</li>
<li>Rizki, T. M., Rizki, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamellocyte+differentiation+in+Drosophila.+larvae+parasitized+by+Leptopilina%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Comp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lamellocyte differentiation in Drosophila. larvae parasitized by Leptopilina.</a> Dev Comp Immunol. 16 (2-3), 103-110 (1992).</li>
<li>Markus, R., Kurucz, E., Rus, F., Ando, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sterile+wounding+is+a+minimal+and+sufficient+trigger+for+a+cellular+immune+response+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Lett%22%5BJournal%5D)">Sterile wounding is a minimal and sufficient trigger for a cellular immune response in Drosophila melanogaster.</a> Immunol Lett. 101 (1), 108-111 (2005).</li>
<li>McCormack, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin-2+Protects+Host+Cells+and+Mice+by+Restricting+the+Vacuole+to+Cytosol+Transitioning+of+a+Bacterial+Pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen.</a> Infect Immun. 84 (4), 1083-1091 (2016).</li>
<li>Ozgen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+a+recombinant+invertebrate+iridovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of a recombinant invertebrate iridovirus.</a> Virus Res. 189, 286-292 (2014).</li>
<li>Jakob, N. J., Muller, K., Bahr, U., Darai, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+first+complete+DNA+sequence+of+an+invertebrate+iridovirus%3A+coding+strategy+of+the+genome+of+Chilo+iridescent+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Analysis of the first complete DNA sequence of an invertebrate iridovirus: coding strategy of the genome of Chilo iridescent virus.</a> Virology. 286 (1), 182-196 (2001).</li>
<li>Ghigo, E., Colombo, M. I., Heinzen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Coxiella+burnetii+parasitophorous+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">The Coxiella burnetii parasitophorous vacuole.</a> Adv Exp Med Biol. 984, 141-169 (2012).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+prophenoloxidases+respond+inconsistently+to+Cu2%2B+and+have+different+activity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Comp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster prophenoloxidases respond inconsistently to Cu2+ and have different activity in vitro.</a> Dev Comp Immunol. 36 (3), 619-628 (2012).</li>
<li>De Gregorio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immune-responsive+Serpin+regulates+the+melanization+cascade+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">An immune-responsive Serpin regulates the melanization cascade in Drosophila.</a> Dev Cell. 3 (4), 581-592 (2002).</li>
<li>Kari, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+raspberry+Gene+Is+Involved+in+the+Regulation+of+the+Cellular+Immune+Response+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The raspberry Gene Is Involved in the Regulation of the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster.</a> PLoS One. 11 (3), 0150910(2016).</li>
<li>Wu, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+single-cell+RNA-sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods.</a> Nat Methods. 11 (1), 41-46 (2014).</li>
<li>Buettner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+analysis+of+cell-to-cell+heterogeneity+in+single-cell+RNA-sequencing+data+reveals+hidden+subpopulations+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single-cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells.</a> Nat Biotechnol. 33 (2), 155-160 (2015).</li>
<li>Nevil, M., Bondra, E. R., Schulz, K. N., Kaplan, T., Harrison, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+Binding+of+the+Conserved+Transcription+Factor+Grainy+Head+to+its+Target+Genes+Throughout+Drosophila+melanogaster+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Stable Binding of the Conserved Transcription Factor Grainy Head to its Target Genes Throughout Drosophila melanogaster Development.</a> Genetics. 205 (2), 605-620 (2017).</li>
<li>Yang, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomes+of+lineage-specific+Drosophila+neuroblasts+profiled+by+genetic+targeting+and+robotic+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Transcriptomes of lineage-specific Drosophila neuroblasts profiled by genetic targeting and robotic sorting.</a> Development. 143 (3), 411-421 (2016).</li>
<li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+Immune+Circuits+by+Linking+CRISPR-Pooled+Screens+with+Single-Cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq.</a> Cell. 167 (7), 1883-1896 (2016).</li>
<li>Karaiskos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+embryo+at+single-cell+transcriptome+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Drosophila embryo at single-cell transcriptome resolution.</a> Science. 358 (6360), 194-199 (2017).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Om beter te begrijpen hoe de cellen van de gastheer besmet raken, is het belangrijk om het verduidelijken van de lokalisatie voor pathogen in de cellen, met name wanneer experimenteren op het eerder geteste pathogenen en cel type combinaties4. Terwijl het bestuderen van de cascade van de cellulaire reactie na infectie kunt productief pathogen invasie aangeven, is de combinatie van beeldvorming en cellulaire respons data essentieel om aan te tonen van de ziekteverwekker invasie en infectie. Terwijl...

