Name: Methode voor het efficiënt uiteinde en zuivering van de Chemoreceptor-Ligand bindend domein (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 25 s
Description: Leer hoe je het ligandbindende domein van de Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 uit insluitlichamen heropvouwt en zuivert. Deze methode levert milligrammen functioneel eiwit voor structurele studies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Yu C. Liu voor zijn vroege werk over de Tlp3-LBD productie. Mayra A. Machuca is dank verschuldigd aan Departamento Admistrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación COLCIENCIAS voor een doctoraal beurs.

1. weergave van zijn6-Tlp3-LBD bij E. coli
<ol><li>Inoculeer 150 mL steriele Luria Bertani (LB) bouillon met 50 µg mL-1 ampicilline met BL21-Codon-Plus (DE3) - RIPL cellen getransformeerd met de pET151/D-TOPO vector voor de uitdrukking van zijn6- Tlp3-LBD (aminozuurresidu's 42-291), en het bij 37 ° C in een shaker (orbit diameter, 25 mm) met 200 t/min na een nacht bebroeden.</li>
	<li>Bereiden van zes 2 L conische kolven met 800 mL steriele de pond-Bouillon en 50 µg mL-1 ampicilline. Inoculeer elke kolf met 20 mL van de overnachting cultuur stap 1.1 verkregen. Incubeer hen bij 37 ° C met continue schudden bij 200 rpm tot de optische dichtheid op 600 nm uithoeken 0.6.</li>
	<li>Neem een 1 mL aliquoot van één van de kolven (uninduced controlemonster), pellet met behulp van een benchtop centrifuge (13.000 x g, 4 ° C, 10 min) en de vloeistof wordt weggeworpen. De bacteriële pellet bij-20 ° C voor latere analyse van de SDS-pagina worden opgeslagen.</li>
	<li>Induceren eiwit expressie door 1 mM van isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) toe te voegen aan elke maatkolf met cultuur. Blijven de kolven bij 37 ° C in een shaker bij 200 t/min voor een extra 4 h aan het broeden.</li>
	<li>Oogst van de cellen door centrifugeren bij 5.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C en de vloeistof wordt weggeworpen. Opmerking: op dit punt, de procedure kan worden onderbroken door het plaatsen van de cel pellet in een vriezer-80 ° C voor opslag.</li>
</ol>2. isolatie en denaturatie van integratie-organen
<ol><li>Overdracht van al de cel korrels verkregen uit stap 1.5 naar een bekerglas van 250 mL en voeg 100 mL buffer A (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl). De cellen te ontdooien volledig (indien bevroren) toestaan en resuspendeer de pellet. Houd het monster op ijs, tenzij anders aangegeven.</li>
	<li>Doorgeven van de geresuspendeerde cellen tot een hogedruk homogenisator driemaal lyse de cellen en zorgen voor volledige schuintrekken van genomic DNA.</li>
	<li>Centrifugeer het lysate bij 10.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C. Een monster van 1 mL van het supernatans (oplosbare fractie) verzamelen en opslaan bij-20 ° C voor latere analyse van de SDS-pagina. Gooi de rest van het supernatant en plaats de pellet op ijs. Opmerking: Deze pellet is wit van kleur (gemakkelijk te onderscheiden van ongebroken cellen die de schaduw van bruin in kleur) en integratie instanties bevat.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet opneming organen grondig in 20 mL ijskoud buffer B (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,2 mM phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF), 1% Triton X-100). Dit vergemakkelijkt het oplossen van het membraan en membraaneiwitten. Vortex voor 1-2 min op steun resuspensie.</li>
	<li>Centrifugeer het monster bij 10.000 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C en de vloeistof wordt weggeworpen.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet grondig in 20 mL ijskoud buffer B door vortexing de buis voor de 1-2 min. Zorg ervoor dat de pellet is onderverdeeld in kleine stukjes. Pipetteer het monster op en neer op de steun van de pellet resuspensie. Opmerking: Het is belangrijk dat resuspendeer de pellet grondig met het oog op opneming organen vrij van onzuiverheden.</li>
	<li>Herhaal stap 2.5. Als de bovendrijvende vloeistof troebel of gekleurd is, herhaal stap 2.6 en 2.5 (in die volgorde) totdat het supernatans is helder en kleurloos.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 20 mL ijskoud buffer C (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,2 mM PMSF) door vortexing de buis gedurende 1-2 minuten.</li>
	<li>Herhaal stap 2.5.</li>
	<li>Voeg 25 mL ijskoud denatureren buffer D (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 8 M ureum, van 10 mM dithiothreitol (DTT), 0,2 mM PMSF) te ontbinden de opneming organen-pellet. Resuspendeer grondig door vortexing gedurende 1-2 minuten, of totdat de pellet is onderverdeeld in kleine stukjes.</li>
	<li>Mix de schorsing door axiale rotatie met een snelheid van de rotatie van 30 rpm gedurende 30-120 minuten bij 4 ° C.</li>
	<li>Verduidelijken de gedenatureerde proteïne oplossing door centrifugatie bij 30.000 x g, 4 ° C gedurende 30 minuten, plaatst u het supernatant op ijs en negeren de pellet.</li>
	<li>Meet de eiwitconcentratie met behulp van de analyse van Bradford. 24 Neem een aliquoot gedeelte voor SDS-gel analyse en plaats het bij-20 ° C. Opmerking: op dit punt, de procedure kan worden onderbroken door module-diepvriezen het aliquoted monster in vloeibare stikstof en bewaar deze bij-80 ° C voor opslag.</li>
</ol>3. eiwit uiteinde
<ol><li>Bereiden van 250 mL buffer E (3 M ureum, 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.4 M L-arginine monohydrochloride, 20 mM verlaagd L-glutathione, 2 mM geoxideerde L-glutathion) in een bekerglas van 500 mL en cool de buffer tot 4 ° C.</li>
