Name: De aanpak in twee stappen om te verkennen van de vroege - en Late-stadia van de vorming van het orgel in de aviaire Model: de zwezerik en de bijschildklier klieren organogenese paradigma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 43 s
Description: Verken een tweestapsaanpak voor orgaanvorming in het aviaire model door in vitro-weefselmanipulatie te combineren met in ovo-transplantatie. Deze methode maakt onderzoek naar vroege en late stadia van organogenese mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs zijn António Cidadão, Isabel Alcobia en Leonor Parreira dankbaar voor de kritische lezing van het manuscript, om Padma Akkapeddi voor video commentaar, en Vitor Proa vanaf de betekening van de histologie van de Instituto de Histologia e Biologia wilt opgeven Desenvolvimento, Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa, voor technische ondersteuning. Wij zijn met name dank verschuldigd Paulo Caeiro en Hugo Silva uit de Unidade de audiovisuais (Unit audiovisuele media), Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa voor hun uitstekende inzet voor de productie van deze video. Wij erkennen Leica Microsystems voor het vriendelijk het verstrekken van een stereoscoop uitgerust met videosysteem en Interaves - Sociedade Agro-Pecuária, S.A om bij te dragen met kwartel eieren bevrucht. Dit werk werd gesteund door Faculdade de Medicina de Lisboa, Universidade de Lisboa (FMUL).

