Een bloed-gebaseerd testen voor de detectie van ROS1 en RET Fusion Transcripts from circulerende RNA zuur met behulp van digitale Polymerase-kettingreactie
5 april 2018
Detectie van circulerende RNA acid (cRNA) van bloed is een unmet behoefte in klinische diagnostiek. Hier beschrijven we methoden die kenmerkend zijn voor cRNA van niet-kleincellige longkanker kankerpatiënten met behulp van gevoelige en specifieke digitale polymerase-kettingreactie. De tests voldoen aan ontwerp te detecteren fusion varianten binnen 72 uur.
Het algemene doel van deze procedure is de isolatie en karakterisering door druppel digitale PCR van tumorafgeleide circulerende ribonucleïnezuur uit volbloedmonsters. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van oncologische diagnostiek. Zoals hoe om tumorafgeleide genfusie transcripten van circulerend RNA en bloedmonsters te detecteren.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het gebruik maakt van hoog geoptimaliseerde methoden voor de stabilisatie, extractie en detectie van RNA-varianten die aanwezig zijn in lage frequentie en bloedmonsters. Bloedgebaseerde tests vormen een aanvulling op traditionele weefselbiopsieën met het voordeel van het gebruik van een minimaal invasieve techniek die snelle resultaten kan opleveren. Hoewel deze methode inzicht kan geven in klinisch significante mutaties en NSCLC, kan het ook worden toegepast op andere systemen waar de toegankelijke en snelle identificatie van circulerende RNA-moleculen in volbloed nodig is.
Circulerend RNA voor de reverse transcriptiereactie wordt geïsoleerd uit bloedmonsters van donoren zoals beschreven in het tekstprotocol. Converteer het geconcentreerde circulerende RNA-monster naar cDNA met behulp van een commercieel verkrijgbaar reverse transcriptiereactiekit, inclusief willekeurige primers. Neem een controlemonster zonder reverse transcriptase op en een controlemonster zonder RNA.
Wanneer de reverse transcriptiereactie voltooid is, isoleer cDNA uit de reactiemix, met behulp van een commercieel verkrijgbare DNA concentrator spinkolom. Deze stap vergemakkelijkt de verwijdering van enzymen, primers en vrije deoxynucleotide trifosfaten. Als het cDNA niet onmiddellijk in PCR-reacties wordt gebruikt, bewaar het dan bij min 80 graden Celsius.
Draag een wegwerplabjas en nitrilhandschoenen tijdens het uitvoeren van deze procedure en een toegewijde reagensvoorbereidingsruimte. Bedek de sondes om ze te beschermen tegen licht, omdat opeenvolgende lichten de fluorescerende kleurstof aan de sonde kunnen fotobleeken. Bereid eerst de PCR-mixen voor voor een definitief reactievolume van 20 microliters zoals aangegeven in deze tabel, maar zonder nog het cDNA toe te voegen.
Vervoer vervolgens de mixen, bedekt en beschermd tegen licht, naar een PCR schone kap, gelegen in een aparte pre-amplificatiegebied. Verdeel de mixen over een PCR-plaat. Voeg het te testen cDNA toe aan de PCR-mix.
Bedek de plaat met een verwijderbare plaatsealer. Centrifugeer de platen kort om de monsters op de bodem van de putjes te verzamelen. Meng op een plaatschudder, op een lage instelling gedurende 10 seconden.
Centrifugeer de platen nogmaals kort om de monsters op de bodem van de put te verzamelen. Verwijder de plaatsealer voordat u handmatig druppelgeneratie uitvoert. Het is belangrijk om luchtbellen in de pipettetip te minimaliseren bij het laden van de monsters en later om de druppels langzaam van de cartridge naar de plaat over te brengen om druppelschade te voorkomen.
Breng voorzichtig 20 microliter van de PCR-mix over naar de monsterputjes op de druppelgeneratie cartridge. Voeg 70 microliter druppelgeneratie olie toe. Bedek met een rubberen afdichting en breng de cartridge over naar een handmatige druppelgenerator om druppelgeneratie te initiëren.
Na druppelgeneratie, gebruik tips aanbevolen door de fabrikant om druppels over te brengen naar een nieuwe PCR-plaat. Zuig en doseer de druppels langzaam, elk over 5 tot 6 seconden, zonder het uiteinde van de tip aan te raken met de druppelcartridge of -plaat. Verzegel de plaat met een folieplaatsealer.
Voer PCR uit in de thermische cycler met de volgende instellingen. Nadat de thermische cycler run is voltooid, lees de plaat met een druppellezer. Maak een plaatlay-out voor reader software die de locatie van controles en monsters identificeert en laad in de software om met het lezen te beginnen.
