Name: Isolatie van dendritische cellen uit de menselijke vrouwelijke voortplantingssysteem voor Phenotypical en functionele Studies (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Leer dendritische cellen isoleren uit het vrouwelijke voortplantingssysteem voor fenotypische en functionele studies. Deze methode behoudt oppervlaktemarkers en is aanpasbaar voor andere immuuncellen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ondersteund door de NIH studiebeurzen AI102838 en AI117739 (CRW). Wij danken Richard Rossoll voor technische bijstand. Flow cytometrische analyse werd uitgevoerd in DartLab, de gedeelde Resource Dartmouthsupported door (P30CA023108-37) en (P30GM103415-15).

Studies waarbij menselijke proefpersonen werden uitgevoerd volgens de beginselen die zijn uitgedrukt in de verklaring van Helsinki. Studies werden goedgekeurd door de Dartmouth College institutionele Review Board en de Commissie voor de bescherming van de menselijke onderwerpen (CPHS). Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen HIV-negatieve vrouwen ondergaan operaties bij Dartmouth-Hitchcock Medical Center (Libanon, NH) voor de operatie. Opgeleide pathologen geselecteerd weefselmonsters van de EM CX en de ECX, vrij van pathologische laesies en ver van de sites van de pathologie. Bloedmonsters werden van vrijwilliger gezonde donoren aangeworven bij Dartmouth Hitchcock Medical Center. Bloeddonoren waren anonieme. Vers geïsoleerde EM, CX en ECX weefsels van de operatiekamer werden overgedragen aan pathologie voor isolatie en classificatie voorafgaande overbrengen naar ons laboratorium in afzonderlijke, steriele polypropyleen-buizen.
1. enzymatische vertering van weefsels
Opmerking: Gebruik van steriele materialen en werken in een biologische veiligheidskast.
<ol><li>Een gemodificeerde Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS) 1 x HBSS met fenol rood, 100 U/mL penicilline-streptomycine, 0,35 g/L NaHCO3en 20 mM HEPES voor te bereiden.</li>
	<li>De enzymatische cocktail bereiden (gewijzigd HBSS, 450 U/mL collagenase IV, 0,01% [wt/vol] deoxyribonuclease ik, en 2 mg/mL D-glucose). Laat de oplossing door een steriele 0,22 µm filter. Het enzym spijsvertering ideaal, voor te bereiden op de dag van gebruik, maar het kan worden bevroren bij-20 ° C voor opslag. Vermijd het herhaaldelijk bevriezen en ontdooien cycli.</li>
	<li>Spoel het weefsel met gemodificeerde HBSS en plaats in een petrischaal van 100 x 15 mm2 . Aanpassen van de grootte van de petrischaal op basis van de hoeveelheid weefsel beschikbaar en het volume van enzym cocktail gebruikt (zie stap 1.4.2 hieronder). Opmerking: Weefsels variëren in grootte, afhankelijk van het chirurgische monster verkregen van de pathologie, variërend van 1-10 g.</li>
	<li>Fysische procédés met wegwerp scalpel en pincet:<ol>
<li>Voeg ongeveer 3 mL van spijsvertering enzym cocktail aan het weefsel te voorkomen tijdens het knippen drogen.</li>
		<li>Gebruik pincet te stabiliseren van het weefsel en gehakt met een scalpel te verhogen van het oppervlak van het weefsel blootgesteld aan de cocktail spijsvertering-enzym. Snijd het weefsel in kleine stukjes (< 2 mm op een kant). Voeg voldoende spijsvertering enzym cocktail ter dekking van alle weefsel stukken (5 mL/g weefsel). Plaats het deksel op de petrischaal.</li>
		<li>Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2 op een rotator bij ongeveer 80 omwentelingen per minuut gedurende 45 minuten ervoor zorgen dat de snelheid van de rotator grondig de spijsvertering enzym cocktail mixen zonder morsen of produceren van bubbels.</li>
		<li>Visualiseer de voorbereiding van de weefsel met een omgekeerde licht microscope met de 4 X en 10 X doelstellingen. Opmerking: Na vertering, kleine weefsel fragmenten en een gemengde celsuspensie, met inbegrip van zichtbaar epithelial klieren moeten aanwezig zijn (Zie figuur 1A).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. fysieke scheiding van afzonderlijke cellen
<ol><li>In een steriele omgeving, plaatst u een strak 250 µm gaas met houder in een petrischaal van 150 x 15 mm2 . Ervoor zorgen dat het net ongeveer 0,5 cm boven het oppervlak van de petrischaal is.</li>
	<li>De Maas met 2 mL gemodificeerde HBSS NAT en breng het verteerd weefsel op de Maas.</li>
	<li>Met behulp van het platte oppervlak van de zuiger van een 10 mL spuit, zachtjes maar stevig, het verteerd gehakt weefsel via de Maas grind. Let op: Slijpen te agressief zal schade toebrengen aan de Maas en verhogen van de sterfte van de cel. Deze stap zal scheiden de epitheliale cellen en stromale cellen (met inbegrip van immune cellen) van het bindweefsel en het slijm.</li>
	<li>Zodra de weefsel fragmenten hebben grondig zijn verspreid, de Maas en de houder verheffen 2-3 cm boven de petrischaal en de spoel met 3 mL gemodificeerde HBSS extra cellen herstellen.</li>
	<li>Het verzamelen van de celsuspensie. Breng de 20 µm gaas met houder in een petrischaal en nat met 2 mL gemodificeerde HBSS. Giet de celsuspensie door de Maas houden de Maas 2-3 cm boven de petrischaal en spoelen met 6 mL gemodificeerde HBSS. Opmerking: Deze stap zal scheiden de epitheliale bladen, die worden bewaard op de top, van afzonderlijke cellen die passeren aan de Maas. De doorstroming is een gemengde celsuspensie, waaronder immuuncellen en stromale fibroblasten.</li>
	<li>Verzamel de gemengde celsuspensie en centrifuge op 500 x g gedurende 10 minuten Aspirate de vloeistof en resuspendeer de pellet in 4 mL gemodificeerde HBSS voor dichtheid kleurovergang centrifugeren.</li>
	<li>Layer de gemengde celsuspensie meer dan 3 mL polysucrose oplossing en centrifugeer bij kamertemperatuur op 500 x g gedurende 30 min met geen rem. De witte band vanaf de bovenkant van de oplossing polysucrose verzamelen en wassen met PBS. Opmerking: Dit gedeelte is de verrijkt gemengd celsuspensie, die is rijk aan immuuncellen en bevat enkele stromale fibroblasten.</li>
</ol>3. dode cel verwijderen
Opmerking: Als een groot percentage van dode cellen (> 20%) aanwezig in de verrijkte gemengde celsuspensie na dichtheid kleurovergang centrifugeren zijn, verwijdering van de dode cel met magnetische kralen wordt aanbevolen. Dode cellen moeten worden verwijderd omdat ze met het selectieproces positieve magnetische kraal interfereren kunnen.
<ol><li>Met behulp van een hemocytometer op een lichte Microscoop met de 10 X doelstelling cellen tellen. Spin down alle cellen in de verrijkte gemengde celsuspensie (500 x g, 10 min, 4 ° C). Volledig gecombineerd en verwijder het supernatant. Voeg 100 µL van de parels van de verwijdering van de dode cel per 1 x 107 totaal aantal cellen (levende en dode), volgens de instructies van de fabrikant. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Een 30 µm filter plaatsen op de magnetische kolom, de celsuspensie van toepassing en de kraal-geëtiketteerden cellen te vallen door de magnetische kolom toestaan.</li>
