Full-field optische coherentiemicroscopie voor histologie-achtige analyse van stromale kenmerken in hoornvliestransplantaten

Deze methode kan de screening en selectie van hoornvliesdonorweefsels in oogbanken verbeteren, de resultaten van hoornvliestransplantatie verbeteren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de hoge resolutie beoordelingsvermogen en dat het hoornvlies tijdens de beeldacquisitie ondergedompeld blijft in een gesloten kamer gevuld met opslagmedium, waardoor het potentiële risico op besmetting wordt verminderd. Maelle Vilbert, promovendus van ons laboratorium, zal de procedure demonstreren.

Plaats om te beginnen het hoornvlies ondergedompeld in opslagmedium in de monsterhouder met het epitheel naar boven gericht. Plaats een schone silica afdeklaag die bij de monsterhouder is geleverd op het hoornvlies. Sluit vervolgens de houder door de basis voorzichtig te draaien totdat het monster enigszins is afgeplat en geïmmobiliseerd onder de afdekslip, waardoor een relatief gelijkmatig beeldoppervlak ontstaat.

Neem voorzorgsmaatregelen om luchtbellen te voorkomen. Breng een dikke laag oogheelkundige of optische gel aan op de afdekstrook als onderdompelingsmedium. Initialiseer het apparaat door de aan/uit-schakelaar aan de achterkant van het apparaat in te schakelen.

Verlichting van een groene LED aan de voorkant van het apparaat geeft aan dat de stroom is ingeschakeld. Zorg ervoor dat de beeldvormingsfase duidelijk is, behalve de beweegbare lade. Klik vervolgens op OK in de acquisitiesoftware om de motoren bij de prompt te initialiseren.

Als u het apparaat wilt instellen, voert u een voorbeeld-id in het daarvoor bestemde en verplichte veld in. En voer eventueel een voorbeeldbeschrijving en studiebeschrijving in. Klik vervolgens op Macroafbeelding ophalen om een momentopname van het voorbeeld te maken die later kan worden gebruikt voor laterale positionerings- en navigatiedoeleinden.

Zodra u tevreden bent, valideert u de afbeelding bij de prompt door op Ja te klikken. Waarna het apparaat de monsterlade onder het objectief verplaatst en een automatische aanpassing uitvoert. Zorg ervoor dat het microscoopobjectief goed is ondergedompeld in de optische gel voordat u verder gaat.

Bereid de acquisitie voor door naar het tabblad Verkennen te gaan. Voordat u een stapel afbeeldingen ophaalt, navigeert u naar het midden van het hoornvlies via de joystick of handmatige selectie op het scherm. Varieer de beelddiepte via rotatie van de joystick, aanpassing van de schuifregelaar of handmatige toetsenbordinvoer in de grafische gebruikersinterface.

Pas vervolgens de gemiddelde waarde aan naar 40 voor optimale corneabeeldvorming. Voer de waarde van het hoornvliesoppervlak of de eerste afbeeldingslocatie in het diepteveld in. Selecteer vervolgens het tabblad Verkrijgen om afbeeldingen te verkrijgen.

Selecteer en stel de segmentafstand in die overeenkomt met de axiale resolutie van het apparaat. Voer de waarde voor de dikte van het hoornvlies in onder Aantal segmenten. Bekijk parameters en acquisitietijd.

En als u tevreden bent, drukt u op OK om de overname te starten. Vermijd tijdens de acquisitie contact met de tafel waarop de microscoop is geplaatst. Om de laagdikte van stromale en Bowman te beoordelen, meet u afstanden van corneadoorsneden.

Voeg bijvoorbeeld vijf punten met gelijke afstand van elkaar toe aan de doorsnede, zoals beschreven in het tekstmanuscript. Teken een lijn tussen twee punten met een bekende afstand volgens het standaardbeeldveld. Ga vervolgens naar het tabblad Analyseren en selecteer Schaal instellen.

Voer de bekende afstand en lengte-eenheid in de juiste velden in. Stel in op 1024 pixels of 780 micrometer en klik op OK. Teken een lijn tussen twee punten met een onbekende afstand en lees de lengte of afstand die rechtstreeks vanaf de statusbalk wordt gemeten. Noteer het gemiddelde en de variatiecoëfficiënt.

Klik op het tabblad Afbeelding en selecteer Reslice Z onder Stapels om de keratinocytendichtheid te bepalen. Dit zal de stromale en face beelden in groepen van zeven optellen om plakjes van vergelijkbare dikte te produceren. Neem voor verdere analyse alle beschikbare en face slices op voor het voorste meeste stroma, 15 afbeeldingen voor het voorste stroma, vijf afbeeldingen voor het middenstroma en vijf afbeeldingen voor het achterste stroma.

Selecteer op elke afbeelding met een eigen gezicht een interessegebied van 300 bij 300 micrometer. Als u de kernvisualisatie wilt verbeteren, keert u de afbeelding om met Omkeren op het tabblad Bewerken. Pas het contrast en de helderheid aan door op het tabblad Afbeelding te klikken en naar Helderheid-contrast te gaan.

Als u celkernen handmatig wilt tellen, gaat u naar Plug-ins en navigeert u naar Celteller onder het tabblad Analyseren. Druk op Initialiseren en selecteer vervolgens een itemtype. Tel vervolgens de celkernen door op donkere ovale kenmerken in de omgekeerde afbeelding te klikken, rekening houdend met die welke slechts voor twee van de vier zijden van het beeld op een afbeeldingsrand landen.

Het geselecteerde menselijke donorhoornvlies was gezwollen na opslag in orgaankweekmedium, wat een pathofysiologisch model van het oedemateus hoornvlies gaf en beeldacquisitie door de gehele hoornvliesdikte voorkwam vanwege de beperkte penetratiediepte. Overdracht naar met dextrine aangevuld orgaankweekmedium, verminderde de zwelling en resulteerde in donorhoornvliezen van normale dikte. Zieke hoornvliezen werden herkend door morfologische veranderingen en typische stromale kenmerken, waaronder een afname van de variabele stromale dikte of de laag van Bowman.

Beoordeling van de keratinocytendichtheid en stromale reflectiviteit hielp verder bij de histologie-achtige analyse en differentiatie van normale van pathologische corneaweefsels met full-field optische coherentiemicroscopie, die verder gaat dan de mogelijkheden van klinische optische coherentietomografiesystemen. Na het bekijken van deze video moet u een goed begrip hebben van hoe u kwalitatieve en kwantitatieve histologie-achtige analyse van het hoornvliesstroma kunt uitvoeren, waardoor differentiatie van de ziekte van normale menselijke hoornvliesweefsels mogelijk is.