Al deze experimenten volgen de verzorging van de dieren en de ethische richtsnoeren inzake de Centro Académico de Medicina Lisboa.
1. de incubatie van bevruchte kwartels en kippeneieren
<ol><li>Incubeer Japanse kwartel (Coturnix coturnix japonica) en (Gallus gallus) bevruchte kippeneieren 3 en 8 dagen, respectievelijk.<ol>
<li>Plaats de eieren met de luchtkamer (ei botte uiteinde) naar boven in een bevochtigde incubator bij 38 ° C.</li>
		<li>Ongeveer 20 kwarteleitjes en 40 kippeneieren gebruiken voor het uitvoeren van dit experiment. Opmerking: Deze nummers moeten worden verdubbeld bij de vaststelling van deze procedure voor de eerste keer.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. isolatie van embryonale regio kwartel met het vermoedelijke grondgebied van serie- en Parathyroid Rudiments
Opmerking: Uitvoeren ei manipulatie procedures onder steriele omstandigheden met behulp van een horizontale laminar flow hood en gesteriliseerde instrumenten en materialen.
<ol><li>Voorbereiding van een grote borosilicaatglas kom over 3/4 gevuld met koud-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) oplossing.</li>
	<li>Open een kwartel ei na 3 dagen incubatie door te onttrekken van de shell en een cirkelvormige opening aan de andere kant van het botte uiteinde met gebogen schaar af te snijden. Zorgvuldig verwijderen van stukken voor shell en de embryo transfer naar de glazen kom gevuld met koude PBS.</li>
	<li>Houd het embryo kwartel (q) bij E3 (qE3) (de kwartel fase overeenkomt met de HH-fase 21 van de kip) met behulp van dunne pincet. Maak een verlaging in de vitelline membraan onder omslag steken de dooier met gebogen schaar. Blijven om rond en extern aan de omtrek van extra embryonale vaartuigen te snijden.</li>
	<li>Overdracht van het embryo tot een kleine kom ongeveer 3/4 gevuld met koude PBS met de hulp van dunne pincet. Het embryo van de resterende bijgevoegde dooier grondig te wassen.</li>
	<li>Een skimmer gebruiken voor het overbrengen van het embryo tot een 100 mm glazen petrischaal met zwarte basis (Zie Tabel van materialen) met 10 mL koude PBS.</li>
	<li>Plaats de petrischaal onder een stereomicroscoop. Opmerking: Vanaf dit punt naar voren, voer de microchirurgie procedures onder een stereomicroscoop voor progressieve vergroting. Als een bron van de verlichting, is het aangeraden te gebruiken ledverlichting in de stereomicroscoop of opgenomen in de optische vezels, gelet op de beperkte warmtebelasting.</li>
	<li>Houd het embryo naar de onderkant van de plaat met dunne insect pins. Plaats vier pinnen die een vierkante vormen extra embryonale regio.</li>
	<li>Verwijder de extra embryonale membranen van de cephalic regio met de hulp van dunne pincet en plaats een vijfde pin er. Opmerking: Als het embryo correct is geplaatst, vervolgens de otic blaasje, de buis van het hart, en de 1st, 2nden 3rd faryngaal bogen (BK) moet zichtbaar.</li>
	<li>Ontleden de embryonale regio van belang, dat wil zeggen, de 3rd en 4th faryngaal boog regio (3/4PAR), met behulp van Wecker oog schaar.<ol>
<li>Beginnen snijden lengterichting en parallel aan de as van het embryo, tussen de Somiet/neurale buis-gebied en de PAs.</li>
		<li>Verwijder de buis ventrally gepositioneerd hart door te snijden. Houden de schaar in dezelfde positie, draaien de petrischaal te verslepen van het embryo volgens de richting van het deelstuk uitmaakt.</li>
		<li>Gesneden tussen de 2nd en 3rd PAs en onder de 4th PA.</li>
		<li>Loskoppelen van de resterende membranen van de 3/4PAR met behulp van dunne pincet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De geïsoleerde weefsels (de 3/4PAR) en de overdracht kunnen een glazen schotel 3/4 gevuld met koude PBS met behulp van een 2 mL steriele plastic pipet gecombineerd. Opmerking: Hierna weefsels kunnen worden gekweekt in vitro maximaal 48 uur of onmiddellijk worden geënt op de nok van een embryo van de kip op E8.</li>
	<li>Houd de glazen schotel met de geïsoleerde 3/4PAR op ijs tijdens de voorbereiding van de in vitro -assay.</li>
</ol>3. in Vitro Organotypic Assay: cultuur van de embryonale regio met het vermoedelijke grondgebied van serie- en Parathyroid Rudiments
<ol><li>Bereid het kweekmedium met RPMI-1640 Medium aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine. Opmerking: Oplosbare farmacologische reagentia kunnen worden toegevoegd aan het medium (bijvoorbeeld LY-411.575 (Ly) en di-benzazepine of cyclopamine en vismodegib, voor de remming van de Inkeping en egel (Hh) signaling pathways, respectievelijk. Voor deze test, gebruik van 50-200 nM van Ly of 5 tot 15 µM van Di-benzazepine voor de remming van de inkeping signalering in de 3 / 4PAR. het gebruik van 20 µM van cyclopamine of 10 µM van vismodegib voor de remming van de Hh signalering in de 3/4PAR5.</li>
	<li>Voorbereiding van de in vitro cultuur van de explant 3/4PP in een 6-well-plate.<ol>
<li>Vul een goed van de 6-well plaat met 5 mL gestolde voedingsbodem. Plaats een 24 mm polycarbonaat membraan invoegen (Zie Tabel van materialen) op de put met de hulp van dunne pincet.</li>
		<li>Onder de stereomicroscoop, kopieert u de explant 3/4PAR uit de glazen schotel naar de oppervlakte membraan zachtjes glijden met behulp van een transplantatie lepel of spatel, en dun pincet. Plaats de explantaten met de ventrale zijde omhoog en de dorsale zijde in contact met het membraan. Voeg maximaal zeven explantaten per membraan invoegen. Ga verder met stap 3.4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>U kunt ook explants cultuur in drijvende membraanfilters.<ol>
<li>Een 35 mm petrischaal met 5 mL gestolde voedingsbodem voor te bereiden. Met de hulp van dunne Tang, zweven een membraan filter (Zie Tabel van materialen) en houden van een droog oppervlak in contact met lucht.</li>
