Name: Fractionering voor oplossing van oplosbare en onoplosbare Huntingtin soorten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Leer een fractioneringsmethode voor oplosbare en onoplosbare Huntingtin-eiwitten uit muizenhersenen en celculturen. Deze techniek helpt bij het analyseren van eiwitflux en homeostase bij de ziekte van Huntington.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de NIH (RO1-NS090390). Wij zouden ook willen bedanken Dr. Joan Steffanfor technische bijstand en discussie tijdens de ontwikkeling van deze test.

Dierlijke ethiek verklaring - experimenten werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren van het National Institutes of Health en een goedgekeurde dierlijke onderzoeksprotocol door de institutionele Animal Care en gebruik Comité ( IACUC) aan de Universiteit van Californië, Irvine, een AAALAC geaccrediteerde instelling. Alle inspanningen waren geleverd om te minimaliseren van dierenleed.
1. bereiding van Lysis Buffers
<ol><li>Bereiden "Oplosbare" lysis-buffermengsel (10 mM Tris pH 7.4, 1% Triton-X 100, 150 mM NaCl, 10% glycerol) en steriele filter door 0,22 µm filter.<ol>
<li>Meten voor een werkende "Oplosbare" lysis-buffermengsel, N-Ethylmaleimide (NEM) en grondig oplossen in 100 mM phenylmethysulfonyl flouride (PMSF) opgelost in 100% EtOH. Opmerking: Lysis Buffer remmers: (i) 20 mM N-ethylmaleimide (NEM); (ii) 0.2 mM PMSF; (iii) 1 mM natrium orthovanadate (Na3VO4); (iv) 1 µg/mL leupeptin; (v) 1 µg/mL aprotinin; (vi) 20 mM Natriumfluoride (NaF). Let op: Draag een gezichtsmasker bij het werken met NEM in het gehele protocol. Werken van lysis-buffermengsel moet geschieden verse om actieve remmers.</li>
		<li>Voor oplosbare lysis-buffermengsel met proteaseinhibitors, voeg remmers in de volgende volgorde: Natriumfluoride (NaF), aan tot de streep met koude lysis-buffermengsel, natrium orthovanadate (Na3VO4), Aprotinin en Leupeptin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voor "Onoplosbaar" lysis-buffermengsel, aanvulling op 4% SDS door 500 µL van 20% SDS aan 2 mL lysisbuffermengsel "Soluble" toe te voegen. Laat bij kamertemperatuur. Opmerking: SDS neerslaat uit bewaard bij 4 ° C; Houd dit op kamer temp. Eindsamenstelling van Lysis Buffer: 10 mM Tris (pH 7.4); 1% Triton X-100; 150 mM NaCl; 10% glycerol; 4% SDS (onoplosbaar, alleen).</li>
</ol>2. oplosbare/onoplosbare fractionering Protocol
Opmerking: Zie afbeelding 1 voor een schema.
<ol><li>Label twee sets van buizen voor elk monster: "Soluble" en "Onoplosbaar".</li>
	<li>Voeg X-µL van ijskoude werken oplosbare lysis-buffermengsel aangevuld met proteaseinhibitors (zie 1.1.1) weefsel. Opmerking: X = Volume varieert afhankelijk van weefsel bedrag; Zie tabel 1.</li>
	<li>Voor de muis hersenweefsel (d.w.z., striatum), dounce langzaam 30 keer in glas 1 mL douncer en Pipetteer in "Onoplosbaar" aangeduid met buis (Houd op ijs). Opmerking: Wees voorzichtig niet te breken oppervlak van vloeistof na het starten van douncing, zoals bubbels vormen zullen en onvolledige homogenisering kunnen opleveren.</li>
	<li>Spoel de cellen één keer met koud, 1 x PBS voor cellen (dat wil zeggen, HeLa, HEK293T). Verwijderen van PBS en minimale volume van lysis-buffermengsel toepassen op cellen en lift met cel schraper. Opmerking: Hierboven cellijnen, cellen waren uitplaten aan 5 x 105 cellen per 6 goed plaat en uitgegroeid tot in de buurt van confluentie. Een is goed vergelijkbaar met volumes zijn opgebruikt voor muis striatum.</li>
	<li>Breng homogenaat of lysate in cel met het label, "Onoplosbaar" buizen en lyse op ijs 1 h (Start klok nadat definitieve buis is verwerkt). Opmerking: Voor cel lysates, triturate meerdere malen te breken cel bosjes vóór het opstarten van de incubatie. Vorming van luchtbellen vermijden. Kort vortex pulse elk monster voor 1 s halverwege lysing.</li>