	<li>Spoel de kolom met de verwijdering van de dode cel buffer als aanbevolen (3 mL). Verzamel de doorstroming met de levende cellen. Het bereik van cel herstel na verwijdering van de dode cel wordt weergegeven in figuur 1B. Opmerking: Deze cellen kunnen worden gebruikt voor het uitvoeren van stroom cytometry kleuring voor phenotypical studies (sectie 5) of voortzetten van DC isolatie (punt 4).</li>
</ol>4. DC zuivering door positieve magnetische kraal selectie
<ol><li>Na verwijdering van de dode cel (stap 3.2), draaien de cellen naar beneden, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 80 µL magnetische selectie buffer per 1 x 107 cellen (PBS, 0,5% warmte-geïnactiveerd menselijk AB serum (HS), 2 mM EDTA).</li>
	<li>Voor positieve selectie van DC populaties, voegt u CD1a of CD14 magnetische kralen volgens de instructies van de fabrikant (20 µL magnetische kralen per 1 x 107 cellen). Incubeer gedurende 15 min bij 4° C.
</li>
	<li>Wassen van de cellen met de magnetische selectie buffer, spin naar beneden en volledig verwijderen van de buffer. Resuspendeer de cellen in een minimum van 500 µL van magnetische selectie buffer.</li>
	<li>De kolom toevoegen aan de magneet en een 30 µm filter bovenaan de kolom te behouden elke resterende cel klontjes toe te voegen. Spoel de filter- en kolominstellingen met magnetische selectie buffer zoals aanbevolen.</li>
	<li>De celsuspensie toepassen in de kolom. Spoel 3 keer met magnetische selectie buffer.</li>
	<li>De kolom overbrengen in een buis 15 mL, voeg 5 mL van magnetische selectie buffer en de plunjer om los van de geselecteerde cellen in de kolom toepassen.</li>
	<li>Het vergroten van de zuiverheid, herhaalt u stappen 4.4-4.6 met de herstelde cellen met behulp van een nieuwe kolom. In Figuur 1 cis het bereik van cel herstel na magnetische kraal selectie gepresenteerd.</li>
</ol>5. beoordeling van de zuiverheid van de cel: Stroom Cytometry en microscopie
<ol><li>Antilichaam kleuring voor stroom cytometry:<ol>
<li>Resuspendeer tot 1 x 106 cellen in 100 µL van PBS met 20% warmte-geïnactiveerd HS te blokkeren Fc receptoren, en incubeer gedurende 10 min op ijs.</li>
		<li>Voeg de gewenste fluorescently label antilichamen en het reagens voor identificatie van dode cellen (voor een voorbeeld, zie punt 6.5). Fluorescentie minus één (FMO) controles te de poorten, gebruiken compensatie kralen voor te bereiden op één vlek besturingselementen compensatie instellen Voorbeelden van antilichamen die gebruikt zijn gegeven in tabel 1. Incubeer gedurende 20 minuten bij 4 ° C, beschermd tegen licht.</li>
		<li>Wassen van de cellen met 2 mL magnetische selectie buffer. Opmerking: De aanwezigheid van EDTA is belangrijk te voorkomen dat de vorming van cel samendoen voor flow cytometrische analyse. Draai naar beneden en verwijder het supernatant.</li>
		<li>De cellen door toevoeging van 100 µL van 2%-oplossing van de paraformaldehyde per buis bevestigen.</li>
		<li>Analyseer de monsters in een stroom cytometer10,11.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Draaien de kolom (bijvoorbeeld, cytospin) en toepassing Giemsa-kleuring voor het analyseren van de morfologie:<ol>
<li>Resuspendeer de cellen in 200 µL van magnetische selectie buffer.</li>
		<li>Laden in een kolom van de spin en de spin voor 5 min. Laat de dia volledig drogen.</li>
		<li>Herstellen van de dia door onderdompeling in 100% methanol gedurende 2 minuten spoelen de dia met gedeïoniseerd water en laat ze in de lucht droog.</li>
		<li>Voer een standaard Wrights-Giemsa-kleuring. Dekking van de cellen met eosine en incubeer gedurende 10 min, spoel af met gedeïoniseerd water en laten drogen. Dekking van de cellen met Wrights-Geimsa vlek, Incubeer gedurende 1 min, spoel af met gedeïoniseerd water, en droge lucht.</li>
		<li>Bekijk de voorbereidingen met een omgekeerde Microscoop (figuur 2A, 40 X doelstelling).</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. allogene stimulatie test om te beoordelen van de functie van de cel DC
<ol><li>Ontdooi de bevroren perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs)<ol>
<li>Warm de cel voedingsbodems met 10% HS tot 37 ° C.</li>
		<li>Ontdooi de PBMCs door het plaatsen van de cryotube in een waterbad 37 ° C, totdat een kleine hoeveelheid bevroren cel media in de cryotube blijft. In een steriele omgeving, breng de inhoud van de cryotube tot 10 mL van de voedingsbodems voorverwarmde cel met 10% HS in een tube van 15mL.</li>
		<li>Centrifugeer bij ~ 500 x g voor 7 min. verwijderen van de media, verspreiden de pellet, resuspendeer de PBMCs in 10 mL cel voedingsbodems met 10% HS en centrifuge de cellen.</li>
		<li>Herhaal de stap was een derde keer. Cellen tellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Naïve T-cel-selectie:<ol>
<li>Gebruik een negatieve selectie magnetische antilichaam cel selectie kit te naïef T-cellen isoleren volgens protocol van de fabrikant.</li>
		<li>Controleer de zuiverheid met CD45RA en CCR7 antilichamen na isolatie. Opmerking: Typische zuiverheid is > 99% naïef T-cellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Naïve T-cel proliferatie kleurstof vlekken:<ol>
<li>Bereiden 600 µL van 2 x oplossing van cel proliferatie kleurstof, de kleurstof te beschermen tegen blootstelling aan licht.</li>
		<li>Wassen van de naïeve T-cellen 2 x met PBS. Resuspendeer de cellen in 500 µL PBS.</li>
		<li>Terwijl zachtjes vortexing toevoegen de cellen in het kabinet, biosafety 500 µL van proliferatie kleurstof aan de naïeve T-cellen.</li>
		<li>Incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij 37° C.
</li>
		<li>Stop het labelen van de cel door toevoeging van 5 mL van cel voedingsbodems met 10% HS aan de cellen. Incubeer op ijs voor 5 min, beschermd tegen licht.</li>
		<li>Centrifugeer de cellen bij ~ 500 x g gedurende 7 minuten, de media gecombineerd en resuspendeer de cellen in de 4 ° C voor cel voedingsbodems met 10% HS. Herhaal nog tweemaal voor een totaal van 3 wasbeurten. Neem een hoeveelheid cellen zullen worden geteld voorafgaand aan de laatste centrifugeren. Opmerking: Doorgaans laatste naïef T-cel nummers zullen variëren tussen 5% en 15% van de initiële PBMC cel graaf.</li>
		<li>Resuspendeer de cellen met de cel-cultuur-media met 10% HS in de gewenste cel concentratie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DC-allogene naïef T-cel co cultuur:<ol>
<li>De geïsoleerde DCs en naïef T-cellen in een 96-Wells, ronde bodem plaat, plaat op een 1:15 verhouding van DCs naar T-cellen. Ervoor zorgen dat het optimale aantal voor DCs varieert tussen de 3.000 en 5.000 cellen per putje.</li>
		<li>Centrifugeer de plaat duikt met ~ 500 x g gedurende 3 minuten om ervoor te zorgen dat de cellen zich bevinden in het midden van de put. Cel-naar-cel contact is belangrijk voor de juiste signalering optreden.</li>