		<li>Onder de stereomicroscoop, overbrengen in de 3/4PAR explant van de glazen schotel de membraanfilter door zachte glijden met behulp van een transplantatie lepel of spatel, en dun pincet. Plaats de explantaten met de ventrale zijde omhoog en de dorsale zijde in contact met het membraan. Voeg maximaal 8 explantaten per membraanfilter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zorgvuldig plaatst de explantaten bereid in stap 3.2 en 3.3 in een bevochtigde incubator bij 37 ° C met 5% CO2.</li>
	<li>Na een incubatietijd van 48 h, de 6-well-plaat en de 35 mm petrischaal verwijderen uit de incubator.<ol>
<li>De gekweekte explantaten ophalen door het invoegen van de membraan van de 6-well-plaat.<ol>
<li>PBS op kamertemperatuur (RT) aan het membraan invoegen toevoegen.</li>
			<li>Loskoppelen van de explantaten van het membraan door krachtig spoelen met behulp van een 2 mL steriele plastic pipet.</li>
			<li>Met de hulp van de spatel en dunne Tang, breng de gekweekte explantaten naar een glazen schotel 3/4 gevuld met PBS op RT.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ook de gekweekte explantaten van de zwevende membraanfilter in de 35 mm petrischaal verzamelen.<ol>
<li>De membraanfilter met een dunne Tang overbrengen in een petrischaal voor nieuwe 35 mm, gevuld met PBS op RT.</li>
			<li>Loskoppelen van de explantaten uit de membraanfilter door krachtige pipetting met behulp van een 2 mL steriele plastic pipet.</li>
			<li>Met de hulp van dunne Tang, kwijting de explant-vrije membraanfilter nadat het bevestigen dat geen explantaten bleef verbonden.</li>
			<li>Met een spatel en dunne Tang, overbrengen in de explantaten een glazen schotel gevuld met PBS op RT.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>De gekweekte explantaten Pipetteer met behulp van een spatel tot 1 mL van een reagens voor totale RNA isolatie en gebruik voor gen-expressie studies. Let op: Blootstelling aan dit reagens kunnen (Zie Tabel van materialen) een ernstige gezondheidsrisico's. Draag geschikte beschermende brillen, kleding en handschoenen. Volg de instructies van de behandeling en de door de fabrikant verstrekte veiligheidsinformatiebladen gelezen.</li>
	<li>Als alternatief, graft de gekweekte weefsels op CAM van kip embryo's op E8. Volg naar stap 4.</li>
</ol>4. voorbereiding van de CAM
<ol><li>Verwijder de kippeneieren met 8 dagen van embryonale ontwikkeling uit de incubator. Opmerking: Eieren werden geïncubeerd met luchtkamer geconfronteerd met naar boven bij 38 ° C in een bevochtigde incubator.</li>
	<li>Betrekking hebben op het botte uiteinde van het ei met doorzichtige plastic tape om te voorkomen dat stukken van de shell vallen in de luchtkamer. Tik op de shell en snijd een cirkelvormige opening in het ei met een gebogen schaar. De luchtkamer moeten zichtbaar zijn.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig het witte membraan van de luchtkamer met een dunne Tang. CAM is dan zichtbaar en toegankelijk voor ectopische weefseltransplantatie. Opmerking: Gebruik geen PBS om te hydrateren de CAM, vóór of na de transplantatie, aangezien PBS glij- en omdat van de explantaten bevordert. Als het membraan uitdroogt, gooi het ei.</li>
</ol>5. enten van gekweekte explantaten op de CAM
<ol><li>Maak kleine vasculaire laesies/wonden in de kleinere schepen van de CAM met een microscalpel in een houder. Opmerking: Gebruik het puntje van een pipet van Pasteur te verwijderen van bloed door capillariteit in het geval van overtollige bloeden.</li>
	<li>Gebruik een spatel en dunne Tang de gekweekte explant overbrengen naar de gewonde gebied van de CAM.</li>
	<li>Knip een stukje van een filtreerpapier iets groter dan de explant en plaats deze op de bovenkant van de explant. Opmerking: Het koffiefilter helpt het bijhouden van de locatie explant na haar ontwikkeling in de CAM. Ook het dagelijkse drug levering aan de explant gedurende toe in ovo ontwikkeling, indien nodig (beschreven in stap 5.6).</li>
	<li>Zegel van het ei-venster met doorzichtige plastic tape en identificeren met behulp van een houtskool potlood. Opmerking: De plastic tape beschermt het embryo tegen uitdroging tijdens de incubatieperiode.</li>
	<li>Het gemanipuleerde ei Incubeer gedurende 10 dagen in een bevochtigde incubator bij 38 ° C. Volg naar stap 6.</li>
	<li>Optionele stap: Dagelijkse drug administration tijdens de incubatieperiode.<ol>
<li>Om het filter te benaderen, gedeeltelijk til de plastic tape. Voeg 100 µL van drug oplossing, druppel voor druppel, op de top van het papier. Opnieuw verzegelen het venster en plaats het ei terug in de bevochtigde incubator bij 38 ° C. Opmerking: Voor deze test, de dosis van 20 µM van cyclopamine zal remmen Hh signalering tijdens in ovo ontwikkeling5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. ectopische orgel vorming in de CAM na 10 dagen In Ovo ontwikkeling
<ol><li>Na 10 dagen incubatie, verwijder het ei uit de incubator en zorgvuldig trekken de plastic tape.</li>
	<li>Snijd de CAM rond de regio van de filter met gebogen schaar en overdracht de CAM afkomstige explant met filtreerpapier aan een klein glas bowl ongeveer 3/4 gevuld met koude PBS.</li>
	<li>Met de hulp van dunne verlostang overbrengen in de CAM-afgeleide explant een 100 mm petrischaal met zwarte basis met 10 mL PBS. Het koffiefilter en de overdaad aan membraan met behulp van Wecker oog schaar en dunne pincet voorzichtig te verwijderen.</li>
	<li>De CAM-explant overbrengen kleefpoeders oplossing (3,7% PFA in PBS) met een schuimspaan. De kip embryo's zonder ze te verwijderen uit het ei door het maken van een nauwkeurig knippen in de regio van de nek van het embryo met de hulp van grote schaar euthanaseren.</li>
	<li>De vorming van het orgel in paraffine secties van de CAM verkregen explantaten beoordelen door conventionele histologie en immunohistochemistry.</li>
</ol>