	<li>Toevoegen van 60 mg gedenatureerde proteïne mix met zijn6-Tlp3-LBD verkregen in stap 2.13 tot 250 mL buffer E, terwijl de buffer roeren bij 500 omwentelingen per minuut. Incubeer de refolding mix bij 4 ° C met continue roeren bij 500 omwentelingen per minuut gedurende 24-48 uur. In deze stap de laatste eiwitconcentratie is 0,2 mg mL-1.</li>
	<li>7 L voor buffer A in een 8-10 L emmer voor te bereiden en afkoelen tot 4 ° C in voorbereiding voor de volgende stap (stap 3.4), die in de 24-48 h plaatsvinden zal (Zie het stroomdiagram in Figuur 1).</li>
	<li>Dompel een ~ 50 cm stuk van dialyse buis 28 mm opgeblazen diameter, met molecuulgewicht licht-donkerscheiding op 12-14 kDa in 200 mL 10 mM ethyleendiamminetetra zuur Dinatrium zout (EDTA-Na2) en het over een gasvlam verhit tot koken. Spoel het membraan van de dialyse met 200 mL van ddH2O.</li>
	<li>Ene uiteinde van het membraan van de dialyse met een sluiting dialyse slang klem en breng de 250 mL uiteinde mengsel in stap 3.2 in de dialyse-buis verkregen. Sluit het open einde met een andere klem. Controleer de integriteit van het membraan om ervoor te zorgen dat er geen lekken zijn.</li>
	<li>Plaats de buis dialyse in een emmer van de dialyse met de vooraf gekoelde 7 L van buffer A bereid in stap 3.3. Plaats een magnetische roer bar, ervoor te zorgen dat het niet de dialyse-buis tijdens het roeren raken zal.</li>
	<li>Dialyse het monster bij 4 ° C met aanhoudende roeren bij 500 t/min en wijzigen van de buffer minstens vier maal een periode van 12 h. Na de laatste wijziging van de buffer, laat het monster om 's nachts dialyse. Opmerking: Tijdens de dialyse, de overmaat van ureum (~-3 M) is geleidelijk aan verwijderd uit de gedenatureerde proteïne-oplossing, waarmee het eiwit te refold. Zware eiwit neerslag waarneembaar aan het einde van de dialyse.</li>
	<li>Verwijder de dialyse-buis uit de emmer en breng de inhoud in een bekerglas van 500 mL. Bewaar de oplossing van de eiwitten op het ijs, tenzij anders aangegeven.</li>
	<li>Filtreer de oplossing van de eiwitten door middel van een 0,43 µm membraan voor de grootte van de poriën in een 500 mL glazen fles te verwijderen elke neergeslagen eiwitten.</li>
</ol>4. zuivering van zijn6-gelabeld eiwit met behulp van de chromatografie van de affiniteit van de geïmmobiliseerde metaalion
<ol><li>
Opladen en equilibreer een voorverpakte chelaatvormers kolom 5 mL.
	<ol>
<li>De kolom verbinden met een peristaltische pomp, om ervoor te zorgen dat er geen lucht gevangen in de aansluitende buis.</li>
		<li>Was de kolom door het passeren van 25-50 mL ddH2O.</li>
		<li>De kolom kosten door 3 mL 0,1 M NiCl2 laden en vervolgens passeren 25 mL ddH2O.</li>
		<li>De kolom met 25 mL buffer F (laden buffer, 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol) equilibreer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pas de refolded eiwitSteekproef in stap 3.9 aan de samenstelling van buffer F verkregen door toevoeging van 2.5 mL 1 M Tris-HCl pH 8.0, 25 mL 5 M NaCl en 2,5 mL 2 M imidazool stamoplossingen.</li>
	<li>Het laden van het monster op de kolom op een tarief van 5 mL/min of minder en negeren de doorstroming (niet-afhankelijke eiwitten).</li>
	<li>Was de kolom met 50-100 mL buffer F verwijderen niet-specifiek afhankelijke eiwitten en negeren de doorstroming.</li>
	<li>Elueer zijn6-Tlp3-LBD met 25 mL buffer G (elutie buffer, 20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 500 mM imidazol) en zwembad de doorstroming breuken die de eiwitten (zoals bepaald met behulp van het reagens Bradford) bevatten.</li>
	<li>Het meten van de eiwitconcentratie in de gepoolde monster met behulp van de analyse van Bradford. Neem een kleine hoeveelheid voor SDS-pagina analyse en plaats bij-20 ° C.</li>
</ol>5. zijn6-label verwijderen met behulp van TEV Protease (optioneel)
<ol><li>Bereiden en koelen tot 4 ° C, 4 L van buffer H (TEV decollete buffer, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% (v/v) glycerol, 2 mM DTT).</li>
	<li>Snijden van ongeveer 5-7 cm van dialyse leidingen (diameter 2-3 cm) en dompel het in 200 mL ddH2O.</li>
	<li>Toevoegen van zijn6-gelabeld TEV protease aan het zijn6-label eiwit bereid in stap 4.5 naar een definitieve molaire verhouding 1 TEV: 8 eiwit.</li>
	<li>Één uiteinde van de buis met een sluiting dialyse slang klem en vul deze met het mengsel van eiwit/TEV protease. Sluit het andere uiteinde, en zorg dat er geen lekken.</li>
	<li>Plaats de dialyse buisvideo in de vooraf gekoelde 4 L van buffer H (uit stap 5.1) en Incubeer het bij 4 ° C met continue roeren gedurende 2 h. verandering de buffer en dialyse 's nachts blijven toestaan dat de reactie van de TEV-gemedieerde decolleté te voltooien.</li>
	<li>In de tussentijd bereiden en koel van (4 ° C) 4 L van buffer ik (10 mM Tris-HCl pH 8.0, van 150 mM NaCl, 1% (v/v) glycerol) ter voorbereiding van de volgende dag.</li>
	<li>Na de overnachting dialyse, wisselen de buffer aan buffer die ik bereid in stap 5.6 en dialyse voor een verdere h 1-2 bij 4 ° C.</li>
	<li>Verwijderen van de buis van de dialyse-emmer, unclip één uiteinde van de buis en breng de eiwit-oplossing over in een 50 mL Falcon buis. Filtreer de oplossing door een 0,43 µm porie grootte spuit filter en bewaar deze op het ijs, tenzij anders vermeld.</li>
	<li>Meten van de hoeveelheid van het monster en de Tris, NaCl en imidazol concentratie op de samenstelling van buffer F aan te passen (b.v. voor 25 mL van eiwit oplossing in buffer J 0,25 mL 1 M Tris-HCl pH 8.0, 1,75 mL 5 M NaCl en 0,25 mL 2 M imidazool toevoegen).</li>
