Imaging Intermediaire filamenten en microtubuli met 2-dimensionale directe stochastische optische wederopbouw microscopie
6 maart 2018
Het algemene doel van deze methodiek is geven de optimale proefomstandigheden van monstervoorbereiding Beeldacquisitie en wederopbouw om uit te voeren van 2D dubbele dSTORM kleurenafbeeldingen van microtubuli en intermediaire filamenten in vaste cellen
Het algemene doel van deze methodologie is om de optimale experimentele omstandigheden te creëren, van monstervoorbereiding tot beeldacquisitie en reconstructie, om 2D dual-kleurig D-STORM beeldvorming van microtubuli en intermediaire filamenten in gefixeerde cellen uit te voeren. Deze methode kan helpen bij het karakteriseren van de fysieke interacties tussen dichte en complexe cytoskeletal netwerken zoals intermediaire filamenten en microtubuli. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de observatie van cellulaire structuren mogelijk maakt, die niet worden opgelost met conventionele fluorescentiemicroscopie.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de controle van de monstervoorbereiding en de verwerving van robe-linking gegevens cruciaal is om de generatie van artefacten te beperken. Na het kweken van U373 cellen volgens het tekstprotocol, fixeer de cellen door ze eerst eenmaal te wassen met PBS. Vervolgens, verwijder de PBS en voeg per put een milliliter voorverwarmde extractie fixatieoplossing toe.
Incubeer de cellen gedurende 60 seconden op kamertemperatuur. Vervolgens verwijder de oplossing en voeg per put een milliliter vers bereide en voorverwarmde 4% PFA, verdund in cytoskelet buffer, toe. Plaats de 12-welplate terug in de incubator bij 37 graden Celsius gedurende 10 minuten.
Vervolgens verwijder de PFA en voeg drie milliliters PBS per put toe. Gebruik PBS om de cellen twee keer te wassen. Vervolgens verwijder de PBS en voeg vers bereide 10 millimolaren natriumborohydride, verdund in PBS, toe om de autofluorescentie van het glutaaraldehyde te doven.
Incubeer de cellen gedurende zeven minuten op kamertemperatuur en breng het gerecycleerde natriumborohydride in een specifieke container. Gebruik PBS om de putten drie keer te wassen voor vijf minuten elk. Vervolgens verwijder de PSB en voeg 5% BSA in PBS toe als blokkeringsoplossing.
Na het immunokleuring van monsters en het bereiden van oplossingen in buffers volgens het tekstprotocol, monteer de dekplaat met de gelabelde cellen op een magnetische monsterhouder. En voeg de beeldvormingsbuffer toe om de kamer volledig te vullen. Breng het deksel aan en zorg ervoor dat er geen luchtbellen zijn tussen de beeldvormingsbuffer en het deksel.
Gebruik absoluut ethanol om de bodem van het monster schoon te maken en controleer of er geen lekken zijn. Gebruik indien nodig vet om het monsterhouder goed af te sluiten. Om beeldvorming uit te voeren, zet de microscoop en de acquisitiesoftware aan.
Stel de acquisitieparameters in volgens het tekstprotocol, gebruik de 100-voudige NA 1.46 objectief, de 1.6-voudige Optivar lens en de TIRF UHP modus. Maak een 647 track om de met Alexa Fluor 647 gelabelde vimentin filamenten te beeldvormen. Selecteer de 405 en 642 nanometer laserlijnen en de LP 655 emissiefilter.
Maak vervolgens een 555 track om de met Alexa Fluor 555 gelabelde microtubuli te beeldvormen. Selecteer de 561, 488 en 405 nanometer laserlijnen om de fluoroforen te beeldvormen en de BP 570 tot 650 emissiefilter. Voeg vervolgens olie toe aan het objectief en plaats het monster op de lens.
Selecteer vervolgens het tabblad 'Locate' en open de sluiter van de fluorescentielamp. Zoek het focus en gebruik het oculaire om naar de te beeldvormen cellen te zoeken. Gebruik vervolgens de joystick om de cellen in het midden van het veld te plaatsen.
Klik op het tabblad 'Acquisitie' om naar de acquisitiemodus terug te keren. Selecteer vervolgens de 647 track en stel de 642 laservermogen in op 0,2% en het 405 laservermogen op de minimale waarde. Stel de belichtingstijd in op 50 milliseconden en de versterking op 50.
Kies vervolgens de continue acquisitiemodus om de cel op het scherm te observeren. Zorg ervoor dat er ten minste één fluorescerende parel in het gezichtsveld is. Gebruik een autoschaalmodus voor de weergave en pas de focus aan.
