Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) van Histone modificaties van Saccharomyces cerevisiae

Het algemene doel van dit chromatine immunoprecipitatie protocol is om de abundantie en lokalisatie van histonmodificaties te bepalen in specifieke regio's van het kiemende gist genoom. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over chromatine regulatie, zoals hoe histonmodificaties zijn gekoppeld aan genexpressie controle en hoe deze modificaties veranderen in reactie op verschillende omgevingscondities. Een uiterst veelzijdig protocol dat kan worden gebruikt om veel verschillende histonmodificaties en meerdere E-stammen tegelijkertijd te onderzoeken.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in histonmodificaties, kan deze ook worden toegepast om andere chromatine bindings eiwitten te onderzoeken door het gebruik van epitope tags of beschikbare antilichamen. Begin deze procedure door de gistcellen te laten groeien, inoculeer 10 milliliter YPD medium met een enkele kolonie van elke geschikte stam en laat deze 30 graden Celsius groeien in een schuddende incubator bij 220 rpm overnacht. Op de volgende dag na het meten van de optische dichtheid bij 600 nanometer of OD600 van de cultuur, verdun de cultuur tot een OD600 van 0,2 in 100 mL YPD in een nieuwe fles.

Laat de cellen groeien bij 30 graden Celsius in een schuddende incubator bij 220 rpm totdat ze de mid log fase bereiken. Wanneer de culturen de mid log fase hebben bereikt, voeg 2,7 milliliter 37% formaldehyde direct toe aan het medium in elke fles voor een eindconcentratie van 1% formaldehyde. Breng de flessen over naar een shaker bij kamertemperatuur en schud gedurende 15 minuten bij 50 rpm.

Voeg vijf milliliter 2,5 molaire glycine toe aan het medium en blijf schudden bij 50 rpm bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten om het formaldehyde te dempen. Vervolgens spin de cellen neer en was ze zoals beschreven in het tekstprotocol. Verwijder het supernatant na de laatste spin en ga verder met het maken van gist lysaten.

Re-suspendeer de cellen in één milliliter koude chromatine amino precipitatie of ChIP Lysis buffer met 1 millimolair PMSF en 1:1000 verdunning van een gist protease remmer cocktail. Breng de suspensie over naar een 2,0 milliliter schroefdopbuisje dat 200 microliters glazen kralen bevat. Breng de cellen over naar een bead-beating apparaat voor een hoge snelheid agitatie bij vier graden Celsius.

Bead-beat gedurende 30 seconden en plaats op ijs gedurende één minuut. Bead-beat in totaal zes keer, houd de cellen gedurende ten minste één minuut op ijs tussen elke 30 seconden beat-beating. Gebruik een gel lading tip om het lysate over te brengen naar een 1,5 milliliter buisje.

Centrifugeer het lysate bij 15.500 g bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Gooi het supernatant weg en re-suspendeer de pellet in 250 microliters micrococcal nuclease spijsverterings buffer door voorzichtig op en neer te pipetteren. Voeg 2,5 microliters micrococcal nuclease toe aan elke reactie.

Meng voorzichtig door vier tot zes keer om te draaien en incubeer onmiddellijk in een 37 graden Celsius waterbad gedurende 20 minuten. Na 20 minuten, stop de reactie door de buisjes op ijs te plaatsen, vijf milliliter 0,5 molair EDTA toe te voegen voor een eindconcentratie van 10 millimolair EDTA en voorzichtig te mengen door om te draaien. Centrifugeer bij 15.500 g bij vier graden Celsius gedurende 15 minuten.

Breng vervolgens elk supernatant over naar een nieuw 1,5 milliliter buisje. Voor de meest consistente resultaten is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat dezelfde concentratie eiwit wordt gebruikt in elke amino precipitatie. Afhankelijk van het aantal amino precipitatie of IP reacties, maak een mastermix van elke micrococcal nuclease vrijgegeven chromatinefractie en ChIP lysis buffer en wijs één milliliter toe dat 50 microgram totaal eiwit bevat aan individuele buisjes.

Verwijder 100 microliters van elk IP mix om als input monster te verwerken. Vries de input monsters in bij 20 graden Celsius voor later gebruik. Het is ook belangrijk om ervoor te zorgen dat dezelfde hoeveelheid kralen gebonden aan het antilichaam wordt gebruikt voor elke immunoprecipitatie.

Gebruik een brede board pipette tip om 20 microliters magnetische eiwit AG kralen, vooraf gebonden met antilichaam toe te voegen aan elk IP monster. Draai de monsters bij acht rpm bij vier graden Celsius gedurende drie uur. Wanneer de IP klaar is, plaats de buisjes in een magnetische standaard en laat de kralen zich verzamelen aan de zijkant van de buis.

Gebruik een pipette om het supernatant te verwijderen. Voeg één milliliter ChIP lysis buffer toe aan de kralen en draai bij acht rpm bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Plaats vervolgens de buisjes op de magnetische standaard en verwijder het supernatant.

Was op deze manier de kralen successief met de volgende buffers voor het aangegeven aantal keren. ChIP Lysis Buffer, High Salt Wash Buffer, LiCl/detergent Wash Buffer en TE. Gebruik bij de laatste TE was 0,5 milliliter TE om de meeste kralen over te brengen naar een nieuwe buis en gebruik vervolgens nog eens 0,5 milliliter TE om de buis te wassen en de resterende kralen over te brengen. Voeg 250 microliters vers gemaakte ChIP elutie buffer toe aan elke buis en kortjes de oplossing voorzichtig te vortexen.

Draai de monsters bij acht rpm bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Plaats de buisjes in de magnetische standaard. Draag voorzichtig het supernatant over naar een nieuwe buis en vermijd de kralen.

Voeg nog eens 250 microliters ChIP elutie buffer toe aan de kralen. Draai de monsters bij acht rpm bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Draag voorzichtig en zonder de kralen te verstoren, het supernatant over naar de buis met de eerste elutie.

Ontdooi de eerder verzamelde input monsters en voeg 400 microliters ChIP elutie buffer toe aan elk input monster. Om eiwit DNA kruisverbindingen om te keren, voeg toe aan zowel input als IP monsters, 20 microliters vijf molair natriumchloride, vijf microliters glycogeen en 12,5 microliters Proteinase K. Meng goed door om te draaien of door de buisjes te slaan. Incubeer de monsters in een 65 graden Celsius waterbad ge