		<li>Incubeer bij 37 ° C gedurende 6 dagen. Toezicht op het cluster van cellen, die worden weergegeven in de putjes zoals proliferatie, met microscopie (figuur 3A gebeurt).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Stroom cytometry vlekken om te beoordelen van verspreiding:<ol>
<li>Na 6 dagen, kunnen de cellen door stroom cytometry worden onderzocht. De co cultuur voor stroom cytometry vlek.</li>
		<li>Bereid een 2 x-oplossing van gele levensvatbaarheid kleurstof (maximale emissie 572 nm) in PBS. Opmerking: Het gebruik van PBS zonder serum is belangrijk, als serum eiwitten mengen met de kleurstof).</li>
		<li>De plaat met cellen bij centrifugeren ~ 500 x g gedurende 5 minuten.</li>
		<li>100 µL van de bovendrijvende vloeistof verwijderen. Opmerking: op dit punt verzamelen en opslaan van het supernatant voor afzonderlijke analyse van oplosbare factoren.</li>
		<li>Wassen van de cellen twee keer met PBS: toevoegen van 150 µL per putje van PBS, centrifugeer bij ~ 500 x g gedurende 5 minuten, verwijder 150 µL van bovendrijvende substantie met een pipet. Zorg ervoor dat er 50 µL van supernatant in elk putje blijft.</li>
		<li>Aan elk putje 50 µL van 2 x levensvatbaarheid kleurstof toevoegen Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten, beschermd tegen licht.</li>
		<li>Tijdens de incubatie, bereiden een master mengsel van gewenste antilichaam markers. Bijvoorbeeld: CD3 APC/Cy7, CD4 PE, CD8 FITC, enz.
</li>
		<li>Het antilichaam mengsel toevoegen aan elk putje. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten, beschermd tegen licht.</li>
		<li>Wassen van de cellen 2 x met PBS + 2% HS: toevoegen van 150 µL per putje van PBS + 2% HS. Centrifugeer bij ~ 500 x g voor 5 min. verwijderen 150 µL van bovendrijvende substantie met een pipet.</li>
		<li>Het vaststellen van de cellen door toevoeging van 100 µL per putje van 2% para-formaldehyde. Indien nodig: de cellen en de media overzetten polypropyleen stroom cytometry buizen. Buizen worden bij 4 ° C bewaard en beschermd tegen het licht, tot en met de stroom cytometrische analyse.</li>
		<li>Lees buizen in een flow-cytometer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wira, C. R., Rodriguez-Garcia, M., Patel, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+sex+hormones+in+immune+protection+of+the+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of sex hormones in immune protection of the female reproductive tract.</a> Nat Rev Immunol. 15 (4), 217-230 (2015).</li>
<li>Banchereau, J., Steinman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+the+control+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and the control of immunity.</a> Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).</li>
<li>Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+and+monocyte-derived+cells%3A+Two+complementary+and+integrated+functional+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems.</a> Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).</li>
<li>Tagliani, E., Erlebacher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+function+at+the+maternal-fetal+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell function at the maternal-fetal interface.</a> Expert Rev Clin Immunol. 7 (5), 593-602 (2011).</li>
<li>Kaldensjo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intraepithelial+and+stromal+Langerin+and+CCR5+positive+cells+in+the+human+endometrium%3A+potential+targets+for+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Detection of intraepithelial and stromal Langerin and CCR5 positive cells in the human endometrium: potential targets for HIV infection.</a> PLoS One. 6 (6), e21344(2011).</li>
<li>Schulke, L., Manconi, F., Markham, R., Fraser, I. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endometrial+dendritic+cell+populations+during+the+normal+menstrual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Endometrial dendritic cell populations during the normal menstrual cycle.</a> Hum Reprod. 23 (7), 1574-1580 (2008).</li>
<li>Ballweber, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaginal+langerhans+cells+nonproductively+transporting+HIV-1+mediate+infection+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Vaginal langerhans cells nonproductively transporting HIV-1 mediate infection of T cells.</a> J Virol. 85 (24), 13443-13447 (2011).</li>
<li>Hladik, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+events+in+establishing+vaginal+entry+and+infection+by+human+immunodeficiency+virus+type-1%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1.</a> Immunity. 26 (2), 257-270 (2007).</li>
<li>Duluc, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversity+of+human+vaginal+APC+subsets+in+directing+T-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Functional diversity of human vaginal APC subsets in directing T-cell responses.</a> Mucosal Immunol. 6 (3), 626-638 (2013).</li>
<li>Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Parks, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpreting+flow+cytometry+data%3A+a+guide+for+the+perplexed%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed.</a> Nat Immunol. 7 (7), 681-685 (2006).</li>
<li>Juno, J. A., Boily-Larouche, G., Lajoie, J., Fowke, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection%2C+isolation%2C+and+flow+cytometric+analysis+of+human+endocervical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Collection, isolation, and flow cytometric analysis of human endocervical samples.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Givan, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+leukocytes+in+the+human+female+reproductive+tract%3A+comparison+of+fallopian+tube%2C+uterus%2C+cervix%2C+and+vagina%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Reprod+Immunol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina.</a> Am J Reprod Immunol. 38 (5), 350-359 (1997).</li>
<li>Rodriguez-Garcia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cells+from+the+human+female+reproductive+tract+rapidly+capture+and+respond+to+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cells from the human female reproductive tract rapidly capture and respond to HIV.</a> Mucosal Immunol. 10 (2), 531-544 (2017).</li>
<li>Rodriguez-Garcia, M., Barr, F. D., Crist, S. G., Fahey, J. V., Wira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+and+susceptibility+to+HIV+infection+of+CD4%2B+Th17+cells+in+the+human+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phenotype and susceptibility to HIV infection of CD4+ Th17 cells in the human female reproductive tract.</a> Mucosal Immunol. 7 (6), 1375-1385 (2014).</li>
<li>Shen, Z., Rodriguez-Garcia, M., Ochsenbauer, C., Wira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+immune+cells+and+infection+by+HIV+in+human+ovarian+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Reprod+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of immune cells and infection by HIV in human ovarian tissues.</a> Am J Reprod Immunol. , (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen

Mucosale DCs zijn een zeldzame celpopulatie sterk beïnvloed door het milieu weefsel, dat verandert hun fenotype en functie zodra ze de weefsels3invoert. Terwijl bloed afkomstig DCs zijn een handig model, ze doen niet geheel representatief is de diversiteit van DC populaties gevonden in weefsels. Daarom, om te begrijpen van de unieke kenmerken van mucosal DCs, isolatie van primaire cellen van weefsels is noodzakelijk. Isolatie van DCs van verschillende anatomische sites in de FRT biedt de mogelijkh...

De FRT heeft de dubbele functie van de bescherming tegen ziekteverwekkers terwijl het toestaan van implantatie en zwangerschap1. Om dit te bereiken, is de FRT gecompartimenteerd, met elke anatomische regio unieke histologische, immunologische en functionele kenmerken1weer te geven.
DCs bijwonen mucosal oppervlakken maken contact met microben in de longen, de darmen en de voortplantingsorganen en immuun toezicht voor potentiële ziekteverwekkers2bieden. DCs hebben de unieke mogelijkheid om prime naïef T-cellen en adaptieve immuunresponsen3te activeren. DCs in de FRT zijn ook gespecialiseerd om het dulden van vreemde antigenen, zoals die gevonden in sperma en de zich ontwikkelende foetus, dat succesvolle zwangerschap4. Daarom, afhankelijk van de locatie, de DC fenotype en functie zal zijn verschillend. Het is bekend dat DCs sterk worden beïnvloed door het milieu weefsel, zodat hun aantal, fenotype en functies zijn gewijzigd door het milieu van de weefsels waarin zij3 wonen. Daarom, om te begrijpen van de rol die FRT DCs bij besmettelijke ziekten, zwangerschap, en kanker in de FRT spelen, resident DCs moeten worden bestudeerd, sinds bloed afgeleide DC modellen onvoldoende zijn om de regelgevende complexiteit gevonden in FRT weefsels.
De karakterisatie van menselijke weefsel resident DCs is uitdagend vanwege de lage aantallen cellen aanwezig in de mucosal weefsels en het moeilijk verkrijgen van menselijk weefselmonsters. DCs zijn bestudeerd in de FRT via immunohistochemistry5,6, die informeert over de cellocatie in het weefsel, maar verzet zich tegen de functionele studies, en die is beperkt in het aantal identificeren cel markeringen die kunnen worden geanalyseerd tegelijk. Bovendien zijn eencellige isolatie protocollen voor flow cytometrische analyse ontwikkelde7,8,9. Sommige van deze protocollen te profiteren van de trekkende capaciteit van DCs te isoleren van de cellen die migreren. Deze methoden meestal 's nachts incubations en selectie van geactiveerde DCs vereisen, maar laat niet voor de studie van DCs in de steady state.
Hier, met behulp van hysterectomie specimens, we geoptimaliseerd een protocol om te isoleren DCs van verschillende anatomische sites in de FRT, het endometrium (EM), de endocervix (CX), en de ectocervix (ECX), waarmee zowel de phenotypical en de functionele analyses. Een niet-Proteolytische enzymatische spijsvertering-protocol gebruikt, kunnen wij onmiddellijk na weefsel spijsvertering aan cel isolatie en stroom cytometrische karakterisering zonder activering van de cel. Multicolor stroom cytometry gebruikt en functionele studies voor de lage aantallen cellen aan te passen, kunnen we identificeren en karakteriseren van zeldzame deelverzamelingen van DCs in de verschillende sites van de FRT.