	<li>Centrifugeer steekproeven bij 4 ° C bij 15.000 x g gedurende 20 min.</li>
	<li>Herstellen bovendrijvende substantie als de breuk "Soluble".<ol>
<li>Verwijder met Pipetteer, wees voorzichtig niet te verstoren, pellet/bewolkt laag zoals dit de breuk vervuilen zal. Pipetteer oplosbare fractie in "Soluble" label buis. Houd op ijs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pellet met 500 µL van lysis-buffermengsel (x2) en centrifuge bij 4 ° C bij 15.000 x g gedurende 5 minuten wassen nadat elk wassen; het is oke als sommige van de bewolkt laag is afgepipetteerde af.</li>
	<li>Verwijder alle resterende was buffer, waardoor alleen de pellet van weefsel na definitieve wassen. Opmerking: Vanaf dit punt, onoplosbare monsters moeten nu worden bewaard bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Resuspendeer pellet met X-µL lysis-buffermengsel aangevuld met 4% SDS (Volume kan worden aangepast afhankelijk van de grootte van de pellet; Zie tabel 1).</li>
	<li>Bewerk ultrasone trillingen ten elk monster voor 30 s bij kamertemperatuur met een sonde ultrasoonapparaat (125 watt, 20 kHz, Pulse, Amplitude 40%, Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Monsters (rollend kook) kook gedurende 30 minuten; Kort centrifugeren (15 s) bij 6.000 x g over een monster niet te verliezen.</li>
	<li>Uitvoeren van DC (detergenten compatibel) eiwit assay (Zie Tabel van materialen) of Lowry eiwit assay voor het meten van de eiwitconcentratie (aanbevolen gestarte verdunningen van 1/5 van het monster in de respectieve lysis-buffermengsel voor celkweek en 1/10 voor weefsel lysates). Opmerking: Eiwit concentraties moet worden gelezen met behulp van een DC of Lowry bepaling als gevolg van de hoge concentratie van wasmiddel.</li>
	<li>Aliquot monsters in 50 µL partijen om bevriezen-ontdooien problemen te voorkomen. Opmerking: Protocol kan worden onderbroken hier vóór verdere biochemische analyse doordat beide fracties bij-20 ° C.</li>
</ol>3. westelijke vlek en kwantificering
<ol><li>Westelijke vlekken zoals gerapporteerd elders uitvoert1,13 door verdunnen 30 µg van voorbeeld 1:1 bij het laden van de buffer (1.6 x laden kleurstof, 1 x verminderen). Opmerking: 30 µg eiwit per fractie is voldoende, maar kan worden aangepast voor een optimale resolutie. 3 - 8% Tris-acetaat poly-acrylamide gels moeten worden gebruikt voor de onoplosbare breuk. 4 - 12% bis-Tris gels worden aanbevolen voor de oplosbare fractie.</li>
	<li>Monsters (rollende kook) gedurende 5 min. Centrifuge kort koken (15 s) bij 6.000 x g monster te verzamelen.</li>
	<li>Breuken door SDS-pagina en westelijke vlek, volgens protocol van de fabrikant voor gereduceerde monsters analyseren. Opmerking: Onoplosbare breuk verhelpt best wanneer overgezet naar 0,45 µM nitrocellulose membraan. 0,45 of 0,2 µM nitrocellulose kan worden gebruikt voor de oplosbare fractie, afhankelijk van de grootte van de proteïne van belang. Wat optimalisatie kan worden verlangd voor de beste overdracht van HMW materialen.</li>
	<li>Vlek membraan met hele eiwit vlek (bijvoorbeeld, MEMcode, zie de Tabel van materialen) te visualiseren van eiwitten laden van efficiëntie. Opmerking: Western blots kunnen worden geanalyseerd door gemiddelde pixel intensiteit. Oplosbare breuken kunnen worden genormaliseerd op een house-keeping proteïne beste geschikt voor het experimentele systeem. Onoplosbare breuk als relatieve eiwit overvloed werd gecontroleerd door de omkeerbare eiwit kleuring of Histon 3 normalisatie op aparte vlek.</li>
</ol>