<ol><li>Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nogent+Institute-50+years+of+embryology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The Nogent Institute-50 years of embryology.</a> Int J Dev Biol. 49 (2-3), 85-103 (2005).</li>
<li>Chuong, C. M., Wu, P., Plikus, M., Jiang, T. X., Bruce Widelitz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+stem+cells+into+organs%3A+topobiological+transformations+demonstrated+by+beak%2C+feather%2C+and+other+ectodermal+organ+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Engineering stem cells into organs: topobiological transformations demonstrated by beak, feather, and other ectodermal organ morphogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 72, 237-274 (2006).</li>
<li>Davey, M. G., Tickle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+as+a+model+for+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">The chicken as a model for embryonic development.</a> Cytogenet Genome Res. 117 (1-4), 231-239 (2007).</li>
<li>Nowak-Sliwinska, P., Segura, T., Iruela-Arispe, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chicken+chorioallantoic+membrane+model+in+biology%2C+medicine+and+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">The chicken chorioallantoic membrane model in biology, medicine and bioengineering.</a> Angiogenesis. 17 (4), 779-804 (2014).</li>
<li>Figueiredo, M., Silva, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+and+Hedgehog+in+the+thymus%2Fparathyroid+common+primordium%3A+Crosstalk+in+organ+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Notch and Hedgehog in the thymus/parathyroid common primordium: Crosstalk in organ formation.</a> Dev Biol. 418 (2), 268-282 (2016).</li>
<li>National Research Council. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+6+-+Recent+Advances+in+Developmental+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Frontiers+in+Developmental+Toxicology+and+Risk+Assessment%22%5BJournal%5D)">Chapter 6 - Recent Advances in Developmental Biology.</a> Scientific Frontiers in Developmental Toxicology and Risk Assessment. , The National Academies Press. Washington, DC. (2000).</li>
<li>Moura, R. S., Coutinho-Borges, J. P., Pacheco, A. P., Damota, P. O., Correia-Pinto, J. <a target="_blank" href="http://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0017660">FGF signalling pathway in the developing chick lung: expression and inhibition studies.</a> PLoS One. 6 (3), e17660(2011).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Morphol%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> J. Morphol. 88, 49-92 (1951).</li>
<li>Takahashi, Y., Bontoux, M., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelio-mesenchymal+interactions+are+critical+for+Quox+7+expression+and+membrane+bone+differentiation+in+the+neural+crest+derived+mandibular+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Epithelio-mesenchymal interactions are critical for Quox 7 expression and membrane bone differentiation in the neural crest derived mandibular mesenchyme.</a> EMBO J. 10 (9), 2387-2393 (1991).</li>
<li>Maeda, Y., Noda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+development+of+embryonic+long+bone+on+chorioallantoic+membrane+in+ovo+prevents+perichondrium-derived+suppressive+signals+against+cartilage+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Coordinated development of embryonic long bone on chorioallantoic membrane in ovo prevents perichondrium-derived suppressive signals against cartilage growth.</a> Bone. 32 (1), 27-34 (2003).</li>
<li>Ishida, K., Mitsui, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bioengineered+feather+buds+on+a+reconstructed+chick+skin+from+dissociated+epithelial+and+mesenchymal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Growth+Differ%22%5BJournal%5D)">Generation of bioengineered feather buds on a reconstructed chick skin from dissociated epithelial and mesenchymal cells.</a> Dev Growth Differ. 58 (3), 303-314 (2016).</li>
<li>Le Douarin, N. M., Jotereau, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/239088">Tracing of cells of the avian thymus trough embryonic life in interspecific chimeras.</a> J. Exp. Med. 142, 17-40 (1975).</li>
<li>Farley, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+thymus+organogenesis+and+colonization+in+early+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dynamics of thymus organogenesis and colonization in early human development.</a> Development. 140, 2015-2026 (2013).</li>
<li>Gordon, J., Bennett, A. R., Blackburn, C. C., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gcm2+and+Foxn1+mark+early+parathyroid-+and+thymus-specific+domains+in+the+developing+third+pharyngeal+pouch%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Gcm2 and Foxn1 mark early parathyroid- and thymus-specific domains in the developing third pharyngeal pouch.</a> Mech Dev. 103, 141-143 (2001).</li>
<li>Neves, H., Dupin, E., Parreira, L., Le Douarin, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Bmp4+signalling+in+the+epithelial-mesenchymal+interactions+that+take+place+in+early+thymus+and+parathyroid+development+in+avian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Modulation of Bmp4 signalling in the epithelial-mesenchymal interactions that take place in early thymus and parathyroid development in avian embryos.</a> Dev Biol. 361 (2), 208-219 (2012).</li>
<li>Jerome, L. A., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DiGeorge+syndrome+phenotype+in+mice+mutant+for+the+T-box+gene%2C+Tbx1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">DiGeorge syndrome phenotype in mice mutant for the T-box gene, Tbx1.</a> Nat Genet. 27 (3), 286-291 (2001).</li>
<li>Nie, X., Brown, C. B., Wang, Q., Jiao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Bmp4+from+the+Tbx1+expression+domain+causes+abnormal+pharyngeal+arch+artery+and+cardiac+outflow+tract+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Bmp4 from the Tbx1 expression domain causes abnormal pharyngeal arch artery and cardiac outflow tract remodeling.</a> Cells Tissues Organs. 193 (6), 393-403 (2011).</li>
<li>Zou, D., Silvius, D., Davenport, J., Grifone, R., Maire, P., Xu, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+of+the+third+pharyngeal+pouch+into+thymus%2Fparathyroid+by+Six+and+Eya1%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Patterning of the third pharyngeal pouch into thymus/parathyroid by Six and Eya1.</a> Dev Biol. 293 (2), 499-512 (2006).</li>
<li>Uematsu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+in+ovo.+chorioallantoic+membrane+engraftment+to+culture+testes+from+neonatal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Med%22%5BJournal%5D)">Use of in ovo. chorioallantoic membrane engraftment to culture testes from neonatal mice.</a> Comp Med. 64 (4), 264-269 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een cruciaal aspect voor het succes van deze methode is de kwaliteit van zowel de kip en kwartel eieren. Gezien de lange incubatietijd tussenliggende perioden, met name in de in ovo assay, een goede kwaliteit van kippeneieren verbetert tarieven levensvatbaarheid (tot 90%) aan het einde van de procedure. Om dit te bereiken, test u eieren van verschillende leveranciers. Unmanipulated eieren Incubeer gedurende lange perioden (maximaal 16-17 dagen) en controleren van hun ontwikkeling. Meer dan 80% van de embryo's di...