De plaatleesresultaten worden geanalyseerd met behulp van commercieel verkrijgbare software. Begin met navigeren naar het analysemenu om 2 dimensionale of 2D Amplitude plots te bekijken. Evalueer de algehele kwaliteit van de gegevens door de druppelgegevens te onderzoeken.
Gebruik het gebeurtenismen om de gegevens te evalueren voor het totale aantal geaccepteerde gebeurtenissen. Er zouden meer dan 10.000 gebeurtenissen per put moeten zijn. Zo niet, moeten de gegevens zorgvuldig worden geëvalueerd op aanvullende problemen.
Controleer vervolgens de gegevens op afschuwelijke fluorescentieamplitudes. Aanzienlijke amplitudeverschillen en concentratieverschilleningen tussen repliceerbare monsters duiden op slechte omgang of menging van monsters. Noteer druppelclusters met sproeipatronen op een 45 graden as, wat duidt op druppels van slechte kwaliteit of problematische monsters.
Onderzoek eerst de gegevens voor de positieve controle, geen reverse transcriptase controle en geen RNA controle. Selecteer alle controlemonsters en onderzoek de clusterkwaliteit door middel van een 2D plot voor correcte drempelstelling, een duidelijke scheiding tussen druppelcluster zou duidelijk moeten zijn. Voor elke testvariant, stel de drempel in op basis van controleputjes.
Stel drempels in op 2D plots met behulp van de kruishaartools om de dubbel negatieve druppelpopulatie te scheiden van de controlegenpopulatie op de x-as en de variantgenpopulatie, indien aanwezig, op de y-as. Enkele kopieën van elke replicaatput voor een enkel monster. Druk tenslotte de testresultaten uit als het aantal gedetecteerde variantkopieën.
Met behulp van cellijnen, die SDC4-ROS1-fusie en CCDC6-RET-fusie tot expressie brengen, verdund in de achtergrond van totaal humaan wild-type RNA, werd de detectielimiet vastgesteld op 0,2 procent variantfrequentie met elke fusievariant. Een bereiding van 5 procent off-target cellijnafgeleide RNA werd niet gedetecteerd, wat de specificiteit van de test aantoont. Analytische multiplex RNA-standaarden werden gemeten bij hoge, gemiddelde en lage concentraties over drie runs op dezelfde dag.
Drie runs op drie opeenvolgende dagen en met twee onafhankelijke operatoren. De resultaten tonen nauwkeurige detectie van zowel de fusietranscript van belang als een intern controlegen GUSB. Elke batch klinische monsters werd ook uitgevoerd met een positieve controle, een geen reverse transcriptase controle en een geen RNA sjablooncontrole.
Fusievarianten worden voorgesteld langs de y-as
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het isoleren en karakteriseren van circulerend ribonuclezuur (cRNA) uit bloedmonsters van patiënten met niet-kleincellig longcarcinoom (NSCLC). Met behulp van droplet digitale PCR maakt deze techniek de detectie van genfusietranscripten binnen 72 uur mogelijk, wat een kritieke behoefte in de oncologische diagnostiek vervult.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschapsgebied
- Oncologie
- Klinische diagnostiek
- Moleculaire biologie
Achtergrond
- De detectie van cRNA uit bloed is essentieel voor niet-invasieve kankerdiagnostiek.
- Huidige methoden zijn vaak afhankelijk van weefselbiopten, wat invasief kan zijn.
- Droplet digital PCR biedt een hoge sensitiviteit en specificiteit voor RNA-varianten met een lage frequentie.
- Deze techniek kan worden toegepast op diverse kankersoorten buiten NSCLC.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor het detecteren van tumor-afgeleide genfusietranscripten uit circulerend RNA.
- Het bieden van een snelle, minimaal invasieve diagnostische tool voor kankerpatiënten.
- Het verbeteren van het begrip van klinisch significante mutaties bij NSCLC.
Gebruikte methoden
- Isolatie van cRNA uit volbloedmonsters.
- Reverse transcriptie van cRNA naar cDNA met behulp van een commerciële kit.
- Druppelgeneratie en PCR-amplificatie van cDNA.
- Analyse van PCR-resultaten met gespecialiseerde software voor data-evaluatie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle detectie van fusietranscripten met een detectielimiet bij een variantfrequentie van 0,2%.
- Aantoonbare assay-specificiteit waarbij geen off-target RNA is gedetecteerd.
- Nauwkeurige resultaten over meerdere runs en operators.
- Duidelijke scheiding van druppelclusters, wat wijst op een correcte assay-prestatie.