	<li>Bereid een 5 mL HiTrap chelaat HP kolom zoals beschreven in stap 4.1.</li>
	<li>Laden van het monster op de kolom (debiet: 5 mL/min) en het verzamelen van de doorstroming, waarin de niet-gecodeerde Tlp3-LBD (residuen 42-291). Uncleaved eiwit, het gekloofd zijn6-label en zijn6- TEV worden bewaard door de kolom.</li>
	<li>Was de kolom met 5 mL buffer F (laden buffer) zodat alle niet-gecodeerde eiwit doorstromen en verzamelen van het eluaat.</li>
	<li>Zwembad het eluaat verkregen in stappen 5.11 en 5.12 en meten van de eiwitconcentratie. Neem een kleine hoeveelheid en opslaan bij-20 ° C voor analyse van de SDS-pagina.</li>
</ol>6. size-exclusion Chromatography (Gel filtratie) van Tlp3-LBD
<ol><li>Bereiden 1 L voor buffer A (10 mM Tris-HCl pH 8.0, van 150 mM NaCl) en filteren met behulp van een membraan 0,43 µm.</li>
	<li>Equilibreer een kolom grootte-uitsluiting 26/60 met buffer A een snelheid van 4 mL/min.</li>
	<li>Concentreren de eiwitSteekproef verkregen in stap 5.13 met een volume van 3-4 mL, 15 mL centrifugaal concentrator met een 10 kDa cut-off (4 ° C, 4000 x g).</li>
	<li>Verduidelijken de eiwit-oplossing door centrifugatie bij 13.000 x g, 4 ° C gedurende 30 minuten te verwijderen elke neergeslagen eiwitten.</li>
	<li>Het laden van het monster op de vooraf equilibrated 26/60 gel filtratie kolom. Chromatografie in buffer A op een debiet van 4 mL/min. Monitor de UV-trace uitvoeren. Tlp3-LBD GC op een retentievolume van 210-220 mL. Zwembad de piek breuken.</li>
	<li>Meet de eiwitconcentratie. Nemen een kleine hoeveelheid voor SDS-pagina-analyse.</li>
</ol>7. SDS-pagina analyse van monsters verzameld in verschillende stadia van eiwitreiniging
<ol><li>1 L voor SDS-pagina lopende buffer (buffer J) voor te bereiden, met 25 mM Tris, 250 mM glycine pH 8.3 en 0,1% (g/v) natrium dodecyl sulfaat (SDS).</li>
	<li>Voorbereiden van 10 mL 5 x SDS-pagina laden buffer (buffer K), bevattende 0,25 M Tris-HCl pH 6.8, 10% (m/v) SDS, 50% (v/v) glycerol, 1 mM DTT en 0,05% bromophenol blauw.</li>
	<li>De aliquots verzameld tijdens de verschillende stappen van de zuivering toestaan (stappen 1.3, 2.3, 2.13, 4.6, 5.13, 6.6) te ontdooien.</li>
	<li>Voor elk monster, meng het volume dat overeenkomt met 15 µg totaal eiwit met 2 µL van 5 x SDS-pagina laden van de buffer, en pas het volume aan 10 µL met ddH2O.</li>
	<li>Verwarm de monsters bij 95 ° C gedurende 5-10 min, draai ze bij 10.000 x g gedurende 30 s en overdracht de monsters in een schone buis.</li>
	<li>Bereiden van een SDS-pagina gel, met behulp van 15% polyacrylamide scheiden gel (voor 5 mL: 2,5 mL 30% (g/v) bis-acrylamide, 1,2 mL 1.5 M Tris-HCl pH 8,8, 1,2 mL ddH2O, 50 µL 10% (m/v) SDS, 50 µL ammoniumnitraat van 20% (m/v) persulfate (APS), 3 µL tetramethylethylenediamine (TEMED) en 5% polyacrylamide stapelen van gel (voor 2 mL: 340 µL 30% (g/v) bis-acrylamide, 250 µL 1 M Tris pH 6.8, 1.37 mL ddH2O, 20 µL 10% (m/v) SDS, 20 µL 20% (m/v) APS, 2 µL TEMED).</li>
	<li>Monteren van de Elektroforese van het apparaat en vul deze met 1 x SDS-pagina uitgevoerd buffer volgens de aanbeveling van de fabrikant.</li>
	<li>Een eiwit molecuulgewicht marker en de monsters bereid in stap 7.5 laden. Voer de Elektroforese bij een constante stroom van 25 mA.</li>
	<li>Breng de gel in een container en spoel het na met ddH2O. toevoegen 150 mL van de Coomassie Blue kleurstofoplossing met 25% (v/v) isopropanol, 10% (v/v) azijnzuur en 0,03% (m/v) briljant blauw R-250. Plaats de container op een horizontale rotatie platform gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Spoel de gel met ddH2O en plaats in de destaining oplossing met 5% (v/v) methanol en 7% (v/v) azijnzuur. Destain tijdens het mixen met behulp van een horizontale rotatie platform voor 1 h.</li>
	<li>Beeld van de gel en analyseren.</li>
</ol>8. circulair dichroïsme (CD) spectroscopie analyse van secundaire structuur van refolded Pure eiwitten
<ol><li>Overdracht van 0,5 - 1 mg refolded eiwit verkregen in stap 6.6 in een buis van dialyse en plaats deze in een emmer van de dialyse met 5 L buffer L (50 mM natriumfosfaat pH 7.4), precooled tot 4 ° C. Dialyse het monster bij 4 ° C met continue roeren en het uitvoeren van ten minste 3-4 buffer wijzigingen meer dan 2-4 uur voor vertrek van de steekproef om 's nachts dialyse.</li>
	<li>De oplossing van de dialysed eiwitten voor 0.06 mg mL-1 met behulp van een 10 kDa cut-off centrifugaal concentrator concentreren.</li>
	<li>Verhelder de oplossing door centrifugatie bij 13.000 x g, 4 ° C gedurende 30 minuten.</li>
	<li>Het opnemen van de ver-UV-CD spectrum van het monster bij 25 ° C op een golflengtebereik van 200-260 nm met behulp van een spectropolarimeter met een scanfrequentie van 20 nm min-1. Gebruik de dialyse-buffer als een blanco-controle. Opname in drievoud herhalen en de gemiddelde spectrum te genereren.</li>
	<li>Bereken de inhoud van de secundaire structuur door de deconvoluting van de CD sever spectra met behulp van het programma van de CDSSTR van de DichroWeb25 (http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Een eenvoudige procedure voor expressie en het uiteinde van de organen van de opneming van de periplasmatische LBD van de bacteriële chemoreceptor Tlp3 wordt gepresenteerd. Voorbereiding van het pure eiwit gaat om overmatige expressie van het huisdier-plasmide-gecodeerde gen in E. coli, zuivering en oplossen van integratie-organen, uiteinde van de gedenatureerde proteïne en haar zuivering door de opeenvolgende affiniteit en grootte-uitsluiting chromatografie stappen. De ureum-vergemakkelijkt denaturatie- en verd...