Aviaire embryo's hebben wijd gebruikt in rudimentaire ontwikkelingsbiologie studies. De belangrijkste voordelen van het aviaire model omvatten de mogelijkheid om te openen het ei, de relatief makkelijke toegang tot het embryo en de mogelijkheid voor het uitvoeren van micromanipulation. Voorbeelden omvatten de klassieke kwartel-kip chimera-systeem voor het bestuderen van de cel lot1, toepassing van de specifieke factoren die de groei naar de embryo2, en de groei van ectopische cellulaire structuren in de CAM1,3, 4.
Als u nieuwe inzichten in de verschillende fasen van de formatie van het orgel, hebben we onlangs een methode die praktijk technieken met in vitro manipulatie van embryonale weefsels5 combineertontwikkeld. De aanpak in twee stappen kan de discriminatie en de exploratie van beide vroege - en late-stadia van organogenese, die vaak beperkt als gevolg van de zeer dynamische en complexe weefsel interacties2. Bovendien, het gebrek aan geschikte weefsel-specifieke markeringen vaak beperkt het gebruik van genetisch gemodificeerde diermodellen6. Deze nieuwe methode van de aanpak in twee stappen overwint grotendeels dergelijke beperkingen.
Om te studeren beginstadia van orgel vorming, in de eerste stap is de kwartel embryonale grondgebied bestaande uit de grondbeginselen van de toekomstige orgel geïsoleerd en gekweekt in een in vitro organotypic systeem voor 48 uur. Tijdens deze periode kan de farmacologische modulatie van specifieke signaalroutes door toevoeging van drugs aan het kweekmedium5,7worden uitgevoerd. Bovendien, gekweekte weefsels kunnen worden verzameld in elk stadium van de groei in vitro en peilden voor gen-expressie (met behulp van methoden zoals microarrays, qPCR, enz.).
In de tweede stap, 48 h-gekweekte weefsels zijn dan geënt op de nok van een embryo van de kip (c) ten embryonale dage (E) 8 (cE8) (Hamburger en Hamilton (HH)-stadia van 33-35)8. De CAM gedraagt zich als een vasculaire leverancier van voedingsstoffen en laat gas uitwisseling1,3,4 te geënte weefsels zijn ontwikkeling in ovo inschakelen voor langere tijd. Deze experimentele stap is vooral geschikt om te studeren van late-stadia van organogenese, als volledig gevormde organen kunnen worden verkregen na 10 dagen ovo ontwikkeling5,9,10,11 . Morfologische analyse is gemakkelijk uitgevoerd door conventionele histologie te bevestigen goede orgel vorming en donor oorsprong van cellen kan worden geïdentificeerd door immunohistochemistry met soortspecifieke antilichamen (d.w.z., MAb kwartel PeriNuclear (QCPN)). Tijdens de incubatietijd van de CAM, kunnen transplantaties ook worden gekweekt in aanwezigheid van farmacologische agenten en verzameld in elk stadium van ontwikkeling te evalueren van de voortgang van de organogenese.
De aanpak in twee stappen, die hier worden beschreven in de diepte, is reeds werkzaam zijn in de Figueiredo et al. 5 om te verkennen de aviaire bijschildklier/zwezerik gemeenschappelijk primordium ontwikkeling. Dienovereenkomstig, zal de inherente bijzonderheden van de embryonale gebieden en stadia van ontwikkeling betrokken is in de organogenese van de thymus en bijschildklier klieren hieronder worden gepresenteerd.
De zwezerik en de bijschildklier klieren epitheel, ontlenen maar functioneel distinct, de endoderm van de faryngaal zakjes (PP)12. In vogels, het epitheel van deze organen zijn afkomstig uit de derde en vierde PP endoderm (3/4PP)12, terwijl bij zoogdieren de serie epitheel is afgeleid van de 3PP en het epitheel van de bijschildklier klieren is afgeleid van de 3PP en 3/4PP in de muis en de mens, respectievelijk13,14.
Een van de vroegste stadia in de vorming van deze organen is de opkomst van discrete zwezerik en parathyroid domeinen in de gemeenschappelijke primordium. In kip, kunnen deze domeinen worden geïdentificeerd door in situ hybridisatie, met specifieke moleculaire markers, op E4.515. Ontwikkeling opbrengst, deze orgel rudiments individualiseren en scheiden van de keelholte, terwijl een dunne mesenchymale capsule, gevormd door neurale crest-afgeleide cellen, hen (bij E5 omringt; HH-stage 27). Later is de serie epitheel gekoloniseerd door hematopoïetische voorlopercellen (op E6.5; HH-stage 30)12.
Zoals in de klassieke studies van kwartel-kip1,12is de aanpak in twee stappen met name nuttig zijn te onderzoeken van de vorming van hematopoietische/lymfoïde organen, namelijk de thymus5. Zoals de kwartel, met de grondbeginselen van het orgel explant, is geënt in het embryo van de kip voorafgaand aan de kolonisatie van hematopoïetische voorlopercellen cel, wordt een chimeer thymus gevormd met kip bloed overgedragen voorlopercellen infiltreren van een kwartel serie epitheliale tegenhanger. Deze methode is dus een nuttig instrument om te verkennen van de bijdrage van hematopoietische cellen in de ontwikkeling van de aviaire hemato/lymfoïde systeem.

