Nieuwe passieve methoden voor de snelle productie van optische transparantie in hele CNS weefsel wissen
8 mei 2018
Hier presenteren we twee nieuwe methodologieën, psPACT en mPACT, voor het bereiken van maximale optische transparantie en latere microscopische analyse van weefsel therapieën in het intact knaagdier hele CNS.
Het algemene doel van deze psPACT- en mPACT-methoden is het snel klaren van heel CNS-weefsel zonder de noodzaak van een elektroforetisch weefselklaringssysteem. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het onderzoeksmodel voor humane ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer of letsel en degeneratie en tumorgenese. Het grote voordeel van deze techniek is dat het CNS-weefsel van de muis niet wordt beschadigd door de elektroforetische weefselklaring en het wordt snel geklaard door gewijzigde passieve klaring.
We kregen het idee voor deze methode nadat we de originele PACT- en vorige methode voor hersenklaring hadden gebruikt. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien psPACT- en mPACT-methoden moeilijk uit te voeren zijn omdat deze methode meerdere stadia van monstervoorbereiding heeft. Begin met het bereiden van de PACT-cocktailoplossing door VA-044-poeder toe te voegen aan een oplossing van 4%PFA en 4%acrylamide bij een uiteindelijke concentratie van 0,25%. Nadat de weefsels met PACT-oplossing zijn geperfundeerd, dompelt u de hele hersenen en het ruggenmerg volledig onder in een buisje van 50 milliliter dat gekoelde PACT-oplossing bevat, en bewaar het gedurende 24 uur op vier graden Celsius.
24 uur later, brengt u het weefsel over naar een buisje van 50 milliliter met verse, koude PACT-oplossing, en sluit u de buisdop aan op een weefselgel-hybridisatiesysteem, aangesloten op een stikstoftank en ingesteld op 37 graden Celsius. Schakel vervolgens de vacuüm en het gas gedurende 10 minuten in om het monster in stikstofgas in te bedden. Om de hydrogel te polymeriseren, plaatst u het buisje met het monster in een schudende incubator ingesteld op 150 rpm en 37 graden Celsius gedurende drie uur of tot de polymerisatie voltooid is.
Na de incubatie, gebruikt u blottingpapier om de resterende gepolymeriseerde hydrogel rond de weefsels te verwijderen. Breng vervolgens het weefsel over naar een buisje van 50 milliliter met klaringsoplossing. Plaats het monster in een schudende incubator ingesteld op 37 graden Celsius en 150 rpm totdat het weefsel is geklaard.
Gemiddeld duurt het ongeveer 20 dagen voordat het CNS van de muis volledige helderheid bereikt. Begin psPACT met het CNS van een muis geperfundeerd met 4%PFA die is post-gefixeerd in 4%PFA bij vier graden Celsius gedurende 24 uur. Was het gefixeerde weefsel gedurende een uur in 0,1 molair PBS.
Na het wassen, brengt u het weefsel over naar A4P0-oplossing en incubeert u het gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius. De volgende dag, na het weefsel gedurende vijf minuten in PBS te hebben gewassen, dompelt u het weefsel in 0,25% VA-044 in PBS en incubeert u het gedurende zes tot 24 uur bij 37 graden Celsius. Het scheiden van de acrylamid- en daaropvolgende VA-044-stap vermijdt de noodzaak om resterende ongepolymeriseerde hydrogelmonomeren die het weefsel omringen te verwijderen, wat de uiteindelijke weefselintegriteit na het bereiken van transparantie met PACT kan aantasten.
Na de incubatie, brengt u de weefsels over naar verse, koude VA-044-oplossing. Beweeg vervolgens het monster gedurende 10 minuten in stikstofgas. Breng het weefsel over naar klaringsoplossing.
Beweeg vervolgens het monster in een schudende incubator ingesteld op 37 graden Celsius en 150 rpm totdat het weefsel is geklaard. Gemiddeld duurt het ongeveer 17 dagen voordat het CNS van de muis volledige helderheid bereikt. Voor mPACT volgt u het protocol voor psPACT tot aan de klaringsoplossingstap.