Chemotaxis en motiliteit is aangetoond dat een belangrijke rol spelen in de pathogenese van Campylobacter jejuni door bacteriële kolonisatie en invasie van de host1,2,3te bevorderen. Chemotaxis kan bacteriën toewerken naar een optimale omgeving voor de groei, als geleid door chemische signalen. Dit proces omvat erkenning van intracellulaire en milieu chemische signalen door een aantal eiwitten genoemd chemoreceptors of transducer-achtige eiwitten (Tlps). De meeste chemoreceptors zijn membraan-embedded eiwitten met een extracytoplasmic ligand bindend domein (LBD), een transmembraan domein en een cytoplasmatische seingeving domein, de laatste van die samenwerkt met de cytosolische signalering eiwitten die het signaal zenden motoren aan de flagellar4,5,6,7.
Elf verschillende chemoreceptors er zijn geïdentificeerd in de C. jejuni genoom4,8. Tot op heden, slechts enkele van deze chemoreceptors hebben gekenmerkt en de specificiteit van de ligand van Tlp19, Tlp310,11, Tlp411, Tlp712, en Tlp11-13 is bekend. Identificatie van de natuurlijke liganden van de resterende chemoreceptors in deze soort, en talrijke chemoreceptors in andere bacteriën, kan sterk worden vereenvoudigd door de productie van gevouwen en zeer zuiver recombinante chemoreceptor LBDs14, 15 , 16. uitspreken geïnfecteerd periplasmische LBDs van bacteriële chemoreceptors in Escherichia coli vaak resulteren in hun doelgerichtheid in de integratie-organen17,18,19 . Niettemin, dit fenomeen kan vergemakkelijken eenvoudig isolatie en herstel van het eiwit in de hand. Hier wordt een methode gepresenteerd voor de terugwinning van het eiwit van integratie-organen, haar uiteinde en zuivering, met behulp van de periplasmatische LBD van de C. jejuni chemoreceptor Tlp3 als voorbeeld. In het volgende voorbeeld werd gekozen omdat Tlp3-LBD behoort tot de dCACHE familie20 van teledetectie domeinen die overvloedig in tweecomponenten histidine kinases en chemoreceptors in prokaryoten20,21, gevonden zijn 22 , 23.
In deze benadering de constructie voor de expressie, op basis van een pET151/D-TOPO vector, is ontworpen om het nemen van een N-terminal zijn-6-label, gevolgd door een tabak etch virus (TEV) protease breukzijde, voor latere tag verwijdering19. Het protocol beschrijft eiwit overexpressie in E. coli, isolatie en ureum-gemedieerde oplossen van integratie-organen en eiwit uiteinde van ureum uitputting. Volgende uiteinde, het monster wordt gezuiverd door de chromatografie van de affiniteit, met optionele tag verwijderen en grootte-uitsluiting chromatografie. De gevouwen staat van het gezuiverde eiwit wordt bevestigd met behulp van circulair dichroïsme spectroscopie. Dit is een gewijzigde versie van de methode die eerder is ontwikkeld om te herstellen en zuiveren van de LBD van een verschillende chemoreceptor, Helicobacter pylori TlpC19. Deze procedure, samengevat in Figuur 1, levert 10-20 mg zuivere, niet-gecodeerde Tlp3-LBD per 1 liter van bacteriële cultuur, met een zuiverheid van de proteïnen van > 90% zoals geraamd door SDS-PAGE.