<ol><li>Ochaba, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIAS1+Regulates+Mutant+Huntingtin+Accumulation+and+Huntington%27s+Disease-Associated+Phenotypes+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo.</a> Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).</li>
<li>La Spada, A. R., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeat+expansion+disease%3A+progress+and+puzzles+in+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis.</a> Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).</li>
<li>Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+neuropathology+of+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Genetics and neuropathology of Huntington's disease.</a> Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).</li>
<li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington%27s+disease+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li>
<li>Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease%3A+the+current+state+of+research+with+peripheral+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease: the current state of research with peripheral tissues.</a> Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).</li>
<li>Weydt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoregulatory+and+metabolic+defects+in+Huntington%27s+disease+transgenic+mice+implicate+PGC-1alpha+in+Huntington%27s+disease+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington's disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington's disease neurodegeneration.</a> Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).</li>
<li>Schulte, J., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+function+of+the+Huntingtin+protein+and+its+relevance+to+Huntington%27s+Disease+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Trends+Neurol%22%5BJournal%5D)">The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington's Disease pathology.</a> Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).</li>
<li>Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrantly+spliced+HTT%2C+a+new+player+in+Huntington%27s+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington's disease pathogenesis.</a> RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).</li>
<li>Neueder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenic+exon+1+HTT+protein+is+produced+by+incomplete+splicing+in+Huntington%27s+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington's disease patients.</a> Sci Rep. 7 (1), 1307(2017).</li>
<li>Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+the+first+17+amino+acids+of+huntingtin+in+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomol+Concepts%22%5BJournal%5D)">The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington's disease.</a> Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).</li>
<li>Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+acts+in+the+nucleus+to+induce+apoptosis+but+death+does+not+correlate+with+the+formation+of+intranuclear+inclusions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions.</a> Cell. 95 (1), 55-66 (1998).</li>
<li>Kim, S., Kim, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+Approaches+for+Inhibition+of+Protein+Aggregation+in+Huntington%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington's Disease.</a> Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).</li>
<li>O'Rourke, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-2+and+PIAS1+modulate+insoluble+mutant+huntingtin+protein+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation.</a> Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).</li>
<li>Shibata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+intracellular+accumulation+of+mutant+Huntingtin+by+Beclin+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1.</a> J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).</li>
<li>Apostol, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-based+assay+for+aggregation+inhibitors+as+therapeutics+of+polyglutamine-repeat+disease+and+validation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).</li>
<li>Wanker, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+filter+assay+for+detection+of+amyloid-like+polyglutamine-containing+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates.</a> Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).</li>
<li>Sontag, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Mutant+Huntingtin+Aggregation+Conformers+and+Modulation+of+SDS-Soluble+Fibrillar+Oligomers+by+Small+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Huntingtons+Dis%22%5BJournal%5D)">Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules.</a> J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).</li>
<li>Grima, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+Huntingtin+Disrupts+the+Nuclear+Pore+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex.</a> Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).</li>
<li>Sontag, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylene+blue+modulates+huntingtin+aggregation+intermediates+and+is+protective+in+Huntington%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington's disease models.</a> J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).</li>
<li>Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tricyclic+pyrone+compounds+prevent+aggregation+and+reverse+cellular+phenotypes+caused+by+expression+of+mutant+huntingtin+protein+in+striatal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons.</a> BMC Neurosci. 10, 73(2009).</li>
<li>Shahmoradian, S. H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23853712">TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation.</a> Elife. 2, e00710(2013).</li>
<li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+inhibition+induces+alpha-synuclein+SUMOylation+and+aggregate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation.</a> J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).</li>
<li>Goldberg, N. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Neural+Progenitor+Transplantation+Rescues+Behavior+and+Reduces+alpha-Synuclein+in+a+Transgenic+Model+of+Dementia+with+Lewy+Bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies.</a> Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Enkele voorzorgsmaatregelen zijn nodig voor de bovenstaande protocollen om ervoor te zorgen consequent en kwantitatieve resultaten. Eerst, mHTT in beide breuken spontaan zal aggregaten vormen na verloop van tijd op meerdere bevriezen dooi cycli, met name bij een hoge concentratie. Het is dus cruciaal voor aliquots van het eiwit preps bevriezen en ontdooien alleen het benodigde volume voordat u de test uitvoert zoals beschreven in het bovenstaande protocol. Verder, als onoplosbare breuk resulteert in witte neerslaande bij...