Neem vervolgens een breedveld epifluorescentiebeeld van het vimentin netwerk door op 'Snap' te klikken en sla het beeld op. Om TIRF verlichting te controleren, klik op TIRF, druk op continu, pas de acquisitieparameters aan om een homogeen verlichtingsveld te hebben. Druk vervolgens op 'Snap' en sla het beeld op.
Controleer de 555 track. Schakel de 647 track uit en selecteer de 555 track. Neem een epifluorescentiebeeld van het microtubuli netwerk en sla het op.
Neem vervolgens een TIRF beeld en sla het op. Controleer nu de 647 track. Schakel de 555 track uit en selecteer de 647 track.
Stel de versterking op nul en de belichtingstijd op 10 milliseconden. Druk vervolgens op continu. Stel de 642 nanometer laservermogen in op 100% om de meeste Alexa 647 kleurstoffen naar de donkere staat te pompen.
Zodra de fluoroforen beginnen te knipperen, verhoog de belichting tot 15 milliseconden en de versterking tot 300. Gebruik de bereikindicatormodus om te verifiëren dat enkele molecuulsignalen de camera niet verzadigen, zoals aangegeven door de rode kleur. In dat geval, verlaag de versterking totdat de verzadiging verdwijnt.
De pareltjes blijven aan het begin van de acquisitie verzadigd. Druk op stop om de observatie van de cel te onderbreken. Breid het online verwerkingsgereedschap uit en klik op online verwerking PALM om het STORM beeld tijdens de acquisitie te visualiseren.
Gebruik negen voor de grootte van het piekmasker en zes voor de piekintensiviteit tot ruis. Druk nu op start acquisitie. Tijdens de acquisitie, focus opnieuw op de cel indien nodig.
Pas de belichtingstijd aan en schakel eventueel de 405 nanometer laserlijn aan, beginnend bij 0,001%, om een gemiddelde dichtheid van fluoroforen met een minimale afstand van één micrometer tussen enkele moleculen te behouden. Zorg ervoor dat de piek van lokalisatieprecisie op de histogram onder het gereconstrueerde beeld, gecentreerd is rond of onder de 10 nanometer. Druk op stop om de film te beëindigen wanneer meer dan een miljoen
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze methodologie is erop gericht om optimale experimentele condities vast te stellen voor 2D dual-colored dSTORM-imaging van microtubuli en intermediaire filamenten in gefixeerde cellen. Het verbetert de karakterisering van cytoskeletnetwerken, die vaak onvoldoende opgelost worden door conventionele fluorescentiemicroscopie.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Beeldvormingstechnieken
Achtergrond
- D-STORM-imaging biedt een hoge resolutie visualisatie van cellulaire structuren.
- Microtubuli en intermediaire filamenten zijn kritieke componenten van het cytoskelet.
- Conventionele fluorescentiemicroscopie kan complexe interacties in deze netwerken mogelijk niet onderscheiden.
- Monstervoorbereiding en data-acquisitie zijn cruciaal om artefacten te minimaliseren.
Doel van de studie
- Om de condities voor het imagen van microtubuli en intermediaire filamenten te optimaliseren.
- Om het begrip van cytoskeletale interacties te verbeteren.
- Om een visuele demonstratie van de methodologie te bieden.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van U373-cellen volgens een specifiek protocol.
- Wassen van cellen met PBS vóór fixatie.
- Gebruik van een voorverwarmde extractie-fixatieoplossing voor cel-fixatie.
- Acquisitie van dSTORM-beelden om cytoskeletstructuren te analyseren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle beeldvorming van microtubuli en intermediaire filamenten.
- Verbeterde resolutie van cellulaire structuren in vergelijking met conventionele methoden.
- Aantoonbare controle over monstervoorbereiding en gegevensacquisitie.
- Karakterisering van interacties binnen cytoskeletale netwerken.
Conclusies
- De methodologie biedt een robuuste aanpak voor het bestuderen van cytoskeletale dynamiek.
- Het benadrukt het belang van een zorgvuldige monstervoorbereiding.
- Toekomstige toepassingen kunnen het onderzoeken van andere cellulaire structuren omvatten.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Het in kaart brengen van dichte cytoskeletale netwerken, zoals intermediaire filamenten en microtubuli, is essentieel voor het begrijpen van gecoördineerde cellulaire functies in ziektemodellen. Dual-color dSTORM-imaging biedt nanoschaalresolutie om fysieke associaties tussen deze netwerken te visualiseren, wat mechanistische risicoanalyse mogelijk maakt voor targets die betrokken zijn bij de regulatie van het cytoskelet. Deze capaciteit ondersteunt targetvalidatie en assayontwikkeling door structurele afhankelijkheden bloot te leggen die de cellulaire mobiliteit, polariteit en intracellulair transport beïnvloeden—sleutelphenotypes in neurodegeneratief onderzoek en kankeronderzoek.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen te onderzoeken door directe associaties tussen intermediaire filamenten en microtubuli te visualiseren met een resolutie van <10 nm.
