Methode voor het efficiënt uiteinde en zuivering van de Chemoreceptor-Ligand bindend domein

Het algemene doel van deze procedure is om een chemoreceptor-ligandbindingsdomein uit inclusielichamen opnieuw te vouwen en het te zuiveren voor gebruik in structurele en functionele studies. Om vast te stellen welke signalen een bacteriële chemoreceptor verzendt en hoe, kan men de geïsoleerde ligandbindingsdomeinen gebruiken om te screenen tegen kleine molecuulbibliotheken of om de structuur met en zonder ligand te bepalen. Expressie van extracellulair ligandbindingsdomein in E.coli leidt vaak tot afzetting in inclusielichamen.

Hier laten we zien hoe milligram hoeveelheden functioneel eiwit kunnen worden teruggewonnen uit de inclusielichamen. Om te beginnen, inoculeer 150 mL steriele LB-bouillon met 50 microgram per mL ampicilline met BL21-CodonPlus RIPL cellen getransformeerd met de pET151 D-TOPO vector voor expressie van hexahistidine TIp3-LBD. Incubeer de cultuur bij 200 RPM en 37 graden Celsius overnacht.

Bereid zes 2L Erlenmeyer kolven met 800 mL steriele LB-bouillon en 50 microgram per mL ampicilline. Inoculeer elke kolf met 20 mL van de overnachtelijke cultuur. Incubeer de kolven bij 37 graden Celsius met continu schudden bij 200 RPM tot de OD600 0,6 bereikt.

Op dit punt induceert u de eiwitexpressie door 1 millimolair IPTG aan elke kolf toe te voegen. Blijf de kolven incuberen bij 37 graden Celsius in een schudder bij 200 RPM gedurende nog eens vier uur. Oogst de cellen door centrifugatie bij 5000 xg en vier graden Celsius gedurende 15 minuten.

Gooi vervolgens de supernatant weg. Breng alle cellenpellets over in een 250 mL beker en voeg 100 mL Buffer A toe. Als ze bevroren zijn, laat de cellen dan volledig ontdooien en resuspendeer vervolgens het pellet. Houd het monster op ijs, tenzij anders aangegeven.

Passeer vervolgens de gesuspendeerde cellen drie keer door een hogedrukhomogenisator om de cellen te lyzeren en volledige scheuring van het genomische DNA te garanderen. Centrifugeer vervolgens het lysaat bij 10.000 xg en vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Verzamel een 1 mL monster van de supernatant en bewaar het bij min 20 graden Celsius voor latere SDS-PAGE-analyse.

Gooi vervolgens de rest van de supernatant weg en plaats het pellet op ijs. Resuspendeer vervolgens de inclusielichamenpellet grondig in 20 mL ijskoud Buffer B. Dit vergemakkelijkt de solubilisatie van de membraan- en membraaneiwitten. Vortex het monster gedurende een tot twee minuten om de resuspendering te bevorderen.

Na centrifugatie van het monster resuspendeert u het pellet opnieuw grondig in 20 mL ijskoud Buffer B door eerst de buis gedurende een tot twee minuten te vortexen. Zorg ervoor dat het pellet in kleine stukken is gebroken. Pipet vervolgens het monster op en neer om het te resuspenderen.

Centrifugeer het monster zoals eerder en gooi de supernatant weg. Als de supernatant troebel of gekleurd is, centrifugeer het monster opnieuw en gebruik aanvullend ijskoud Buffer B om het te resuspenderen. Herhaal de centrifugatie en resuspendering totdat de supernatant helder en kleurloos is voordat u het opnieuw pellet.

Voeg 20 mL ijskoud Buffer C toe aan het pellet en resuspendeer het door de buis gedurende een tot twee minuten te vortexen. Voeg vervolgens, na het draaien van het monster, 25 mL ijskoud denaturerend Buffer D toe. Resuspendeer het inclusielichamenpellet grondig door de buis gedurende een tot twee minuten te vortexen of totdat het pellet in kleine stukken is gebroken. Meng de suspensie door axiale rotatie bij 30 RPM en 4 graden Celsius gedurende 30 tot 120 minuten.

Verduidelijk de gedenatureerde eiwitoplossing door centrifugatie bij 30.000 xg en vier graden Celsius gedurende 30 minuten. Plaats vervolgens de supernatant op ijs en gooi de pellet weg. Terwijl u 250 mL Buffer E roert bij 500 RPM, voegt u 60 milligram gedenatureerd eiwitmengsel toe dat hexahistadine TIp3-LBD bevat.

Incubeer het hervouwende mengsel bij vier graden Celsius met continu roeren bij 500 RPM gedurende 24 tot 48 uur. De uiteindelijke eiwitconcentratie is 0,2 mg per mL. Na het voorbereiden van zeven L voorgekoelde Buffer A en dialysebuisjes volgens het tekstprotocol, gebruikt u de dialysebuisjesluiting om een ​​einde van de dialysemembraan vast te klemmen en brengt u het dialysemengsel over in de buis.

Klem vervolgens het open uiteinde vast en zorg ervoor dat er geen lekken zijn. Plaats de dialysebuis in een dialyseemmer met de voorgekoelde Buffer A. Voeg vervolgens een magnetische roerstaaf toe, waarbij u ervoor zorgt dat deze de dialysebuis niet raakt tijdens het roeren. Dialyseer het monster bij vier graden Celsius met continu roeren bij 500 RPM en ververs de buffer minstens vier keer gedurende een periode van 12 uur.

Na de laatste bufferverversing laat u het monster overnacht dialyseren. De volgende ochtend verwijdert u de dialysebuis uit de emmer en brengt u de inhoud over in een 500 mL beker. Houd de eiwitoplossing op ijs, tenzij anders aangegeven.

Filtreer de eiwitoplossing door een membraan met poriën van 0,43 micron in een 500 mL glazen fles om eventueel geprecipiteerd eiwit te verwijderen. Na het wassen, laden en gelijkmaken van een chelatiekolom volgens het tekstprotocol, pas de samenstelling van het hervouwende eiwitmonster aan Buffer F aan door 25 mL 5 M natriumchloride, 2,5 mL 1 M tris-HCl, pH 8,0 en 2,5 mL 2 M imidazool-stamploplossingen toe te voegen. Laad het monster op de kolom met een snelheid van 5 mL per minuut of minder en gooi de flowthrough weg die de ongebonden eiwitten bevat.

Was vervolgens de kolom met 50 tot 100 mL Buffer F om niet-specifiek gebonden eiwitten te verwijderen en gooi de flowthrough weg. Elueer het hexahistadine TIp3-LBD met 25 mL Buffer G. Verzamel vervolgens de flowthrough-fracties die het eiwit bevatten. Na het voorbereiden van Buffer H en dialysebuisjes volgens het tekstprotocol, voegt u hexahistadine-gelabelde TEV-protease toe aan het hexahistadine