De verstoring van eiwit kwaliteitscontrole netwerken, zodat het juiste vouwen en aantasting van de cellulaire eiwitten is waarschijnlijk centraal in de pathologie in de ziekte van Alzheimer (AD), de ziekte van Parkinson (PD), de ziekte van Huntington (HD), en andere "eiwit misfolding" stoornissen2,3. Een gedetailleerd inzicht in de proteostasis-netwerkonderdelen en hun bijdragen aan de pathologie zijn daarom cruciaal voor de ontwikkeling van verbeterde therapeutische interventies. HD wordt veroorzaakt door de abnormale groei van een herhaling van het CAG binnen het HD-gen wat resulteert in een uitgebreid stuk van polyglutamines (polyQ) in het eiwit huntingtin (HTT)4. Een consistente pathologische functie van HD pathogenese is de resulterende misfolding, accumulatie en aggregatie van HTT in gebieden van de hersenen en perifere weefsels, waarvan is aangetoond te bemoeien op verschillende manieren met de normale cel homeostase en functie 5 , 6. terwijl HTT overal wordt uitgedrukt, middellange Maxomys neuronen in het striatum zijn selectief kwetsbare en meest openlijk waarin dit probleem optreedt met opmerkelijke corticale atrofie ook geassocieerd met HD pathogenese.
De vorming van aggregaten van HTT in de hersenen van HD patiënten en diermodellen heeft meestal geserveerd als een proxy-marker van progressie van de ziekte en dominant-negatieve winst van functie voor mHTT7. Hoewel de precieze mechanismen door welke proteïne misfolding en aggregatie aan mHTT-geïnduceerde toxiciteit bijdragen kunnen onduidelijk blijven, is de vorming van deze insluitsels in de hersenen van HD patiënten en verschillende diermodellen een invariant en onvermijdelijke functie. Insluitsels lijken te bestaan grotendeels uit geaccumuleerde HTT fragmenten met de N-terminal uitgebreid polyQ, die aangeeft dat proteolyse en verwerking van full-length HTT evenals alternatieve splicing8,9 kan spelen een belangrijke rol in de pathogenese van HD. N-terminale HTT fragmenten kan vormen een pathologische vorm van HTT die kan snel aggregaat, ervoor, en versnellen of propageren de aggregatie proces10.
De aanwezigheid van deze insluitsels doet echter niet noodzakelijkerwijs met HTT-geïnduceerde toxiciteit of cel dood11correleren. HTT wordt voorgesteld te ondergaan het proces van een samenvoeging van een oplosbare monomeer door oplosbare oligomere soorten en β-sheet fibrillen tot onoplosbare aggregaten en insluitsels12. Oplossen van deze verschillende eiwit soorten via standaard biochemische tests is een uitdaging op het gebied als gevolg van hun stabiliteit in lage-wasmiddel lysis-buffermengsel en moeilijkheden in het visualiseren met behulp van standaard biochemische tests. Methodologische overwegingen zijn dus cruciaal voor het opsporen van de mate en het patroon van opgebouwde en geaggregeerde mHTT.
Het hier gepresenteerde protocol biedt een methode om te visualiseren van verschillende tussenproducten van HTT, specifiek de vorming van een onoplosbare HMW HTT-soorten, die lijkt te nauw track met HD pathogenese en ziekte progressie1,13 ,14. Zijnde kundig voor oplossen en het bijhouden van meerdere soorten mHTT biedt onderzoekers een biochemische instrument om te studeren van de pathogenese van de ziekte en het evalueren van potentiële therapeutische interventies door hun modulatie en het effect op de pathogenese van de ziekte.