<table><tbody><tr><td>Kippenbevruchte eieren (Gallus gallus)</td><td>Pintobar, Portugal</td><td></td><td>Pluimveehouderij&nbsp;</td></tr><tr><td>Kwartelvingebevruchtde eieren (Coturnix coturnix)</td><td>Interaves, Portugal</td><td></td><td>Vogelboerderij&nbsp;</td></tr><tr><td>15 mL PP centrifugebuizen</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>50 mL PP centrifugebuizen</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>60 x 20 mm pyrex schalen</td><td>Duran group</td><td>21 755 41</td><td></td></tr><tr><td>100 x 20 mm pyrex schalen</td><td>Duran group</td><td>21 755 48</td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonaat membraaninzetstuk&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3412</td><td>24 mm transwell met 0,4 mm membraaninzetstuk van poreus polycarbonaat&nbsp;</td></tr><tr><td>Membraanfilter</td><td>Millipore</td><td>DTTP01300</td><td>0,6 mm Isopore membraanfilter</td></tr><tr><td>6-wels kweekplaten</td><td>Nunc, Thermo Fisher Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal, 35 x 10 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5112&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex schalen</td><td></td><td></td><td>van de supermarkt&nbsp;</td></tr><tr><td>Overdrachtpipetten</td><td>Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific</td><td>2041S</td><td>2 mL kunststofpipet</td></tr><tr><td>Glazen pasteurpipet</td><td>normax</td><td>5426015</td><td></td></tr><tr><td>Whatman&nbsp;kwalitatief filterpapier</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA1001090</td><td>Filterpapier</td></tr><tr><td>Doorzichtige kunststoftape</td><td></td><td></td><td>van de supermarkt&nbsp;</td></tr><tr><td>Cytokeratine (pan; zuur en basaal, type I en II cytokeratines), clone Lu-5</td><td>BMA Biomedicals</td><td>T-1302</td><td></td></tr><tr><td>Cyclopaminhydraat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4116</td><td>Farmacologische remmer van Hh-signalering</td></tr><tr><td>Fetaal runderserum</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Standaard FBS</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)</td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>QCPN antilichaam</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td>QCPN</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX-supplement&nbsp;</td><td>GIBCO, Thermo Fisher Scientific</td><td>61870010</td><td></td></tr><tr><td>Bluesil RTV141A/B Silicone Elastomer 1.1Kg Kit</td><td>ELKEM/Silmid</td><td>RH141001KG</td><td>Om de achterkant van de petrischaal voor te bereiden</td></tr><tr><td>Stemolecule LY411575</td><td>Stemgent</td><td>04-0054</td><td>Farmacologische remmer van Notch-signalering</td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>Reagens voor totale RNA-isolatie</td></tr><tr><td>Dumont #5 pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30&nbsp;</td><td>Dijnetjes pincet</td></tr><tr><td>Extra fijne Bonn schaar, gebogen</td><td>Fine Science Tools</td><td>14085-08</td><td>Gebogen schaar</td></tr><tr><td>Insectenspelden&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-30</td><td></td></tr><tr><td>Microspatula&nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10087-12</td><td>Transplantatielepel</td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td>Microscalpel</td></tr><tr><td>Moria vernikkelde pinhouder</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td>Houdje</td></tr><tr><td>Moria geperforeerde lepel</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-17</td><td>Schep</td></tr><tr><td>Wecker oogschaar</td><td>Fine Science Tools</td><td>15010-11</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>MC170 HD</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscoop</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>Leica M80</td><td></td></tr><tr><td>Microscoop</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td>DM2500</td><td></td></tr></tbody></table>