<table><tbody><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30015.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Hyclone</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Sigma</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002140</td><td></td></tr><tr><td>D-glucose</td><td>Sigma Aldritch</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>0.22 um Stericup 500 mL filter</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>100mm x 15mm polystyreen petrischaal</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875712</td><td></td></tr><tr><td>150mm x 15mm polystyreen petrischaal</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875714</td><td></td></tr><tr><td>150mm x 25mm polystyreen schaal</td><td>Corning</td><td>430599</td><td>Behandelde celkweker</td></tr><tr><td>Isotemp Incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FICO3500TABB</td><td>5.0% CO2</td></tr><tr><td>American Rotator V</td><td>American DADE</td><td>R4140</td><td></td></tr><tr><td>250 um nylon gaas</td><td>Sefar</td><td>03-250/50</td><td></td></tr><tr><td>20 um nylon gaas</td><td>Sefar</td><td>03-20/14</td><td></td></tr><tr><td>Beckman GS-6R Centrifuge</td><td>Beckman</td><td>358702</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 met Gentamicin L-Gln, Fenol Rood, 1 L</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>Human AB Serum</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque-1077</td><td>Sigma Aldritch</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat Buffer Solution (PBS)</td><td>National Diagnostics</td><td>CL-253</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>Dead Cell Removal Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Pre-separation filter (30um)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>LS column</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-410</td><td></td></tr><tr><td>Quadro MACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>MACS multi-stand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>USB</td><td>15694</td><td></td></tr><tr><td>CD1a Microbeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-051-001</td><td></td></tr><tr><td>CD14 Microbeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>eFluor 670 celproliferatiekleurstof</td><td>eBiosciences</td><td>65-0840-85</td><td></td></tr><tr><td>96 wells ronde bodemplaat</td><td>Falcon</td><td>9/8/2866</td><td></td></tr><tr><td>Zombie geel levensvatbaarheidskleurstof</td><td>Biolegend</td><td>423104</td><td></td></tr><tr><td>CD3 APC/Cy7, anti-human</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>25-0038-T100</td><td></td></tr><tr><td>CD4 PE, anti-human</td><td>eBiosciences</td><td>12-0048-42</td><td></td></tr><tr><td>CD8a FITC, anti-human</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>35-0086-T100</td><td></td></tr><tr><td>Gallios Flow Cytometer</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>B43618</td><td>10 kleuren, VBR</td></tr><tr><td>MACSquant Analyzer 10</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td>8 kleuren, VBR</td></tr></tbody></table>