<table><tbody><tr><td>Tris base</td><td>AMRESCO</td><td>497</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride (NaCl)</td><td>MERK MILLIPORE</td><td>1064041000</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>G-BIOSCIENCES</td><td>A051-B</td><td></td></tr><tr><td>Fenylmethaansulfonylfluoride (PMSF)</td><td>MERCK</td><td>52332</td><td></td></tr><tr><td>Triton x-100</td><td>AMRESCO</td><td>694</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG)</td><td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td><td>AST0487</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>AMRESCO</td><td>VWRC0568</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td><td>C-1029</td><td></td></tr><tr><td>L-arginine monohydrochloride</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>A5131</td><td></td></tr><tr><td>Gereduceerd L-glutathione</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>Geoxideerd L-glutathione</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G4376</td><td></td></tr><tr><td>Dinatriumfosfaat dibasisch (Na2HPO4)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Mononatriumfosfaat (NaH2PO4)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>10049-21-5</td><td></td></tr><tr><td>Ethyleendiaminetetraazijnzuur dinatriumzout dihydraat (EDTA)</td><td>AMRESCO</td><td>VWRC20302.260</td><td></td></tr><tr><td>Imidazool</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>ASTRAL SCIENTIFIC PTY LTD</td><td>BIOGB0232</td><td></td></tr><tr><td>Nikkelchloride (NiCl2)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>339350</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>AMRESCO</td><td>VWRC0167</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfaat (SDS)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>Ongekleurde proteïne ladder, breed bereik (10-250 kDa)</td><td>NEW ENGLAND BIOLABS</td><td>P7703</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultracel centrifugaal concentrator (Millipore)</td><td>MERCK</td><td>UFC901096</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Falcon buis</td><td>FALCON</td><td>BDAA352070</td><td></td></tr><tr><td>Dialyseslang</td><td>LIVINGSTONE INTERNATIONAL PTY</td><td>Dialyse</td><td></td></tr><tr><td>Snakeskin dialyseslang</td><td>THERMO SCIENTIFIC&trade;</td><td>68100</td><td></td></tr><tr><td>Vooraf gepakte HiTrap Chelating HP kolom</td><td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td><td>17-0408-01</td><td></td></tr><tr><td>EmulsiFlex-C5 hogedruk homogenisator</td><td>AVESTIN</td><td>EmulsiFlex&trade; - C5</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltiekpomp P-1</td><td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td><td>18-1110-91</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 HiLoad 26/60 grootte-exclusiekolom</td><td>GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES</td><td>28989336</td><td></td></tr><tr><td>JASCO J-815 spectropolarimeter</td><td>JASCO</td><td>J-815</td><td></td></tr></tbody></table>