Breng vervolgens de weefselklaringsoplossing die 0,5%alpha-thioglycerol, een on-bruiningsmiddel, bevat, naast 8%SDS in 0,1 molair PBS, volledig onder. Plaats het monster in een schudende incubator ingesteld op 37 graden Celsius en 150 rpm totdat het weefsel is geklaard. Gemiddeld duurt het slechts twee weken voordat het CNS van de muis volledige helderheid bereikt met behulp van mPACT.
In het huidige onderzoek bereikten muizenhersenmonsters die via het mPACT-protocol werden behandeld optische transparantie na 14 dagen, voorafgaand aan monsters die via de PACT- en psPACT-protocolen werden behandeld. Rat-gehele CNS-monsters geklaard door mPACT bereikten maximale klaring na 20 dagen. Alleen volwassen rattenhersenen, in tegenstelling tot het hele CNS, werden in slechts vijf dagen met mPACT geklaard.
Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in twee weken worden uitgevoerd met het hele CNS van de muis als deze correct wordt uitgevoerd. Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van neurowetenschappen en anatomie om pathofysiologische ziekten te onderzoeken, zoals weefselletsel, ontwikkelingsmisvormingen, kanker en neurodegeneratieve ziekten in zoogdier-CNS-modellen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie introduceert twee innovatieve methodologieën, psPACT en mPACT, om de optische transparantie te verbeteren en microscopische analyse van intacte bloedvaten in het centrale zenuwstelsel (CZS) van knaagdieren te faciliteren. De technieken zijn erop gericht om volledig CZS-weefsel snel te klaren zonder het te beschadigen, om zo cruciale vragen te beantwoorden met betrekking tot menselijke ziektemodellen zoals de ziekte van Alzheimer en tumorigenese.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Weefselverduنيningstechnieken
- Microscopische beeldvorming
Achtergrond
- De studie bouwt voort op eerdere methoden en belicht de beperkingen van elektroforetische weefselverheldering.
- Benadrukt de noodzaak van snelle en effectieve verhelderingsprocessen voor CNS-weefsel van knaagdieren.
- Biedt oplossingen voor zowel fundamenteel onderzoek als klinische implicaties binnen de neurowetenschappen.
Doel van de studie
- Om psPACT en mPACT te ontwikkelen en te valideren als efficiënte protocollen voor het transparant maken van CNS-weefsel.
- Om de mogelijkheden voor onderzoekers die neuropathologische aandoeningen bestuderen uit te breiden.
- Om een betere visualisatie van de weefselvasculatuur in het CNS te faciliteren.
Gebruikte methoden
- De methoden omvatten een meerstaps protocol voor het prepareren en klaren van CNS-weefsel met behulp van PACT-oplossingen.
- Belangrijke biologische modellen omvatten CNS-monsters van muizen en ratten, met een focus op het bereiken van optische transparantie.
- psPACT duurt over het algemeen ongeveer 20 dagen voor volledige helderheid, terwijl mPACT dit in ongeveer 14 dagen kan bereiken.
- Gespecialiseerde oplossingen en incubatieomgevingen worden gebruikt voor polymerisatie- en klaringsprocessen.
Belangrijkste resultaten
- mPACT biedt een aanzienlijke vermindering van de tijd die nodig is voor weefselklaring in vergelijking met traditionele methoden.
- Monsters behandeld met mPACT vertoonden optische transparantie binnen een korter tijdsbestek, wat wijst op een verbeterde efficiëntie voor onderzoeksapplicaties.
- De technieken blijken effectief bij het faciliteren van de studie naar diverse neurologische aandoeningen.
Conclusies
- Deze studie maakt een snelle en efficiënte transparantie (clearing) van CNS-weefsel mogelijk, waardoor de onderzoeksmogelijkheden in het veld van de neurowetenschappen worden verbeterd.
- De nieuwe methodologieën dienen als waardevolle instrumenten voor het onderzoeken van ziektemechanismen en weefselbeschadiging.