Drosophila melanogaster is een gevestigde modelorganisme voor de studie van aangeboren immuniteit1. Tijdens de aangeboren immuunrespons spelen hemocytes een belangrijke rol in de reactie op pathogene uitdaging. Hemocytes zijn van cruciaal belang voor het inkapselen van parasieten, evenals hebbend een belangrijke functie bij de bestrijding van het pathogene agens via fagocytische actie tijdens schimmel, virale en bacteriële infectie2,3.
Om best begrijpen van de host ingeboren immuunreactie op pathogene microbiële infectie, is het belangrijk om te visualiseren hoe het pathogene agens gastheer cellen binnenvalt tijdens infectie. Deze visualisatie draagt bij aan een goed begrip van het mechanisme van de invasie. Samen met details voor pathogen intracellulaire lokalisatie en de cellulaire respons bieden deze gegevens aanwijzingen over de reactie van de gastheer op infectie en de cellulaire organellen waarmee de microbe samenwerkt. 3D-model wederopbouw na beeldvorming door microscopie kunnen dus nuttig om te bepalen van de precieze locatie van ziektekiemen in de cellen van de gastheer. In deze studie gevisualiseerd we de invasie van Coxiella burnetii (C. burnetii), de verwekker van Q-koorts, een zoönotische ziekte die een ernstige bedreiging voor de gezondheid van mens en dier, in primaire Drosophila hemocytes vormt. Onlangs, werd aangetoond dat Drosophila zijn gevoelig voor het bioveiligheidsniveau 2 Nine Mile fase II (NMII) kloon 4 stam van C. burnetii is en dat deze spanning kan repliceren in Drosophila4, die aangeeft dat Drosophila kan worden gebruikt als een modelorganisme voor het bestuderen van de pathogenese van C. burnetii .
Eerdere studies hebben gewend hemocytes onderzoeken van de host immuunrespons aangeboren. Hemocytes zijn gebruikt voor morfologische opmerkingen5,6,7, Morfometrische analyse2,8, fagocytose analyse2,3, qRT-PCR2 , 9immunoprecipitation10,11, immunefluorescentie analyse10,12, immunokleuring13, immunoblotting3,10, 11 en immunohistochemistry9,14. Hoewel Drosophila S2 cellen ook beschikbaar voor verschillende in vitro experimenten zijn, veranderen immortalization en potentiële bestaande virale infectie hun gedrag15,16. Het gebruik van primaire cellen in tegenstelling tot een vereeuwigd cellijn, zoals S2 cellen, zorgt voor de studie van het aangeboren immuun functie in een systeem meer representatief is voor het hele organisme. Bovendien is de infectie van hemocytes in vivo, voorafgaand aan de winning, kunt de cellen om te interageren met andere host eiwitten en weefsel, een voordeel ten opzichte van extractie van hemocytes vóór ex vivo infectie. Een aantal verschillende methoden hebben gebruikt om het verkrijgen van een voldoende aantal hemocytes in een korte periode van tijd om te houden van de hemocytes leeft8,17,18,19.
In deze studie presenteren we een methode om hemocytes extract van Drosophila 3rd instar-larven voor pathogene microbiële infectie met C. burnetii, Listeria monocytogenes (Listeria) of Invertebrate iriserende Virus 6 (IIV6). We beschrijven de methoden voor in vivo en ex vivo hemocyte infecties. In vivo- en ex vivo-besmette hemocytes waren gevisualiseerd met confocale microscopie en gebruikt voor het bouwen van 3D-modellen van de C. burnetii invasie. Bovendien, met behulp van het protocol van de extractie, ex vivo-besmette hemocytes werden gebruikt voor gen- en eiwit expressie testen. In het bijzonder om te onderzoeken in hoeverre van infectie met IIV6 en Listeria, werd totaal RNA of eiwit geïsoleerd uit de cellen voor qRT-PCR of westelijke vlekkenanalyse. Samen genomen, het protocol biedt methoden voor het verzamelen van snel grote aantallen hemocytes van 3rd instar-larven en bewijs dat primaire hemocytes, besmet in vivo of ex vivo, zijn een geschikt platform voor microbiële pathogen infectie studies en toepasselijke downstream analyses uitgevoerd, zoals microscopie, transcriptomics en proteomics.

```html