<table><tbody><tr><td>Sterile Filter</td><td>Millipore</td><td>SCGP505RE</td><td>Schroefdopwissel, steriele vacuümfilter</td></tr><tr><td>1 mL Tissue Grinder, Dounce</td><td>Wheaton</td><td>357538</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Model Q125</td><td></td></tr><tr><td>DC Protein Assay</td><td>Biorad</td><td>5000111</td><td>Vergelijkbaar met Lowry assay</td></tr><tr><td>Tris 1M buffer oplossing</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60636</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 5M oplossing</td><td>Teknova</td><td>S0251</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS oplossing</td><td>Teknova</td><td>S0295</td><td></td></tr><tr><td>N-ethylmaleimide</td><td>Sigma</td><td>E1271</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfonylfluoride</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>maak 100mM stockoplossing in 100%EtOH, bewaar bij 4&deg;C</td></tr><tr><td>Natriumorthovanadate</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td>Maak 0,5M stockoplossing in water</td></tr><tr><td>Leupeptine</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td>Maak 10mg/ml stockoplossing in water</td></tr><tr><td>Aprotinine</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td>Maak 10mg/ml stockoplossing in water</td></tr><tr><td>Natriumfluoride</td><td>Sigma</td><td>S4504</td><td>Maak 500mM stockoplossing in water</td></tr><tr><td>Anti-HTT</td><td>Millipore</td><td>MAB5492</td><td>Gebruik 1:1000 voor western blot, 1:500 voor filter retardatie assay</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56875</td><td>Gebruik 1:1000 voor oplosbare western blot</td></tr></tbody></table>

fractionering voor oplossing van oplosbare en onoplosbare huntingtin soorten

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

De accumulatie van misfolded eiwitten staat centraal in de pathologie in de ziekte van Huntington (HD) en vele andere neurodegeneratieve aandoeningen. Met name is een pathologische spil van HD de afwijkende accumulatie van mutant HTT (mHTT) eiwit in ultrahoog moleculair gewicht complexen en intracellulaire opneming organen samengesteld van fragmenten en andere eiwitten. Conventionele methodes voor het meten en begrijpen dat de bijdragen van verschillende vormen van mHTT-bevattende aggregaten zijn fluorescentie microscopie, westelijke vlekkenanalyse en filter overlappen testen.
Meeste van deze methoden zijn echter conformatie specifiek, en daarom kan niet kunt oplossen door de volledige staat van mHTT eiwit flux vanwege de complexe aard van de totale oplosbaarheid en resolutie.
Voor de identificatie van geaggregeerde mHTT verschillende complexen en aangepaste formulieren is scheiding en solubilisatie van de cellulaire aggregaten en fragmenten verplicht. Hier beschrijven we een methode om te isoleren en visualiseren van oplosbare mHTT monomeren, oligomeren, fragmenten en een onoplosbare ultrahoog moleculair gewicht (HMW) geaccumuleerde mHTT soorten. HMW mHTT bijgehouden met de progressie van de ziekte, komt overeen met muis gedrag uitlezingen en heeft geweest beneficiair gemoduleerd door bepaalde therapeutische interventies1. Deze aanpak kan worden gebruikt met muis hersenen en perifere weefsels celkweek maar kan worden aangepast aan andere modelsystemen of ziekte contexten.