Conclusies
- De ontwikkelde methode biedt een betrouwbare aanpak voor het detecteren van cRNA in bloedmonsters.
- Deze techniek kan de diagnostiek en monitoring van kanker aanzienlijk verbeteren.
- Toekomstige toepassingen kunnen worden uitgebreid naar andere soorten kanker en RNA-gebaseerde diagnostiek.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Executives
Deze op bloed gebaseerde vloeibare biopsiemethode vervult een kritieke onvervulde behoefte in de oncologische diagnostiek door snelle, minimaal invasieve detectie van ROS1- en RET-fusietranscripten uit circulerend RNA mogelijk te maken. De benadering ondersteunt vroege therapeutische hypothese-testen en biomarker-gestuurde patiëntstratificatie bij NSCLC en andere solide tumoren. Door resultaten binnen 72 uur te leveren, versnelt het de go/no-go-beslissingen in workflows voor targetvalidatie en leadidentificatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door het detecteren van laagfrequente fusievarianten in circulerend RNA.
- Operationele waarde: Biedt kwantitatieve, reproduceerbare metingen van de variantfrequentie ter ondersteuning van de beoordeling van de betrouwbaarheid van het target.
- Voorspellende waarde: Faciliteert mechanische risicovermindering door orthogonale validatie van fusie-gedreven oncogene activiteit in een vloeibare biopsie-formaat.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde cRNA-inputs die geschikt zijn voor downstream assay-ontwikkeling en biomarker-screeningcampagnes.
- Operationele waarde: Vestigt een robuuste workflow met een gedefinieerde detectielimiet (0,2% variantfrequentie) en specificiteitscontroles voor assay-kwalificatie.
- Schaalbaarheidswaarde: Ondersteunt multiplexed detectie van acht ROS1- en acht RET-varianten, wat parallelle biomarker-evaluatie in discovery screening mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele waarde: Slaat een brug tussen discovery- en preklinische workflows door klinisch relevante read-outs van vloeibare biopsieën te bieden die weefselbevindingen weerspiegelen.
- Voorspellend vertrouwen: Maakt longitudinale monitoring van fusiedynamiek mogelijk om risicogecorrigeerde beslissingen over voortgang in preklinische modellen te onderbouwen.
- Continuiteitswaarde: Ondersteunt de afstemming van translationele biomarkers door middel van niet-invasieve bemonstering dezelfde fusievarianten te detecteren als die zijn geïdentificeerd in tumormodellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie tot leadidentificatie en biedt een via vloeibare biopsie mogelijk gemaakte biomarkerbeoordeling, die zowel de screening van verbindingen als de mechanistische follow-up ondersteunt.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door fusietranscripten in circulerend RNA te detecteren om de relevantie van het target in in vivo-achtige contexten te valideren.
- Screening: Levert kwantitatieve, reproduceerbare dPCR-outputs die een betrouwbare evaluatie van verbindingen tegen fusie-gestuurde signalering mogelijk maken.
- Analytics: Genereert digitale uitlezingen van variantkopieën en controlesignalen van het gen (GUSB) voor nauwkeurige kwantificering en vergelijking tussen condities.
- Translationeel Onderzoek: Zorgt voor preklinische continuïteit door de dynamiek van fusievarianten in een liquid biopsy-formaat te monitoren over verschillende behandelarmen heen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een gestandaardiseerd, minimaal invasief platform voor herhaalde bemonstering in longitudinale studies en cross-functionele projecten.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door mechanische ambiguïteit in fusie-gestuurde pathways te verminderen via directe biomarkerdetectie.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid via gedefinieerde procedures voor monsterverwerking, controles en het vaststellen van drempelwaarden.
- Strategische waarde: Verbetert de kapitaalefficiëntie door snelle go/no-go beslissingen mogelijk te maken op basis van via vloeibare biopsie bevestigde target engagement.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door vroegtijdige bewijzen van targetmodulatie in klinisch relevante monsters te leveren.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in RNA-behandeling, de opstelling van digitale PCR en druppelgeneratie om degradatie van monsters en technische variabiliteit te voorkomen.
- Afhankelijk van instrumentatie voor druppelgeneratie, PCR-amplificatie en fluorescentiedetectie in een gecontroleerde omgeving.
- Necessiteert standaardisatie tussen teams voor monstername, verwerking en data-analyse om vergelijkbaarheid tussen locaties en studies te garanderen.
- Vereist aanpassing van het inputvolume en controlestrategieën wanneer toegepast op verschillende modelsystemen of monstertypes.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak voor zorgvuldige behandeling van druppels om coalescentie te vermijden en de vereiste van een voldoende RNA-frequentie voor betrouwbare detectie.