<table><tbody><tr><td>Schneider's Drosophila Medium&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>21720024</td><td>1.1.1), 2.1.2)</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GE Healthcare Life Sciences&nbsp; (HyClone)</td><td>SH30070.03HI</td><td>1.1.1), 2.1.2)</td></tr><tr><td>Filter (0.22 &micro;L)</td><td>RESTEK</td><td>26158</td><td>1.1.1)</td></tr><tr><td>Strainer (100 &micro;m)</td><td>Greiner bio-one</td><td>542000</td><td>1.2.1), 2)</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Amscope</td><td>SM-1BSZ-L6W</td><td>1.2), 2)</td></tr><tr><td>Glass capillary</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-171-4</td><td>1.1), 1.2), 2)</td></tr><tr><td>Capillary puller</td><td>Narishige International USA, Inc.</td><td>PC-10</td><td>1.1.3)</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Snow River Products</td><td></td><td>1.1.4)</td></tr><tr><td>Nanoinjector</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-204</td><td>1.1), 1.2), 2.2)</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>VWR</td><td>82027-402</td><td>1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)</td></tr><tr><td>CO2 delivery apparatus</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122BC</td><td>1.2), 2)</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Thermo Fisher Scientific (Gibco)</td><td>15250061</td><td>1.3)</td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>3100</td><td>1.3)</td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td>1.4), 2.2)</td></tr><tr><td>Coxiella burnetii - mCherry</td><td>Dr. Heinzen, R.</td><td></td><td>1.4), 2.2)</td></tr><tr><td>Drosophila fruit juice plates</td><td>Cold Spring Harbor Protocols</td><td></td><td>2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1423-500</td><td>2.1.1.1)</td></tr><tr><td>Methyl paraben</td><td>Amresco</td><td>0572-500G</td><td>2.1.1.2)</td></tr><tr><td>Absolute ethanol</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2818-500</td><td>2.1.1.2)</td></tr><tr><td>Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL</td><td>Amazon</td><td>B0025UJVGM</td><td>2.1.1.3)</td></tr><tr><td>Petri dishes, 10 x 35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td>2.1.1.4)</td></tr><tr><td>Microscope cover glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-80</td><td>1.4.4), 2.2.2)</td></tr><tr><td>Yeast, Bakers Dried Active</td><td>MP Biomedicals</td><td>0210140001</td><td>2.1) Voeg 2 delen water toe aan 1 deel gist (v/v)</td></tr><tr><td>Tungsten needle</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-20</td><td>2.1)</td></tr><tr><td>Holding forceps</td><td>VWR</td><td>HS8313</td><td>2.1)</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>FLO4042-500</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9706-100</td><td>3.1.3)</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindole</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62247</td><td>3.1.4)</td></tr><tr><td>Antifade mounting medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>3.1.6)</td></tr><tr><td>Confocal microsope</td><td>Leica</td><td>TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope</td><td>3.2)</td></tr><tr><td>3D imaging reconstruction software</td><td>Leica</td><td>LASX with 3D visualization module</td><td>3.3)</td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552-3</td><td>3.1.6)</td></tr><tr><td>Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6)</td><td>Dr. Teixeria, L.</td><td></td><td>4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)</td></tr><tr><td>Listeria monocytogenes</td><td>ATCC</td><td>strain: 10403S</td><td>4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) werd gekweekt in Difco Brain-heart infusion (BHI) bouillon (BD Biosciences) bevattende 50 &micro;g/ml streptomycin bij 30 &deg;C.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Thermo Fisher Scientific(Invitrogen)</td><td>18068015</td><td>gDNA degradatie</td></tr><tr><td>cDNA Synthesis Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>1708891</td><td>cDNA synthese</td></tr><tr><td>IIV6_193R_F</td><td>IDT</td><td></td><td>qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'</td></tr><tr><td>IIV6_193R_R</td><td>IDT</td><td></td><td>qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'</td></tr><tr><td>RpII_qRTPCR_fwd</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG</td></tr><tr><td>RpII_qRTPCR_rev</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td>qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG</td></tr><tr><td>SYBR Green qRT-PCR reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K0251, K0252, K0253</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4351107, 7500 Software v2.0</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>Anti-Listeria monocytogenes antibody</td><td>abcam</td><td>ab35132</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Anti-Actin antibody produced in rabbit</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A2066</td><td>Western blot</td></tr><tr><td>Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate</td><td>Promega</td><td>W4011</td><td>Western blot</td></tr></tbody></table>
```