isolatie van dendritische cellen uit de menselijke vrouwelijke voortplantingssysteem voor phenotypical en functionele studies

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

De karakterisering van de menselijke dendritische cellen (DC's) woonachtig in de mucosal weefsels is uitdagend als gevolg van de moeilijkheden bij het verkrijgen van monsters, en de lage aantallen van DCs presenteren per weefsel. Nog, als de fenotype en de functie van DCs is gewijzigd door het weefsel milieu, er moet analyseren weefsel resident DC populaties, omdat bloed afkomstig DCs onvolledig weerspiegelen de complexiteit van DCs in weefsels. Hier presenteren we een protocol om te isoleren van de menselijke vrouwelijke voortplantingssysteem (FRT) met behulp van hysterectomie specimens waarmee zowel phenotypical en functionele analyses DCs. Het protocol bestaat uit weefsel spijsvertering voor het genereren van een eencellige gemengd celsuspensie, gevolgd door positieve magnetische kraal selectie. Ons weefsel spijsvertering protocol doet niet klieven oppervlakte markers, waardoor phenotypical en functionele analyse van DCs in de steady-state, zonder overnachting incubatie of cel activering. Dit protocol kan worden aangepast voor de isolatie van andersoortige immuun cel of isolatie van DCs uit andere weefsels.

Volgende weefsel spijsvertering, de vrijlating van epitheliale bladen en klieren kan worden waargenomen, zoals weergegeven in figuur 1A; Dit is een positieve controle verschijnt dat de enzymatische vertering is voltooid. Het aantal totaal aantal levensvatbare cellen en DCs hersteld per gram weefsel worden ook weergegeven in figuur 1B en Figuur 1 c, respectievelijk. Immune cellen vertegenwoordigen tus...

Hier beschrijven we een methode om te isoleren en te zuiveren van dendritische cellen uit verschillende anatomische compartimenten in de menselijke vrouwelijke voortplantingssysteem voor de evaluatie van hun phenotypical en functionele kenmerken. Deze methode kan worden aangepast aan het isoleren van andere immune cellen of van dendritische cellen uit andere mucosal weefsels.

Isolatie van dendritische cellen uit de menselijke vrouwelijke voortplantingssysteem voor Phenotypical en functionele Studies

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...