methode voor het efficiënt uiteinde en zuivering van de chemoreceptor-ligand bindend domein

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identificatie van de natuurlijke liganden van chemoreceptors en structurele studies gericht op opheldering van de moleculaire basis van de specificiteit van het ligand kan sterk worden vereenvoudigd door de productie van milligram bedragen van pure, gevouwen ligand bindende domeinen. Misbruik van geïnfecteerd express periplasmische ligand bindende domeinen van bacteriële chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) vaak resulteren in hun gericht op integratie-organen. Hier wordt een methode gepresenteerd voor de terugwinning van het eiwit van opneming organen, haar uiteinde en zuivering, met behulp van de periplasmatische dCACHE ligand bindend domein van Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 als voorbeeld. De aanpak omvat uitdrukking van de proteïne van belang met een cleavable zijn6-tag, isolatie en ureum-gemedieerde oplossen van integratie-organen, eiwit uiteinde door ureum uitputting en zuivering door middel van de chromatografie van de affiniteit, gevolgd door tag verwijderen en grootte-uitsluiting chromatografie. De circulair dichroïsme spectroscopie wordt gebruikt voor het bevestigen van de gevouwen staat voor het pure eiwit. Het is aangetoond dat dit protocol in het algemeen nuttig voor productie van milligram bedragen van dCACHE periplasmische ligand bindende domeinen van andere bacteriële chemoreceptors in de vorm van een oplosbare en crystallisable is.

Recombinante uitdrukking van zijn6-Tlp3-LBD bij E. coli resulteerde in eiwit depositie in integratie-organen. De opbrengst van de expressie van 1 L van bacteriecultuur berekend in stap 2.13 was ongeveer 100 mg zijn6-Tlp3-LBD gestort in integratie-organen. De eiwit isolatie procedure, die hier worden beschreven en geïllustreerd in Figuur 1, bestaat uit het oplossen van opneming en eiwit uiteinde en zuivering, door middel van de c...

Een procedure wordt gepresenteerd voor het uiteinde van de dCACHE periplasmische ligand bindend domein van Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 van integratie-organen en de zuivering aan opbrengst milligram hoeveelheden eiwit.

Methode voor het efficiënt uiteinde en zuivering van de Chemoreceptor-Ligand bindend domein