winning van hemocytes van drosophila melanogaster larven voor microbiële infectie en analyse

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

Tijdens de pathogene infectie van Drosophila melanogaster, spelen hemocytes een belangrijke rol in de immuunrespons in de infectie. Het doel van dit protocol is dus een methode om te visualiseren de pathogen invasie in een specifieke immuun compartiment van vliegen, namelijk hemocytes te ontwikkelen. Met behulp van de methode gepresenteerde, maximaal 3 × 10 kunnen6 live hemocytes worden verkregen bij 200 Drosophila 3rd instar-larven in 30 min. voor ex vivo infectie. Anderzijds kunnen hemocytes besmette in vivo via injectie van 3rd instar-larven opgevolgd door hemocyte extractie tot 24 uur na infectie. Deze besmette primaire cellen werden vastgesteld, gekleurd, en beeld met behulp van de confocal microscopie. 3D voorstellingen werden vervolgens gegenereerd van de afbeeldingen tot definitief Toon pathogen invasie. Daarnaast kwalitatief hoogwaardige RNA voor qRT-PCR kan worden verkregen voor het opsporen van het pathogene agens mRNA volgende infectie, en voldoende eiwit kan worden geëxtraheerd uit deze cellen voor westelijke vlekkenanalyse. Tezamen, presenteren we een methode voor definitieve verzoening van pathogen invasie en bevestiging van de infectie met behulp van bacteriële en virale pathogen typen en een efficiënte methode voor de extractie van de hemocyte te krijgen genoeg live hemocytes van Drosophila larven voor ex vivo en in vivo experimenten van de infectie.

Als u wilt verzamelen waarmaken hemocytes voor ex vivo infectie, 3 × 10 werden6 hemocytes gehaald uit 200 Drosophila 3rd instar-larven. Ontwikkeling van onze methode, waren een aantal verschillende technieken geprobeerd. Individuele larvale dissectie zou maximaal 1,5 uur, en een gemiddelde van ~ 8000 cellen werden verkregen met behulp van deze methode18, waarvan de meeste niet levend door het einde van de collectie waren. Ver...

Deze methode laat zien hoe om te visualiseren pathogen invasie in insect cellen met driedimensionale (3D) modellen. Hemocytes van Drosophila larven waren besmet met virale of bacteriële pathogenen, ex vivo of in vivo. Besmette hemocytes werden vervolgens vast en gekleurd voor imaging met een confocal microscoop en de daaropvolgende 3D cellulaire wederopbouw.

Winning van Hemocytes van Drosophila melanogaster larven voor microbiële infectie en analyse