Resolutie van oplosbare en onoplosbare cel lysates na fractionering kan worden opgespoord met behulp van westerse analyse en filter retardatie assays (Figuur 2). Als voorbeeld, HEK293T cellen werden transfected met behulp van transfectiereagens (b.v., lipofectamine 2000) met HTT exon 1 coderen cDNA met 97 glutamine herhaalt15 gevolgd door de poly proline rijke regio en deze cellen mochten uitdrukkelijke voor 44 h. cellen werde...

Een methode is beschreven voor fractionering van onoplosbare en oplosbare mutant huntingtin soorten van muis hersenen en cel cultuur. De beschreven methode is nuttig voor karakterisering en kwantificering van het huntingtin eiwit flux en aids in het analyseren van eiwitten homeostase in de pathogenese van de ziekte en in het bijzijn van verstoringen

Fractionering voor oplossing van oplosbare en onoplosbare Huntingtin soorten

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Het algemene doel van deze procedure is om een nuttig hulpmiddel te beschrijven voor visualisatie, karakterisering en kwantificering van huntingtine-eiwitflux voor de analyse van eiwithomeostase in modelsystemen van de ziekte van Huntington. Deze methode kan ons helpen vragen te begrijpen op het gebied van eiwithomeostase en neurodegeneratieve ziekten, zoals het begrijpen van de impact van bepaalde therapeutische interventies op de ziektepathogenese. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het onderzoekers toestaat om onoplosbare eiwitsoorten te isoleren en op te lossen voor kwantitatieve analyse.Hoewel deze methode inzicht kan geven in biochemische veranderingen tijdens de pathogenese van de ziekte van Huntington, kan deze ook worden toegepast op andere eiwitmisvouwingziekten zoals Parkinson en de ziekte van Alzheimer. Om deze procedure te beginnen, label twee sets buizen voor elk monster als oplosbaar en onoplosbaar. Bereid onmiddellijk voorafgaand aan de monsterlysis in de oplosbare buis een lysisbuffer voor door de juiste hoeveelheid remmers toe te voegen.Voeg vervolgens ijskoud werkende oplosbare lysisbuffer, aangevuld met proteaseremmers, toe aan het weefsel. Voor muisbreinweefsel, dounce langzaam 30 keer in een glazen douncer van één milliliter. Wees voorzichtig om het oppervlak van de vloeistof niet te breken, aangezien er zich luchtbellen zullen vormen en een onvolledige homogenisatie kunnen veroorzaken.Pipet het vervolgens in de op ijs geplaatste buis met de aanduiding onoplosbaar. Voor cellijnen werden cellen geplaatst op vijf maal 10 tot de vijfde cel in elke zes-well plaat en gekweekt tot nagenoeg confluency. Daarna, spoel de cellen eenmaal met koud 1X PBS en verwijder het.Breng vervolgens een minimale hoeveelheid lysisbuffer aan op de cellen en til ze op met een celschraper. Breng vervolgens het homogenaat of cellysaat over in de oplosbare buis en lyseer op ijs gedurende één uur. Voor cellysaten, tritureer meerdere keren om celklompjes te breken voordat u begint met incubatie en vermijd het vormen van bellen.Pulseer kort elk monster gedurende één seconde halverwege het lyseren. Centrifugeer de monsters vervolgens bij vier graden Celsius bij 15.000 x g gedurende 20 minuten. Verwijder vervolgens het supernatant.Wees voorzichtig om het pellet of de troebele laag niet te verstoren, aangezien dit de fractie zal verontreinigen. Pipet het supernatant als oplosbare fractie in de oplosbare buis en bewaar het op ijs. Het bijhouden van de oplosbare en onoplosbare lysisbuffers is cruciaal.Het omwisselen van de buffers of het plaatsen van de onoplosbare buffer of monsters op ijs zal nadelig zijn voor het resultaat van het protocol. Was het pellet met 500 microliter lysisbuffer en centrifugeer het bij vier graden Celsius bij 15.000 x g gedurende vijf minuten. Herhaal de wassing nog een keer.Vervolgens