Ontleden multi signalering eiwitcomplexen door Bimolecular complementatie affiniteit zuivering (BiCAP)

Deze methode kan ons helpen om belangrijke vragen in de celbiologie en biochemie te beantwoorden, zoals hoe de dynamische assemblage van eiwitten en eiwitcomplexen signaalroutes en celgedrag controleren. Het grote voordeel van deze techniek is dat we specifiek twee interacterende eiwitten kunnen isoleren, terwijl we niet-gecomplexeerde individuele eiwitten en concurrerende bindingspartners uitsluiten. Hoewel we deze methode gebruiken om inzicht te geven in receptieve tyrosinekinasedimerisatie bij borstkanker, kan deze ook worden toegepast op elke andere fysiologische situatie of ziekte.

We hadden voor het eerst een idee voor deze methode toen we ons realiseerden dat de GFP nanobody het driedimensionale epitoop van GFP en andere fluorescerende eiwitten herkent. Om te beginnen, voegt u 150 nanogram invoervector, 150 nanogram bestemmingsvector en acht microliter TE-buffer toe aan een buisje van 0,2 milliliter. Voeg vervolgens twee microliter recombinase en ZiMex toe en centrifugeer de twee kort.

Incubeer de reactie gedurende één uur bij kamertemperatuur, voeg vervolgens één microliter Proteinase K-oplossing toe en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius om de reactie te stoppen. Ontdooi vervolgens hitteschokcompetente cellen op ijs. En breng 50 microliter van de cellen over naar een ronde bodempolypropyleenbuis van 14 milliliter.

Voeg één microliter reactieproduct toe aan de cellen en meng voorzichtig. Incubeer de cellen gedurende 20 minuten op ijs. Vervolgens hitteschok de cellen gedurende 45 seconden in een waterbad van 42 graden Celsius voordat de cellen weer op ijs worden teruggeplaatst.

Voeg één milliliter LB-medium toe aan de cellen. En incubeer het monster met schudden gedurende één uur bij 37 graden Celsius. Plaats vervolgens de transformatie op een 10 centimeter agarplaat met ampicilline en incubeer deze een nacht bij 37 graden Celsius.

Voor het begin van de plasmide-zuivering, voegt u ampicilline en 100 milliliter LB-medium toe aan een grote conische kolf. Gebruik vervolgens een inoculatielus om een enkele kolonie van de agarplaat te verwijderen. Dompel de inoculatielus in LB-medium en meng kort, bedek vervolgens de bovenkant van de kolf met aluminiumfolie en incubeer deze een nacht, bij 37 graden Celsius met schudden.

Zuiver vanaf hier het plasmide-DNA met behulp van een standaard Maxiprep plasmide-DNA-zuiveringskit, voordat u doorgaat met transfectie. Zaai eerst HEK 293T-cellen in schalen van 10 centimeter, met 10 milliliter DMEM. Verdun vervolgens 2,5 microgram van elk bimoleculair fluorescentie-complementatievector in 500 microliter transfectiebuffer.

Voeg 10 microliter van het transfectiereagens toe en vortex de mix gedurende 10 seconden. Centrifugeer vervolgens de monsters kort en incubeer ze gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Voeg vervolgens het DNA-transfectiemengsel druppelsgewijs toe aan de schaal.

Vervolgens incubeer de monsters gedurende acht tot 24 uur. Bereid een cellysebuffer en aangevulde cellysebuffer voor zoals beschreven in het tekstprotocol. Was vervolgens de cellen twee keer met ijskoud PBS.

Zuig het PBS af en voeg één millimeter ijskoude aangevulde cellysebuffer toe. Plaats vervolgens de schaal op ijs en incubeer gedurende vijf minuten. Gebruik vervolgens een celschraper om de cellen te verwijderen en breng ze over naar een gekoelde microcentrifugebuis.

Centrifugeer de buis gedurende vijf minuten bij 18.000 keer de zwaartekracht bij vier graden Celsius om het cellulaire puin te verwijderen, en breng vervolgens de heldere supernatant over naar een nieuwe microcentrifugebuis. Was een geschikt volume agarosekralen in één milliliter PBS en centrifugeer de kralen bij 300 keer de zwaartekracht, en verwijder voorzichtig het supernatant. Voeg vervolgens 20 microliter agarosekralen toe aan elk monster.

En incubeer gedurende twee uur bij vier graden Celsius, met einde-aan-eind rotatie. Centrifugeer de kralen bij 300 keer de zwaartekracht en was ze drie keer in cellysebuffer. Plaats vervolgens de gewassen kralen in 50 microliter verdunde monstersbuffer.

Verwarm tenslotte de monsters gedurende twee tot drie minuten bij 95 graden Celsius. In deze studie wordt de BiCAP-methode gebruikt om een positieve interactie voor verschillende eiwittypen te observeren ongeveer 16 uur na co-transfectie van HEK293T-cellen. Confocale microscopie wordt gebruikt om de dimerisatie van de RTKERBB2 aan het plasmamembraan te observeren, en de binding van Ubiquitine aan de E3 ligase UBR5.

Na affiniteitszuivering met de GFB nanobody, kunnen alleen het volledige lengte Venus controle-eiwit, en interacterende V1 en V2 getagde eiwitten worden gedetecteerd in het co-transfectiemonster. Terwijl u deze procedure probeert, vergeet dan niet om de plaatsing van de bimoleculaire fluorescentiecomplementatietag, en of het C-terminale of N-terminale uiteinde van uw eiwit van belang te optimaliseren. Dit is noodzakelijk om een positieve eiwit/eiwit interactie waar te nemen.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de BiCAP-techniek uitvoert, en hoe u deze kunt toepassen op uw eiwitinteractie van belang. Na deze procedure kunnen veel van de downstream karakteriseringstechnieken worden toegepast, zoals ChIPseek om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe dimerisatie van de transcriptiefactoren DNA-binding controleert.