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Deze techniek kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van cellulaire infectie en microbiologie, zoals hoe hemocyten bijdragen aan de algemene immuunrespons bij fruitvliegen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het in het laboratorium kan worden uitgevoerd, met behulp van eerder geïnfecteerde larven. Als alternatief kunnen hemocyten van niet-geïnfecteerde larven worden gebruikt voor ex vivo-infectie.Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de beeldvormingsstappen moeilijk te leren zijn vanwege de complexiteit van de confocale microscoop en de opties voor 3D-modelreconstructie. Om het protocol te beginnen, legt u twee tot drie stukken paraffinefolie van tien centimeter bij tien centimeter onder een stereomicroscoop. Bereid vervolgens de glazen capillair voor door de capillaire polare verwarming in te stellen op 55% van het maximum.Slijp de capillairbuis tot een scherp punt van ongeveer tien micrometer. Vul de capillair met minerale olie. Monteer de gevulde capillairbuis op de nanoinjector.En open de tip van de gefuseerde capillairbuis door de tip eraf te breken met een pincet. Spuit zoveel mogelijk olie uit de capillairbuis, vul vervolgens de buis met drosophila hemocyte isolatiemedium, of DHIM. Om de rand van het hemolymfan olie gemakkelijk te kunnen visualiseren, voegt u een luchtbelle toe tussen de olie en DHIM.Gebruik een pincet om voorzichtig tien derde instar drosophila larven van de binnenwand van voedselbuisjes te plukken en plaats ze in een 100 micrometer zeef. Giet vijf milliliter steriele water op de larven en schud de zeef gedurende vijf seconden. Plaats de zeef op een tissue om het overtollige water te verwijderen.Breng de larven over in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis, verdoof ze met CO2 gas gedurende vijf seconden. Plaats vervolgens de larven op paraffinefolie onder de stereomicroscoop, met de dorsale zijde naar boven. Plaats het glazen capillair lichtjes op het achterste deel van het larvale lichaam om het op zijn plaats te houden en breek het achterste cuticula open met behulp van een fijn puntig pincet.Laat het hemolymph vloeien op de paraffinefolie. Maak een zwembad van hemolymph, inclusief hemocyten, van 20 tot 50 larven tegelijkertijd op de paraffinefolie. Gebruik de glazen capillair op de nanoinjector om het gepoolde hemolymph op te nemen.Spuit het hemolymph uit in een 1,5 milliliter microcentrifugebuis met 500 microliters DHIM. Plaats gistpasta op een druivensap-agarplaat. Maak een fijne snede in de agar waar de larven kunnen migreren om uitdroging te voorkomen.Monteer een 0,001 millimeter puntige Tungsten naald met houdende pincetten met behulp van paraffinefolie. Pipetteer 50 microliters van hoog titer, mCherry-expresserende C.Burnetii op de paraffinefolie onder de stereomicroscoop en plaats de larven in het zwembad van bacteriën. Prik de larven met een Tungsten naald.Breng de larven over op een agarplaat. Breng het resterende ziekteverwekkende medium over op de agarplaat en verzegel de plaat met paraffinefolie. Houd de larven op de plaat in vochtige lucht tot de gewenste tijd na infectie.Laat de C.Burnetii-geïnfecteerde larven 24 uur op de plaat liggen. Plaats een 12 millimeter ronde dekglaas in een putje van een 24-welplate. Pipetteer 500 microliters DHIM in de put.Extracteer en neem hemolymph op van eerder geïnfecteerde larven, en spuit het hemolymph in de put. Centrifugeer de plaat gedurende vijf minuten bij 1000 G. Configureer de confocale microscoop voor drie-kleurige beeldvorming van DAPI, EGFP en mCherry.Plaats het monster op de microscoop en focus op het monster met behulp van een 63x 1,4 numerieke apertuur objectief. Zoek de gewenste hemocyten in het beeldveld voor beeldvorming. Pas vervolgens de laservermogen en detectorwinsten aan om de juiste belichting van het monster te bereiken.Controleer meerdere Z-vlakken om er zeker van te zijn dat het belichtingsniveau geschikt is voor de volledige monsterdikte. Zoek vervolgens de bovenste en onderste positie op de Z-as van een hele hemocylt. Stel deze posities in als de start- en eindposities voor Z-sectiebereiding.Gebruik scanzoom om het gebied met de hemocylt te beeldvormen. Verzamel de beeldserie met de juiste resolutie, zoals 1024 bij 1024 pixels in het X Y-vlak en 0,3 micrometer ruimte in het Z-dimension. Importeer het Z-sectieerde beeldseriebestand in de software die is gekoppeld aan de confocale microscoop voor 3D-modelreconstructie.Selecteer een cel die co-lokalisatie toont van kernen gemarkeerd met DAPI en mCherry-expresserende C.Burnetii in een EGFP-expresserende hemocylt. Knip de beeldserie bij om alleen de enkele cel te bevatten. Selecteer de 3D-viewer optie, die het 3D-model reconstrueert met behulp van de voorgepakte algoritme van de software.Kies het gewenste beeldtype voor 3D-representatie tussen blend, surface en mixed opties. In deze methode worden hemocyten, kernen en C.Burnetii getoond met behulp van oppervlaktemodellen. Observeer de 3D-gereconstrueerde cel vanuit verschillende kijkposities door de muisknop ingedrukt te houden en de cursor rond het scherm te slepen.Pas de oriëntatie van de cel en positie van de gemodelleerde lichtbron aan om het beeld te optimaliseren. Neem ten slotte doorsneden door het model met behulp van knippen en sectiëren commando's om de inhoud van de binnenkant van de hemocylt te visualiseren. Visualisatie van de geëxtraheerde levende hemocyten die EGFP uitdrukken onder controle van de hemolectin driver vanuit meerdere beelden toont aan dat de meeste DAPI-positieve cellen ook EGFP-positief zijn.Doorsneden van Coxiella Burnetii-geïnfecteerde hemocyten bevestigen de aanwezigheid van mCherry-expresserende bacteriën in het binnenste van de cel. Afbeeldingen werden gereconstrueerd in 3D-modellen en we observeerden dat in vivo geïnfecteerde hemocyten grotere cytoplasmatische uitbreidingen vertoonden en platter

extraction-hemocytes-from-drosophila-melanogaster-larvae-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Drosophila hemocytes verspreiden over het geheel van de zich ontwikkelende embryo. Dit protocol laat zien hoe te monteren en het imago van deze migraties met behulp van embryo's met fluorescent gelabelde hemocytes.