de aanpak in twee stappen om te verkennen van de vroege - en late-stadia van de vorming van het orgel in de aviaire model: de zwezerik en de bijschildklier klieren organogenese paradigma

Two-step Approach to Explore Early- and Late-stages of Organ Formation in the Avian Model: The Thymus and Parathyroid Glands Organogenesis Paradigm

De aviaire embryo, is als een experimenteel model, van het grootste belang voor baanbrekende ontdekkingen in Ontwikkelingsbiologie. Onder de verschillende benaderingen, de vorming van kwartel-kip Chimaera en het gebruik van het chorion membraan (CAM) te ondersteunen van de ontwikkeling van ectopische weefsels dateren uit de vorige eeuw. Tegenwoordig, biedt de combinatie van deze klassieke technieken met recente in vitro methoden nieuwe perspectieven om orgel vorming verder te verkennen.
Hier beschrijven we een aanpak in twee stappen om te bestuderen van de vroege - en late-stadia van organogenese. Kortom, de embryonale regio met het vermoedelijke grondgebied van het orgel is geïsoleerd van kwartel embryo's en gekweekt in vitro in een organotypic systeem (max. 48 uur). Gekweekte weefsels zijn vervolgens geënt op de nok van een embryo van de kip. Na 10 dagen in ovo ontwikkeling, worden volledig gevormde organen geënte weefsels verkregen. Deze methode maakt het ook mogelijk de modulering van de trajecten door de regelmatige toediening van farmacologische agenten en de genetische manipulatie weefsel in in vitro en in ovo ontwikkelingsstadia signalering. Bovendien kan ontwikkelen weefsels worden verzameld op een tijd-venster om hun-genexpressie profiel (met behulp van kwantitatieve PCR (qPCR), microarrays, etc.) en morfologie (beoordeeld met conventionele histologie en Immunochemie) te analyseren.
De beschreven experimentele procedure kan worden gebruikt als een instrument om te volgen orgel vorming buiten het aviaire embryo, van de vroege stadia van de organogenese volledig gevormd en functionele organen.

De hierboven beschreven gegevens-protocol een methode waarmee het onderzoek van zowel vroege - en late-stadia van organogenese, vaak beperkt door complexe cellulaire en moleculaire interacties.
Deze methode was eerder werkzaam in Figueiredo e.a. 5 te ontrafelen van de rol van Inkeping en Hh signalering in de aviaire bijschildklier/zwezerik gemeenschappelijk primordium ontwikkeling.
<p class="...

Dit artikel bevat een bijgewerkte aanpak van de klassieke kwartel-kip chimera systeem te bestuderen van de vorming van het orgel, door het combineren van nieuwe in vitro en in ovo experimentele procedures.

De aanpak in twee stappen om te verkennen van de vroege - en Late-stadia van de vorming van het orgel in de aviaire Model: de zwezerik en de bijschildklier klieren organogenese paradigma

The avian embryo, as an experimental model, has been of utmost importance for seminal discoveries in developmental biology. Among several approaches, the ...

Het algemene doel van deze procedure is om een tweedelige aanpak te bieden om de vroege en late stadia van organogenese te bestuderen door in vitro manipulatie van embryonale weefsels te combineren met in ovo grafttechnieken met behulp van het aviaire model. Bij deze methode wordt het embryonale gebied dat de toekomstige orgaanrudiment bevat, geïsoleerd en gedurende 48 uur in een organotypisch systeem gekweekt. Door de normale ontwikkeling na te bootsen, biedt deze in vitro-aanpak gemakkelijke toegang tot embryonale gebieden zonder de noodzaak van specifieke moleculaire markers en maakt het experimentele manipulatie van vroege ontwikkelingsstadia in orgaanvorming mogelijk die afhankelijk zijn van zeer dynamische ruimtelijke modificaties en complexe weefselinteracties.Vervolgens worden gekweekte weefsels getransplanteerd op de chorioallantoïsche membraan van een kippenembryo. De chorioallantoïsche membraan gedraagt zich als een vasculaire leverancier van voedingsstoffen en maakt gasuitwisseling mogelijk met de getransplanteerde weefsels, waardoor de ontwikkeling in ovo mogelijk wordt. Deze stap is vooral geschikt om late stadia van organogenese te bestuderen, aangezien volledig gevo

two-step-approach-to-explore-early-late-stages-organ-formation-avian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Deze video toont de dissectie en verwijdering van de foetale thymus en de voorbereiding van de ex vivo kweken van 2-dGuo behandeld thymus.