- Operationele waarde: Levert kwantitatieve gegevens over filamentbundeling en netwerkdichtheid ter ondersteuning van functionele targetvalidatie.
- Predictieve waarde: Verduidelijkt mechanistische verbanden tussen cytoskeletcomponenten, waardoor ambiguïteit bij de interpretatie van signaalpaden tijdens targetselectie wordt verminderd.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde beeldgegevens met een hoge resolutie die geschikt zijn voor assay-benchmarking in screens naar cytoskeletmodulatoren.
- Operationele waarde: Stelt reproduceerbare protocollen vast voor dual-color dSTORM-acquisitie en reconstructie, waardoor consistentie tussen laboratoria mogelijk wordt.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt hergebruik van het platform voor verschillende cellijnen en eiwitdoelen wanneer de fixatie- en labelingscondities worden aangepast.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Translationele Continuïteit: Verbindt cytoskeletale organisatie op nanoschaal met cellulaire fenotypes die relevant zijn voor ziektemodellen, zoals gliale celactivatie of neuronale integriteit.
- Mechanistische Risicoreductie: Verduidelijkt hoe vimentine-intermediaire filamenten de organisatie van microtubuli sturen en stabiliseren, wat bijdraagt aan predictieve modellen van defecten in het vesiculair transport.
- Relevantie voor Preklinische Modellen: Maakt gebruik van U373 gliale cellen — een ziekterelevant systeem voor het bestuderen van neuro-inflammatie en gliomaprogressie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van target-hypothesetoetsing tot lead-identificatie, waarbij cytoskeletintegriteit dient als fenotypische uitlezing voor de effecten van verbindingen op de celstructuur en -functie.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing door vast te stellen of verbindingen de co-organisatie van intermediaire filamenten en microtubuli verstoren of stabiliseren.
- Screening: Maakt assay-gereidheid mogelijk via kwantificeerbare output, zoals lokalisatiedichtheid (>5.000/µm² voor vimentine, >2.500/µm² voor microtubuli) en bundelresolutie.
- Analytics: Biedt precisiemetingen van filamentafstand en co-lokalisatie, waardoor teams structurele fenotypes onder verschillende condities kunnen vergelijken.
- Translationeel Onderzoek: Koppelt beeldvorming op nanoschaal aan microtubuli-afhankelijke processen zoals vesiculair transport, wat relevant is voor de ontwikkeling van neurotherapeutica.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbare superresolutie-beeldvormingscapaciteit voor het bestuderen van elk eiwitpaar in het cytoskelet wanneer deze gelabeld zijn met compatibele fluoroforen.
Operationele en organisatorische impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in doelvalidatie door cytoskeletale interacties op nanoschaal op te lossen die onzichtbaar zijn voor conventionele microscopie.
- Operationele waarde: Levert standaardisatie via vaste acquisitieparameters (bijv. 642 nm laser op 0,2% voor activatie, 100% voor depletie) en reconstructiedrempels (lokalisatieprecisie <10 nm).
- Strategische waarde: Vermindert het biologische risico in een laat stadium door vroege detectie van cytoskeletale dysregulatie in preklinische modellen mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Informeert risico-gecorrigeerde beslissingen over verdere ontwikkeling door structureel bewijs te leveren van target engagement in cytoskeletale pathways.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in superresolutie-microscopie, immunokleuring en optische uitlijning van TIRF/HILO.
- Afhankelijk van gespecialiseerde instrumentatie, waaronder een 100x NA 1,46 objectief, Optivar-lens en laserlijnen op 405, 488, 561 en 642 nm.
- Noodzaak tot standaardisatie van fixatieprotocollen tussen teams (bijv. PFA-concentratie, quenching met natriumborhydride) om autofluorescentie te minimaliseren en de integriteit van epitopen te behouden.
- Vereist aanpassing van de labeldichtheid en laservermogen bij het targeten van verschillende eiwitten, zoals aangetoond door de verschillende instellingen voor Alexa 647 versus Alexa 555.
- Beperkt door de noodzaak van vers bereide oplossingen en strikte omgevingscontroles om drift te voorkomen en single-molecule blinking-gedrag te garanderen.