Het algemene doel van deze procedure is om dendritische cellen te isoleren uit verschillende anatomische compartimenten in de vrouwelijke menselijke voortplantingsorganen om hun fenotypische en functionele kenmerken te evalueren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over in het weefsel aanwezige dendritische cellen in het vrouwelijke genitale kanaal, zoals de anatomische compartimentalisering van specifieke subsets en hun functionele kenmerken. Het grote voordeel van deze techniek is dat ons weefseldigeratieprotocol geen oppervlaktemarkers afbreekt, waardoor directe isolatie van dendritische cellen mogelijk is zonder overnachtelijke incubatie of celactivatie.Hoewel deze methode is geoptimaliseerd voor het isoleren van dendritische cellen uit het vrouwelijke menselijke voortplantingsorgaan, kan deze ook worden aangepast om andere immuuncellen of dendritische cellen uit andere weefsels te isoleren. Fiona Barr en Jared Fortier, technici in ons laboratorium, zullen de procedure demonstreren. Begin deze procedure door het weefsel te spoelen met aangepast HBSS.Plaats het weefsel in een 100 bij 15 millimeter vierkante petrischaal en voeg ongeveer drie milliliter van een cocktail van spijsverteringsenzymen toe om te voorkomen dat het weefsel uitdroogt. Terwijl u de pincetten gebruikt om het weefsel te stabiliseren, snijdt u het met een scalpel om het oppervlak van het weefsel dat aan de cocktail van spijsverteringsenzymen is blootgesteld te vergroten. Snijd het weefsel in kleine stukjes.Voeg voldoende cocktail van spijsverteringsenzymen toe om alle weefselstukken te bedekken en plaats de deksel op de petrischaal. Incubeer bij 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide op een roterende shaker bij ongeveer 80 tpm gedurende 45 minuten. Zorg ervoor dat de snelheid van de roterende shaker de cocktail van spijsverteringsenzymen grondig mengt zonder dat er vloeistof morst of dat er luchtbellen ontstaan.Na 45 minuten visualiseert u de weefselvoorbereiding met een omgekeerde lichtmicroscoop met de 4X en 10X objectieven. Een succesvolle enzymatische vertering zou epitheelvellen en klieren moeten vrijgeven, zoals getoond in deze representatieve afbeelding. Voer de scheiding van afzonderlijke cellen uit in een steriele omgeving.Plaats eerst een strakke 250-micrometer gaas met houder in een 150 bij 15 millimeter vierkante petrischaal en zorg ervoor dat het gaas ongeveer 0,5 centimeter boven het oppervlak van de petrischaal ligt. Bevochtig vervolgens het gaas met twee milliliter aangepast HBSS en breng het gedigesteerde weefsel over op het gaas. Gebruik het vlakke oppervlak van een 10-milliliter spuitplunger om het gedigesteerde gehakte weefsel voorzichtig maar stevig door het gaas te malen.Zodra de weefselfragmenten volledig zijn verspreid, til de gaas en de houder twee tot drie centimeter boven de petrischaal op en spoel met drie milliliter aangepast HBSS om extra cellen te herstellen. Breng de cellensuspensie over in een conische buis van 50 milliliter. Plaats een 20-micrometer gaas met houder ongeveer twee tot drie centimeter boven een nieuwe petrischaal en bevochtig met twee milliliter aangepast HBSS.Laat de cellensuspensie door het gaas lopen en spoel met zes milliliter aangepast HBSS. Verzamel de gemengde cellensuspensie en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 500 keer g. Zuig het vocht af en suspendeer de pellet in vier milliliter aangepast HBSS.Laag de gemengde cellensuspensie over drie milliliter polysucrose-oplossing voor dichtheidsgradiëntcentrifugering. Centrifugeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten bij 500 keer g zonder rem. Verzamel de witte band vanaf de bovenkant van de polysucrose-oplossing en spoel met PBS.Zodra de verrijkte gemengde cellensuspensie is verzameld, tel de cellen met behulp van een hemotocytoloog op een lichtmicroscoop met het 10X objectief. Laat alle cellen in de cellensuspensie gedurende 10 minuten centrifugeren. Aaspibeer en gooi het supernatant volledig weg.Voeg vervolgens dode celverwijderingskralen toe en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Plaats na 15 minuten een 30-micrometer filter bovenop de kolom om eventueel aanwezig weefseldebris of celagglomeraten vast te houden. Spoel het filter en de kolom met dode celverwijderingsbuffer.Breng vervolgens de cellensuspensie aan en laat de met kralen gelabelde cellen door de magnetische kolom stromen. Spoel de kolom vier keer met drie milliliter dode celverwijderingsbuffer. Verzamel de doorstroming met de levende cellen.Na verwijdering van dode cellen, centrifugeer de cellen. Verwijder het supernatant en suspendeer het cellenpellet in magnetische selectiebuffer, 80 microliter buffer per een keer 10 tot de zeven cellen. Voor positieve selectie van dendritische celpopulaties, voeg CD1a of CD14 magnetische kralen toe en incubeer gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius.Was de cellen met de magnetische selectiebuffer, centrifugeer, verwijder het buffer volledig en suspendeer de cellen in minimaal 500 microliter magnetische selectiebuffer. Bevestig de kolom aan de magneet en plaats een 30-micrometer filter bovenop de kolom om eventueel aanwezig weefseldebris of celagglomeraten vast te houden. Spoel het filter en de kolom met magnetische selectiebuffer.Breng de cellensuspensie aan op de kolom. Spoel drie keer met drie milliliter magnetische selectiebuffer. Breng de kolom over in een 15-milliliter buis.Voeg vijf milliliter magnetische selectiebuffer toe en breng de plunjer aan om de geselecteerde cellen van de kolom te laten loskomen. Om de zuiverheid te verhogen, herhaalt u de zuiveringsstappen met de teruggewonnen cellen met behulp van een nieuwe kolom. Beoordeel vervolgens de celzuiverheid door middel van flowcytometrie en microscopie, zoals beschreven in het tekstprotocol.Voordat u met deze test begint, worden naïeve T-cellen geïsoleerd uit perifeer mononucleair bloedcellen met behulp van een commercieel verkrijgbaar

isolation-dendritic-cells-from-human-female-reproductive-tract-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een sterk gezuiverde bereiding van de muis long dendritische cellen wordt beschreven. Specifieke aandacht wordt gegeven aan de isolatie van de conventionele dendritische cel subset.

