Isolatie en cultuur van knaagdier Microglia ter bevordering van een dynamische vertakt morfologie in serumvrij Medium

Het algemene doel van dit celcultuurprotocol is om zeer pure culturen van microglia uit zich ontwikkelende of volwassen knaagdieren te genereren die kunnen worden onderhouden zonder blootstelling aan serum. Deze procedure kan helpen om belangrijke vragen in de neurowetenschappen te beantwoorden met betrekking tot microgliamorfologie, fibreuze ketosis en de interactie van microglia met andere CNS-celtypen. Het grote voordeel van dit protocol is dat microglia snel kunnen worden geïsoleerd uit knaagdierweefsel van elke leeftijd en kunnen worden gekweekt zonder blootstelling aan serum.

Om de hersenen te verwijderen, snijd de occipitale condyle van het ruggenmerg van een dier aan beide kanten met dissectiescharen, zorg ervoor dat je de hersenen niet beschadigt. Snijd vervolgens de huid langs de bovenkant van de schedel en snijd langs de ene kant naar de pariëtale en frontale botten richting het neusbeen. Trek voorzichtig de bovenkant van de schedel met een pincet naar achteren, verwijder snel de hersenen en plaats ze in voorgekoelde DPBS op ijs.

Herhaal de procedure voor alle overgebleven dieren. Nadat de hersenen in koude DPBS zijn verzameld, snijd elk brein in blokjes van één millimeter in een petrischaal op ijs met een koude scalpel en breng ze over naar een ijskoude dounce homogenisator met vijf tot zeven milliliter ijskoud homogenisatiebuffer. Gebruik vervolgens een loszittende dounce homogenisator om het weefsel te dissociëren met 10 tot 20 zachte en onvolledige streken.

Zorg ervoor dat je het weefsel niet direct verplettert op de bodem van de homogenisator. In plaats daarvan, drijft het weefsel door de ruimte tussen de zijden van de zuiger en de homogenisator. Het is belangrijk om het weefsel langzaam te homogeniseren met meerdere rondes van douncing om de levensvatbaarheid van microglia te behouden.

Vervolgens verwijder je voorzichtig de zuiger om luchtbellen te voorkomen. Laat slecht gedissocieerde weefselbrokken naar de bodem van de homogenisator zakken en breng de supernatant over naar een nieuwe, gekoelde, 50 milliliter kegelvormige buis. Vervolgens vervang je het verwijderde volume met verse homogenisatiebuffer en herhaal je de dissociatieprocedure gedurende in totaal drie tot vier rondes, of totdat al het weefsel is gedissocieerd.

Voeg in deze procedure ijskoud homogenisatiebuffer toe aan de 50 milliliter kegelvormige buis met de celsuspensie en pas het totale volume aan tot 33,5 milliliter. Voeg vervolgens 10 milliliter MSB toe aan de celsuspensie en meng grondig door de buis meerdere keren te keren. Dit resulteert in een 23% eindconcentratie van MSB in een volume van 43,5 milliliter.

Centrifugeer de cellen vervolgens gedurende 15 minuten bij 500 x g bij 4 graden Celsius met langzaam remmen. Verwijder vervolgens de bovenste laag myeline en puin en de supernatant met een pipette. Wees voorzichtig bij het verwijderen van de bovenste laag om ervoor te zorgen dat zoveel mogelijk wordt verwijderd.

Resuspendeer vervolgens de cellen in 12 milliliter panningbuffer. Tritureer de celsuspensie voorzichtig om eventuele resterende celklonten te breken. In deze stap, passeer de celsuspensie door een 70 micrometer celstrainer om grote puinhopen of celklonten te verwijderen.

Spoel de OX42 gecoate panningplaat drie keer met DPBS. Laat de plaat niet volledig drogen tussen de wasbeurten. Giet de laatste DPBS-was af en breng de gefilterde celsuspensie aan op de panningplaat.

Zwiep zachtjes met de plaat om de cellen te verdelen. Bewaar vervolgens de plaat op een vlakke ondergrond bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten om de cellen te laten hechten. Incubeer niet langer dan 20 minuten, anders worden de cellen erg moeilijk te recupereren van de plaat.

Spui vervolgens de panningplaat tien keer met DPBS om niet-adherente cellen te verwijderen. Microglia zullen stevig aan de plaat zijn gehecht, dus zweep de plaat bij elke spoeling om de verwijdering van andere niet-adherente cellen te verzekeren. Giet de laatste DPBS-was af en vervang met 15 milliliter DPBS en 200 microliter trypsine.

Om de cellen te trypsiniseren, incubeer de plaat gedurende maximaal 10 minuten bij 37 graden Celsius. Na 10 minuten van trypsinisatie zullen microglia nog steeds aan de plaat vastzitten. Giet het mengsel af en was de plaat twee keer voorzichtig met DPBS om de trypsine te verwijderen.

Vervolgens vervang met 12 milliliter ijskoud MGM. Plaats vervolgens de panningplaat twee minuten op ijs om de interactie tussen cel en substraat te verzwakken en zorg ervoor dat de plaat vlak is om uitdroging van delen van de panningplaat te voorkomen. Pipet daarna krachtig met een 10 milliliter pipet en pipetcontroller op hoge snelheid om cellen van de panningplaat te recupereren.

Teken een 16 bij 16 raster met de stroom vloeistof van de pipet om te proberen alle cellen te verwijderen. Het is belangrijk om een balans te vinden tussen de algehele celrecuperatie en de gezondheid van uw cultuur. Herhaald pipeteren van de cellen tegen de panningplaat zal resulteren in verminderde levensvatbaarheid van uw cultuur.

Controleer de cellen onder een microscoop bij 20x vergroting om er zeker van te zijn dat ze zich hebben losgemaakt van de plaat. Markeer de plekken bovenop de plaat waar cellen vastzitten en herhaal het pipeteren in die gebieden. Verzamel de celsuspensie en verdeel drie tot vier milliliter supernatant in elke 15 milliliter kegelvormige buis.

Centrifugeer het gedurende 15 minuten bij 500 x g bij vier graden Celsius met langzame remming. Na 15 minuten, aspireer de supernatant, laat 0,5 milliliter MGM achter met de cellenpellet. Spuit vervolgens elke pellet in het resterende MGM en trek de cellen uit alle buizen.

Tel vervolgens de cellen met een hemocytometer. Beschilder nu 15 microliter collageen IV-coating direct in het midden van een 24-well anionische kationische gecoate weefselcultuurplaat en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Na het tellen van de cellen met een hemocytometer, verdun ze tot 2,3