verwijdert u alle resterende wasbuffer, waardoor alleen het weefselpellet overblijft. Resuspendeer vervolgens het pellet met lysisbuffer aangevuld met 4%SDS. Soniceer elk monster gedurende 30 seconden bij kamertemperatuur met een sonicatie-sonde.Het soniceren van kleine volumes gedurende een lange periode is technisch uitdagend. Wees voorzichtig om geen enkel monster te verliezen door te emulgeren of spuiten tijdens het uitvoeren van deze stap. Kook vervolgens de monsters gedurende 30 minuten.Centrifugeer ze vervolgens kort bij 6.000 x g. Voer vervolgens een detergenscompatibele eiwitassay of Lowry-eiwitassay uit om de eiwitconcentratie te meten. Deel vervolgens de monsters in batches van 50 microliter om bevriezing/ontdooi-problemen te voorkomen.Voer in deze stap western blots uit door 30 microgram monster te verdunnen in een verhouding van één op één in laadbuffer. Kook de monsters gedurende vijf minuten en centrifugeer ze kort bij 6.000 x g. Analyseer vervolgens de fracties door SDS-pagina en western blot.Kleur het membraan met een geheel-eiwitkleuring om de eiwitbelastingseffizienzie te visualiseren. Hier zijn de oplosbare en onoplosbare fracties van HEK 293T-cellysaat opgelost op respectievelijk een 4-12%Bis-Tris en 3-8%Tris-Acetaat-paginagel. Oplosbare fractie genormaliseerd op GAPDH-belastingscontrole toont fluctuatie van mutant huntingtine-exon 1 oplosbare monomeer op basis van blootstelling aan proteaseremmer MG132.De onoplosbare fractie laat zien dat hoge moleculaire gewichtsaccumulaties van mutant huntingtine ook worden gemoduleerd door behandeling met MG132. En hier zijn de monsters van oplosbare en onoplosbare fracties van HeLA-cellysaat met behulp van western blot en filtervertragingsanalyse. Gegevens tonen aan dat de aanwezigheid van een overgeëxpresseerd SUMO-isovorm zowel hoge moleculaire gewichtsmutante als fibrillaire onoplosbare mutante huntingtine in de onoplosbare fractie verhoogt.Deze figuur toont de regulatie van de accumulatie van hoge moleculaire gewichtsmutante huntingtine na modulatie van een potentieel therapeutisch middel in de onoplosbare fractionering van HeLa-cellen die 97Q huntingtine-exon 1 overexpresseren. Therapeutisch doelwit PIAS1 werd hetzij gesilenceerd met een siRNA naar PIAS1 of overgeëxpresseerd. Onoplosbare fracties van muisstriatum behandeld met microRNA tegen PIAS1 en opgelost op 3-8%Tris-Acetaat-paginagels tonen modulatie van hoog moleculair gewicht onoplosbare huntingtine.Vergeet niet dat het werken met NEM uiterst gevaarlijk kan zijn en het nemen van voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van een mondmasker, moet altijd worden overwogen bij het uitvoeren van dit protocol. Eenmaal onder de knie, kan deze techniek van lysaat tot einde van fractionering in ongeveer drie tot vier uur worden uitgevoerd, afhankelijk van het aantal monsters. Er moet een extra uur worden toegekend voor eiwitkwantificering en het verdelen in aliquoten.Na het volgen van deze procedure kunnen andere methoden zoals agarosegelelektroforese of filtervertraging worden uitgevoerd om respectievelijk oplosbare oligomeren of onoplosbare fibrillen te detecteren. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u on

fractionation-for-resolution-soluble-insoluble-huntingtin

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

We beschrijven hier een protocol voor de zuivering van zeer actieve Hsp104, een hexamere AAA + eiwit van gist, die koppels ATP hydrolyse aan eiwit desaggregatie. Deze regeling maakt gebruik van een His6-gelabeld bouwen voor affiniteitszuivering...

Zuivering van Hsp104, een eiwit Disaggregase

This video demonstrates the protocol for isolating  amyloid fibrils from mouse brain tissue extract using density gradient centrifugation and digestion of non-amyloid proteins.