Isolatie van Mouse Lung dendritische cellen

Hier hebben we details van een methodologie voor de snelle isolatie van de muis intestinale dendritische cellen (DC's) en macrofagen. Fenotypische karakterisering van intestinale DCs en macrofagen wordt uitgevoerd met behulp van multi-kleuren flowcytometrische analyse, terwijl magnetische kraal verrijking gevolgd door celsortering wordt gebruikt om zeer zuivere populaties voor functionele studies opleveren.

Isolatie en karakterisering van dendritische cellen en macrofagen van de muis Darm

Een efficiënte manier om lymfocyten uit muizen genitaal isoleren beschreven. Deze methode maakt gebruik van enzymdigestie en Percoll gradiëntscheiding om efficiënte isolatie. Deze techniek is ook aangepast aan gebruik in andere...

Isolatie van Lymfocyten van Mouse geslachtsorganen Mucosa

Dit protocol detailleert een methode voor het isoleren van antigen-presenterende cellen uit humane thymus via verschillende stappen enzymatische afbraak van het weefsel, gevolgd door centrifugatie van de enkele celsuspensie en tenslotte magnetische en / of FACS sorteren van celpopulaties plaats.

Isolatie van myeloïde dendritische cellen en epitheelcellen van Human Thymus

Er bestaan verschillende zeldzame populaties van dendritische celsubpopulaties in lymfoïde organen en daarom zijn ze lastig te isoleren in voldoende aantallen en zuiverheid voor immunologische experimenten. Hier beschrijven we een methode met hoge efficiëntie en hoog rendement voor het isoleren van alle momenteel bekende belangrijke subpopulaties van dendritische cellen in de milt van muizen.

Een efficiënte en High Yield methode voor het isoleren van de muis dendritische cel subsets

Deze studie vergelijkt twee verschillende methoden voor het isoleren van humane monocyten voor het verkrijgen van in vitro dendritische cellen (DC's). Monocyten worden geselecteerd door adhesie of negatief verrijkt door magnetische scheiding. De monocytenopbrengst en levensvatbaarheid, samen met de levensvatbaarheid van MDDC, proliferatie en CD11c/CD14-oppervlaktemarkeringsuitdrukking, zullen worden vergeleken tussen beide methoden.

Karakterisering van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen door Imaging flowcytometrie: Een vergelijking tussen twee monocyten Isolation Protocollen

We beschrijven hier een isolatiemethode om humane endocervicale intra-epitheliale lymfocyten te verkrijgen voor de analyse van intra-epitheliale gamma delta T-cellen. Dit protocol kan worden uitgebreid voor de zuivering van endocervicale gamma delta T-cellen door middel van magnetische kralen of door celsortering.

Isolatie en Flow cytometrische analyse van Human Endocervicale Gamma Delta T-cellen

Monocyt-afgeleide DC (MoDC) kleine hoeveelheden gevaar-geassocieerde moleculen kunnen voelen en zijn daarom gemakkelijk primer. Wij bieden een gedetailleerd protocol voor de isolatie van de MoDC uit bloed, tumoren en hun activering met immuuncomplexen terwijl het benadrukken van belangrijke voorzorgsmaatregelen die moeten worden overwogen om te voorkomen dat hun voortijdige activering.

Protocol van de isolatie van muis monocyt-afgeleide dendritische cellen en hun latere In Vitro activatie met Tumor immuuncomplexen

Dit protocol wordt een methode voor de isolatie van primaire menselijke decidual cellen van de foetale membranen van term placentae die kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid van toepassingen (d.w.z. immunocytochemie, stroom cytometry, enz.) verzameld gedemonstreerd die gericht zijn studie de rol van verschillende cel populaties in zwangerschapscomplicaties.

Isolatie van primaire menselijke Decidual cellen van de foetus membranen van Term Placentae

Hier presenteren we een protocol te ontwikkelen en karakteriseren van tolerogenic dendritische cellen (TolDCs) en evalueren van hun immunotherapeutische nut.

Ontwikkeling en functionele karakterisering van lymfkliertest Tolerogenic dendritische cellen

Hier beschrijven we in vitro kweekomstandigheden, isolatie en verhoogde aanmaak van extracellulaire blaasjes (EV's) van Echinococcus granulosus. De kleine EV's werden gekenmerkt door dynamische lichtverstrooiing en transmissie-elektronenmicroscopie. De opname door beenmerg-afgeleide dendritische cellen en hun fenotypische modulatie werden bestudeerd met behulp van confocale microscopie en flowcytometrie.

Isolatie en dendritische celopname van kleine extracellulaire blaasjes van Echinococcus granulosus

Leer dendritische cellen isoleren uit het vrouwelijke voortplantingssysteem voor fenotypische en functionele studies. Deze methode behoudt oppervlaktemarkers en is aanpasbaar voor andere immuuncellen.

Isolatie van dendritische cellen uit de menselijke vrouwelijke voortplantingssysteem voor Phenotypical en functionele Studies

Meer video's verkennen