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Het algemene doel van deze procedure is om een chemoreceptor-ligandbindingsdomein uit inclusielichamen opnieuw te vouwen en het te zuiveren voor gebruik in structurele en functionele studies. Om vast te stellen welke signalen een bacteriële chemoreceptor verzendt en hoe, kan men de geïsoleerde ligandbindingsdomeinen gebruiken om te screenen tegen kleine molecuulbibliotheken of om de structuur met en zonder ligand te bepalen. Expressie van extracellulair ligandbindingsdomein in E.coli leidt vaak tot afzetting in inclusielichamen.Hier laten we zien hoe milligram hoeveelheden functioneel eiwit kunnen worden teruggewonnen uit de inclusielichamen. Om te beginnen, inoculeer 150 mL steriele LB-bouillon met 50 microgram per mL ampicilline met BL21-CodonPlus RIPL cellen getransformeerd met de pET151 D-TOPO vector voor expressie van hexahistidine TIp3-LBD. Incubeer de cultuur bij 200 RPM en 37 graden Celsius overnacht.Bereid zes 2L Erlenmeyer kolven met 800 mL steriele LB-bouillon en 50 microgram per mL ampicilline. Inoculeer elke kolf met 20 mL van de overnachtelijke cultuur. Incubeer de kolven bij 37 graden Celsius met continu schudden bij 200 RPM tot de OD600 0,6 bereikt.Op dit punt induceert u de eiwitexpressie door 1 millimolair IPTG aan elke kolf toe te voegen. Blijf de kolven incuberen bij 37 graden Celsius in een schudder bij 200 RPM gedurende nog eens vier uur. Oogst de cellen door centrifugatie bij 5000 xg en vier graden Celsius gedurende 15 minuten.Gooi vervolgens de supernatant weg. Breng alle cellenpellets over in een 250 mL beker en voeg 100 mL Buffer A toe. Als ze bevroren zijn, laat de cellen dan volledig ontdooien en resuspendeer vervolgens het pellet. Houd het monster op ijs, tenzij anders aangegeven.Passeer vervolgens de gesuspendeerde cellen drie keer door een hogedrukhomogenisator om de cellen te lyzeren en volledige scheuring van het genomische DNA te garanderen. Centrifugeer vervolgens het lysaat bij 10.000 xg en vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Verzamel een 1 mL monster van de supernatant en bewaar het bij min 20 graden Celsius voor latere SDS-PAGE-analyse.Gooi vervolgens de rest van de supernatant weg en plaats het pellet op ijs. Resuspendeer vervolgens de inclusielichamenpellet grondig in 20 mL ijskoud Buffer B. Dit vergemakkelijkt de solubilisatie van de membraan- en membraaneiwitten. Vortex het monster gedurende een tot twee minuten om de resuspendering te bevorderen.Na centrifugatie van het monster resuspendeert u het pellet opnieuw grondig in 20 mL ijskoud Buffer B door eerst de buis gedurende een tot twee minuten te vortexen. Zorg ervoor dat het pellet in kleine stukken is gebroken. Pipet vervolgens het monster op en neer om het te resuspenderen.Centrifugeer het monster zoals eerder en gooi de supernatant weg. Als de supernatant troebel of gekleurd is, centrifugeer het monster opnieuw en gebruik aanvullend ijskoud Buffer B om het te resuspenderen. Herhaal de centrifugatie en resuspendering totdat de supernatant helder en kleurloos is voordat u het opnieuw pellet.Voeg 20 mL ijskoud Buffer C toe aan het pellet en resuspendeer het door de buis gedurende een tot twee minuten te vortexen. Voeg vervolgens, na het draaien van het monster, 25 mL ijskoud denaturerend Buffer D toe. Resuspendeer het inclusielichamenpellet grondig door de buis gedurende een tot twee minuten te vortexen of totdat het pellet in kleine stukken is gebroken. Meng de suspensie door axiale rotatie bij 30 RPM en 4 graden Celsius gedurende 30 tot 120 minuten.Verduidelijk de gedenatureerde eiwitoplossing door centrifugatie bij 30.000 xg en vier graden Celsius gedurende 30 minuten. Plaats vervolgens de supernatant op ijs en gooi de pellet weg. Terwijl u 250 mL Buffer E roert bij 500 RPM, voegt u 60 milligram gedenatureerd eiwitmengsel toe dat hexahistadine TIp3-LBD bevat.Incubeer het hervouwende mengsel bij vier graden Celsius met continu roeren bij 500 RPM gedurende 24 tot 48 uur. De uiteindelijke eiwitconcentratie is 0,2 mg per mL. Na het voorbereiden van zeven L voorgekoelde Buffer A en dialysebuisjes volgens het tekstprotocol, gebruikt u de dialysebuisjesluiting om een ​​einde van de dialysemembraan vast te klemmen en brengt u het dialysemengsel over in de buis.Klem vervolgens het open uiteinde vast en zorg ervoor dat er geen lekken zijn. Plaats de dialysebuis in een dialyseemmer met de voorgekoelde Buffer A. Voeg vervolgens een magnetische roerstaaf toe, waarbij u ervoor zorgt dat deze de dialysebuis niet raakt tijdens het roeren. Dialyseer het monster bij vier graden Celsius met continu roeren bij 500 RPM en ververs de buffer minstens vier keer gedurende een periode van 12 uur.Na de laatste bufferverversing laat u het monster overnacht dialyseren. De volgende ochtend verwijdert u de dialysebuis uit de emmer en brengt u de inhoud over in een 500 mL beker. Houd de eiwitoplossing op ijs, tenzij anders aangegeven.Filtreer de eiwitoplossing door een membraan met poriën van 0,43 micron in een 500 mL glazen fles om eventueel geprecipiteerd eiwit te verwijderen. Na het wassen, laden en gelijkmaken van een chelatiekolom volgens het tekstprotocol, pas de samenstelling van het hervouwende eiwitmonster aan Buffer F aan door 25 mL 5 M natriumchloride, 2,5 mL 1 M tris-HCl, pH 8,0 en 2,5 mL 2 M imidazool-stamploplossingen toe te voegen. Laad het monster op de kolom met een snelheid van 5 mL per minuut of minder en gooi de flowthrough weg die de ongebonden eiwitten bevat.Was vervolgens de kolom met 50 tot 100 mL Buffer F om niet-specifiek gebonden eiwitten te verwijderen en gooi de flowthrough weg. Elueer het hexahistadine TIp3-LBD met 25 mL Buffer G. Verzamel vervolgens de flowthrough-fracties die het eiwit bevatten. Na het voorbereiden van Buffer H en dialysebuisjes volgens het tekstprotocol, voegt u hexahistadine-gelabelde TEV-protease toe aan het hexahistadine

method-for-efficient-refolding-purification-chemoreceptor-ligand

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

We beschrijven de implementatie van de REPLACE-strategie voor het targeten van eiwit-eiwitinteracties. REPLACE is een iteratieve strategie die synthetische en computationele benaderingen omvat voor de omzetting van geoptimaliseerde peptidische remmers in geneesmiddelachtige moleculen.