Live-beeldvorming van Drosophila melanogaster Embryonale Hemocyte Migraties

De Drosophila hemolymph dient als zowel bloed als interstitiële vloeistof en circuleert door het hele lichaam tijdens de larve- en volwassen stadia. Deze video beschrijft een protocol om larvale hemolymph te verzamelen om de circulerende cellen te kwantificeren.

Cuticula disruptie: een methode om hemolymph te verzamelen van Drosophila larven

Source: Hiroyasu, A., D et. al., Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the procedure for establishing a bacterial infection in Drosophila larvae by placing them into a bacterial droplet and pricking them with a tungsten needle. The larvae are then incubated on a grooved, nutrient-rich agar plate to study host-pathogen interactions.

Establishing Bacterial Infection in Drosophila Larvae

Source: Hiroyasu, A., et al. Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates high-resolution confocal imaging of Drosophila melanogaster hemocytes infected with Coxiella burnetii to visualize pathogen localization in 3D, enabling detailed analysis of intracellular infection dynamics and host-pathogen interactions.

High-Resolution Confocal Imaging of Pathogen-Infected Drosophila Hemocytes

This video demonstrates the hemocyte disturbance assay, evaluating hemocyte re-adhesion in Drosophila larvae's hematopoietic pockets. Mechanical disturbance releases resident hemocytes, elevating circulating hemocyte counts. Post-recovery, re-adherence of resident hemocytes is confirmed, illustrating reversibility.

A Hemocyte Disturbance Assay to Assess Hemocyte Re-Adhesion to Hematopoietic Pockets

Drosophila melanogaster is een uitstekend modelorganisme voor het bestuderen van aangeboren immuunsystemen en de fysiologische gevolgen van infectie en ziekte. Dit protocol beschrijft hoe robuuste en kwantitatief herhaalbare bacteriële infecties aan D. melanogaster kunnen worden toegediend, en hoe vervolgens de ernst van de infectie kan worden gemeten en de immuunrespons van de gastheer kan worden gekwantificeerd.

Systemische bacteriële infectie en afweer Phenotypes in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila bloedcellen, of hemocyten, circuleren tussen residente locaties en circulatie.  In de larve lokaliseren residente (sessile) hemocyten zich in inductief micro-omgevingen, de hematopoietische zakken, terwijl circulerende hemocyten vrij bewegen in de hemolymf. Het doel van dit protocol is de gestandaardiseerde isolatie en kwantificering van deze twee, gedragsmatig verschillende maar onderling uitwisselbare, hemocytpopulaties.

Testen Bloedcel Populaties van de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

Drosophila en zoogdieren hematopoietische systemen hebben veel gemeenschappelijke kenmerken, waardoor Drosophila een aantrekkelijke genetische model om hematopoiese te bestuderen. Hier laten we dissectie en montage van grote larvale hematopoëtische organen voor immunohistochemie. We beschrijven ook werkwijzen om verschillende larvale hematopoietische compartimenten waaronder circulerende hemocytes sessiele kristalcellen testen.

Methoden om Onderzoek de lymfeklier en Hemocytes in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven

Dit protocol beschrijft een in vivo fagocytose assay in volwassen Drosophila melanogaster te kwantificeren fagocytensysteem erkenning en goedkeuring van de microbiële infecties.

Beoordeling van de cellulaire immuunrespons van de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, met behulp van een In Vivo fagocytose Assay

Dit protocol beschrijft een in vivo test van fagocytose die wordt gebruikt om het vermogen van jonge en oude Drosophila melanogaster hemocyten te beoordelen en te kwantificeren..

Beoordeling van het leeftijdsspecifieke phagocytische vermogen van volwassen drosophila melanogaster Hemocyten met behulp van een In Vivo Phagocytosis Assay

Drosophila melanogaster volwassen vliegen zijn uitgebreid gebruikt als modelorganismen om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan antimicrobiële aangeboren immuunresponsen van de gastheer en microbiële infectiestrategieën. Om het D. melanogaster larvestadium als aanvullend of alternatief modelsysteem te promoten, wordt een larvale injectietechniek beschreven.

Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

Leer hemocyt-isolatie uit Drosophila melanogaster-larven voor microbiële infectie-analyse. Deze methode maakt 3D-visualisatie van pathogeeninvasie mogelijk met confocale microscopie.

Winning van Hemocytes van Drosophila melanogaster larven voor microbiële infectie en analyse

Meer video's verkennen