Isolation of Amyloid Fibrils from Brain Tissue Extract

Hier presenteren wij een breukmembraan fractioneringsprotocol dat een robuuste procedure voor het isoleren van eiwitten uit verschillende synaptische compartimenten vertegenwoordigt.

Breinmembraanfractie: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Aanpak om de subsynaptische eiwit lokalisatie te beoordelen

Een verkorte fractionering protocol voor de verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke postmortem hersenen wordt beschreven.

Verrijking van wasmiddel-onoplosbaar eiwit-aggregaten van menselijke Postmortem hersenen

Een procedure wordt gepresenteerd voor het uiteinde van de dCACHE periplasmische ligand bindend domein van Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 van integratie-organen en de zuivering aan opbrengst milligram hoeveelheden eiwit.

Methode voor het efficiënt uiteinde en zuivering van de Chemoreceptor-Ligand bindend domein

Hier presenteren we een robuust en geoptimaliseerde protocol voor de productie van milligram hoeveelheden native, tag-vrije monomeren en fibrillen van de exon1 van het eiwit Huntingtin (Httex1) op basis van de voorbijgaande fusie van kleine ubiquitin verwante modifier (SUMO).

Generatie van eigen, niet-gecodeerde Huntingtin Exon1 monomeer en fibrillen met behulp van een SUMO Fusion strategie

Expressie en zuivering van fumarylacetoacetate hydrolase domein-bevattende eiwitten wordt beschreven met voorbeelden (expressie in E. coli, FPLC). De gezuiverde proteïnen worden gebruikt voor kristallisatie en antilichamenproductie en in dienst genomen voor enzym analyses. De geselecteerde fotometrische analyses worden voorgesteld om de multi-functionaliteit van FAHD1 als Oxaloacetaat decarboxylase en acylpyruvate hydrolase te tonen.

Expressie, zuivering, kristallisatie, en enzym assays van Fumarylacetoacetate hydrolase domein-bevattende eiwitten

We presenteren een techniek om translationele (eiwitbiosynthese) complexen snel te stabiliseren met formaldehyde crosslinking in levende gist- en zoogdiercellen. De aanpak maakt het mogelijk om transiënte tussenproducten en dynamische RNA:eiwitinteracties te ontleden. De crosslinked complexen kunnen worden gebruikt in meerdere downstream-toepassingen, zoals in op diepe sequencing gebaseerde profileringsmethoden, microscopie en massaspectrometrie.

Snelle in vivo fixatie en isolatie van translationele complexen uit eukaryote cellen

We bieden schaalbare protocollen voor constructontwerp, voorbijgaande transfectie en expressie en zuivering van volledige menselijke huntingtine-eiwitvarianten in HEK293-cellen.

Efficiënte en schaalbare productie van volledige menselijke huntingtinevarianten in zoogdiercellen met behulp van een transiënt expressiesysteem

Dit protocol beschrijft hoe fumarylacetoacetaat hydrolase domeinbevattend eiwit 1 (FAHD1) uit varkensnier en muizenlever kan worden geëxtraheerd. De vermelde methoden kunnen worden aangepast aan andere eiwitten van belang en worden gewijzigd voor andere weefsels.

Extractie en zuivering van FAHD1-eiwit uit varkensnier en muizenlever

Dit protocol presenteert een robuuste, gedetailleerde methode om zeer zuivere synaptosomen, synaptische blaasjes en andere synaptische fracties uit het muizenbrein te verkrijgen. Deze methode maakt de evaluatie van synaptische processen mogelijk, inclusief de biochemische analyse van eiwitlokalisatie en -functie met compartimentale resolutie.

Subcellulaire fractionering voor de isolatie van synaptische componenten uit het muizenbrein

Leer een fractioneringsmethode voor oplosbare en onoplosbare Huntingtin-eiwitten uit muizenhersenen en celculturen. Deze techniek helpt bij het analyseren van eiwitflux en homeostase bij de ziekte van Huntington.

Fractionering voor oplossing van oplosbare en onoplosbare Huntingtin soorten

Meer video's verkennen