Ontwikkeling van inhibitoren van eiwit-eiwit interacties door middel van VERVANGEN: Toepassing op het ontwerp en de ontwikkeling van niet-concurrerende ATP CDK-remmers

Hier beschrijven we methoden die we vaak toepassen in het laboratorium om te bepalen hoe de aard van de interactie tussen het T-celreceptor en tumorantigenen, gepresenteerd door humane leukocytenantigenen, de functionaliteit van T-cellen bepaalt; deze methoden omvatten eiwitproductie, röntgenkristallografie, biofysica en functionele T-celleproeven.

Via röntgenkristallografie, Biophysics en functionele testen om de mechanismen van T-cel-receptorherkenning van kankerantigenen bepalen

Hier wordt een protocol voor hoogwaardige FRET-experimenten op het molecuulniveau voorgesteld. Daarnaast kan deze methodologie worden gebruikt om drie conformatieve staten in het ligand-bindende domein van de N-methyl-D-aspartaat (NMDA) receptor te identificeren. Het bepalen van precieze afstande is de eerste stap in de richting van het opbouwen van structurele modellen op basis van FRET-experimenten.

High Precision FRET op single-molecuul niveau voor biomolecule structuur bepaling

Deze studie presenteert een gedetailleerde procedure voor het uitvoeren van single-molecule fluorescentie resonantie energie transfer (smFRET) experimenten op G-eiwit-gekoppelde receptoren (GPCR's) met behulp van site-specifieke etikettering via onnatuurlijke aminozuur (OCG) incorporatie. Het protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor smFRET-monstervoorbereiding, experimenten en gegevensanalyse.

Het visualiseren van de conformatiedynamiek van membraanreceptoren met behulp van single-molecule FRET

Dit protocol introduceert de tools die beschikbaar zijn voor het modelleren van liganden van kleine moleculen in cryoEM-kaarten van macromoleculen.

Liganden modelleren in kaarten afgeleid van elektronencryomicroscopie

We beschrijven een methodologie gebaseerd op sequentiediversificatie om de aminozuurvoorkeuren van multispecifieke bindingsplaatsen in eiwit-eiwitinteracties (PPI's) te schatten. In deze strategie worden duizenden potentiële peptideliganden gegenereerd en gescreend in silico, waardoor enkele beperkingen van beschikbare experimentele methoden worden overwonnen.

Computationele voorspelling van aminozuurvoorkeuren van potentieel multispecifieke peptide-bindende domeinen die betrokken zijn bij eiwit-eiwitinteracties

Hier presenteren we een protocol voor het structuurgestuurde ontwerp van eiwit-ligandbindingsinteractie tussen Sanglifehrin A en Cyclophiline A/Ganoderiol-F, essentieel voor de ontdekking van nieuwe geneesmiddelen. De stabiliteit van het ligand-receptorcomplex werd geëvalueerd met behulp van moleculaire dynamica-simulatie.

Structuurgeleid ontwerp en ontwikkeling van nieuwe cyclophiline A-remmers en ganoderiol-F-derivaten: een in-silico-benadering

Eiwitontwerp omvat de constructie van aminozuursequenties en de opname van specifieke motieven om functionele varianten te creëren. Deze aanpak is van cruciaal belang voor de ontwikkeling van antimicrobiële peptiden (AMP's) om antibioticaresistente ziekteverwekkers te bestrijden. Dit artikel presenteert een procedure voor eiwitconstructie met behulp van verschillende bio-informaticahulpmiddelen.

Toepassing van I TASSER, trRosetta, UCSF Chimera, HADDOCK-server en HEX-loria voor De Novo en In Silico Design of Proteins

Een protocol voor het synthetiseren van peptoïden met gemengde kationische functionaliteit in dezelfde sequentie wordt gepresenteerd (lysine- en arginine-achtige monomeren). Het daaropvolgende testen van deze verbindingen tegen Leishmania mexicana, de protozoa-parasieten die cutane leishmaniasis veroorzaken, wordt ook beschreven.

Een efficiënte methode voor de synthese van peptoïden met Gemengde lysine-type / Arginine-type monomeren en evaluatie van hun anti-leishmania Activity

We zijn erin geslaagd een methode te ontwikkelen voor RNA-isolatie uit plantenzaden die grote hoeveelheden oliën, eiwitten en polyfenolen bevatten, die remmende effecten hebben op RNA-isolatie met hoge zuiverheid. Onze methode is geschikt voor het monitoren van de expressie van genen met transcripten op laag niveau in zaden.

Een efficiënte methode voor het isoleren van zeer gezuiverde RNA uit zaden voor gebruik in Quantitative Analysis Transcriptome

Leer hoe je het ligandbindende domein van de Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 uit insluitlichamen heropvouwt en zuivert. Deze methode levert milligrammen functioneel eiwit voor structurele studies.

Methode voor het efficiënt uiteinde en zuivering van de Chemoreceptor-Ligand bindend domein

Meer video's verkennen