Bereiding van 2-dGuo behandelde Thymus Organ culturen

Dit protocol beschrijft de dissectie van embryonale schildklier aanleg bij muizen en de kweek van explantaten op semiporeuze filters of op plastic dia's voor microscopie. Dit systeem is ideaal om morfogenetische of differentiatiegebeurtenissen te bestuderen die plaatsvinden tijdens de schildklierontwikkeling van wildtype of knockout embryo's, en is geschikt voor gain- en loss-of-function experimenten.

Een<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultuur Systeem om Schildklier Development Study

Hier presenteren we een organotypic kweken protocol om te groeien van embryonale kip organen in vitro. Met deze methode kan de ontwikkeling van embryonale kip weefsel worden bestudeerd, met behoud van een hoge mate van controle over de omgeving van de cultuur.

Organotypic cultuur methode om te studeren van de ontwikkeling van embryonale kip weefsels

Dit artikel bevat een methode voor het isoleren van pure embryonale weefsels van kwartel en kip embryo's die kunnen worden samengevoegd tot ex vivo chimeer organen.

Isolatie van embryonale weefsels en vorming van kwartel-kip chimeer organen met behulp van het voorbeeld van de Thymus

Dit werk beschrijft twee methoden voor het bestuderen van orgaanontwikkeling, een verbeterde xenotransplantatie-opstelling op chorioallantoïsch membraan (CAM) van vogelembryo's die vascularisatie van gekweekte embryonale organen en organoïden mogelijk maakt en een nieuwe vaste z-richting orgaankweekmethode met gewijzigde experimentele omstandigheden die hoge resolutie time-lapse confocale beeldvorming mogelijk maakt.

Optimalisatie van nierorganoïde en organotypic cultuur voor vascularisatie, uitgebreide ontwikkeling en verbeterde microscopie beeldvorming

Het kuiken is een kosteneffectief, toegankelijk en algemeen beschikbaar modelorganisme voor verschillende onderzoeken. Hier wordt een reeks protocollen beschreven om de moleculaire mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en regeneratie van het aviaire binnenoor.

In Ovo en Ex Ovo methoden om aviaire binnenoorontwikkeling te bestuderen

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de transplantatie van nierorganoïden in de celomische holte van kippenembryo's. Deze methode induceert vascularisatie en verbeterde rijping van de organoïden binnen 8 dagen en kan worden gebruikt om deze processen op een efficiënte manier te bestuderen.

Efficiënte vascularisatie van nierorganoïden door intracelomische transplantatie in kippenembryo's

Hier beschrijven we protocollen voor drie soorten vogelembryonale huidexplantatieculturen die kunnen worden gebruikt om weefselinteracties te onderzoeken, 4D-beeldvorming timelapse-film (3D plus tijd), globale of lokale verstoring van de moleculaire functie en karakterisering van systeembiologie.

Explantaten van de vogelhuid gebruiken om weefselpatronen en organogenese te bestuderen

Hier presenteren we een protocol om menselijke hersenorganoïden in meerdere rijpingsstadia te enten in het chorioallantoïsche membraan (CAM) van het kuiken. Hersenorganoïden werden gekweekt volgens ongeleide gestandaardiseerde protocollen.

Vroege ongeleide menselijke hersenorganoïde neurovasculaire nichemodellering in het toegeeflijke kuikenembryo chorioallantoïsch membraan

Het Xenopus laevis-embryo blijft uiterst nuttig in de studie van vroege ontwikkeling vanwege zijn grote omvang en gemakkelijke manipulatie.   Er wordt een vereenvoudigd protocol voor volledige montage in situ hybridisatie gegeven dat kan worden gebruikt bij de identificatie van specifieke organen in dit modelsysteem.

Inzicht in de vroege organogenese Met behulp van een vereenvoudigd<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie Protocol in<em&gt; Xenopus</em

Verken een tweestapsaanpak voor orgaanvorming in het aviaire model door in vitro-weefselmanipulatie te combineren met in ovo-transplantatie. Deze methode maakt onderzoek naar vroege en late stadia van organogenese mogelijk.

De aanpak in twee stappen om te verkennen van de vroege - en Late-stadia van de vorming van het orgel in de aviaire Model: de zwezerik en de bijschildklier klieren organogenese paradigma (Video) | JoVE Journal

De aanpak in twee stappen om te verkennen van de vroege - en Late-stadia van de vorming van het orgel in de aviaire Model: de zwezerik en de bijschildklier klieren organogenese paradigma

Meer video's verkennen