- De implicaties voor het begrijpen van neurodegeneratieve ziekten en het verbeteren van pathologische studies via geavanceerde beeldvormingstechnieken zijn aanzienlijk.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Nieuwe passieve clearingsmethoden zoals psPACT en mPACT pakken een kritieke flessenhals in neurowetenschappelijk R&D aan door snelle, getrouwe optische transparantie van volledig CZS-weefsel mogelijk te maken zonder elektroforetische schade. Deze mogelijkheid ondersteunt doelvalidatie en mechanische risicovermindering in modellen voor neurodegeneratieve ziekten door de subcellulaire architectuur te behouden terwijl de imaging-tijdlijnen worden versneld. De technieken vergroten het voorspellende vertrouwen in preklinische studies naar Alzheimer, tumorigenese en letselmodellen door een verbeterde visualisatie van neuropathologische fenotypen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen in intacte CZS-modellen mogelijk door subcellulaire structuren en celcircuits te behouden voor studies naar target-interactie.
- Operationele waarde: Vermindert artefacten bij weefselverwerking die geassocieerd worden met elektroforetische klaring, waardoor de reproduceerbaarheid van fenotypische screeningresultaten wordt verbeterd.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door duidelijkere read-outs van neurodegeneratieve progressie in ziekterelevante systemen te bieden.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert gestandaardiseerde, transparante CNS-preparaten die geschikt zijn voor hoge-resolutie imaging van subcellulaire biomarkers en padmodulatie.
- Operationele waarde: Elimineert de noodzaak voor gespecialiseerde elektroforetische apparatuur, waardoor de drempel voor de implementatie van assays binnen discovery-teams wordt verlaagd.
- Schaalbaarheid: mPACT bereikt helderheid van het muizen-CNS in ~14 dagen, wat voorspelbare tijdlijnen mogelijk maakt voor compound-screeningcampagnes.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Translationele continuïteit: Faciliteert een naadloze overgang van ontdekking naar preklinische validatie door de weefselintegriteit te behouden voor longitudinale studies naar tumorigenese en ontwikkelingsafwijkingen.
- Mechanistische risicoreductie: Maakt visualisatie van subcellulaire structuren in pathologische weefsels mogelijk, waardoor ambiguïteit bij de interpretatie van het doelmechanisme wordt verminderd.
- Getrouwheid van het ziektemodel: Ondersteunt een consistente klaring van het centraal zenuwstelsel over verschillende knaagdiersoorten (muis/rat), wat de vergelijkbaarheid tussen studies voor de veiligheidsfarmacologie verbetert.
Pipeline- & Workflowintegratie
psPACT en mPACT passen binnen het continuüm van vroege ontdekking tot preklinisch onderzoek, waarbij ze specifiek doelwitvalidatie ondersteunen tot aan lead-optimalisatie door het leveren van kwantificeerbare, beeldvormingsgeschikte CNS-modellen.
- Discovery Biology: Maakt hypothesetoetsing mogelijk via 3D-mapping van eiwitexpressie en celdistributie in intact weefsel, waardoor de betrokkenheid van signaalpaden in ziektemodellen wordt verduidelijkt.
- Screening: Levert reproduceerbare, kwantitatieve weefselpreparaten die een gestandaardiseerde evaluatie ondersteunen van de effecten van verbindingen op de architectuur van het CZS.
- Analytics: Genereert imaging-outputs met een hoge resolutie waarmee teams structurele veranderingen tussen behandelingscondities kunnen vergelijken met een verbeterde signaal-ruisverhouding.
- Translationeel onderzoek: Handhaaft proteomische en structurele continuïteit van de ontdekkingsfase tot en met de preklinische stadia, wat de afstemming van biomarkers bij neurodegeneratie- en letselmodellen ondersteunt.
- Enterprise hergebruik: Vestigt een herbruikbaar CZS-clearingsplatform dat toepasbaar is op meerdere projecten die neuropathologie bestuderen, waardoor redundante methodeontwikkeling wordt verminderd.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit te verminderen via visualisatie van intact weefsel.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid door variabele elektroforetische parameters en afhankelijkheden van apparatuur te vermijden.
- Strategische waarde: Verbetert de efficiëntie van go/no-go-beslissingen door de generering van preklinische gegevens voor kandidaten gericht op het centrale zenuwstelsel te versnellen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van neurodegeneratie- en oncologieprogramma's mogelijk door snellere en duidelijkere fenotypische read-outs.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in weefselhistologie, hydrogelchemie en de uitvoering van incubatieprotocollen voor het beheren van de meerstaps monsterpreparatie.
- Afhankelijk van schudincubatoren, stikstofgassystemen en temperatuurgecontroleerde omgevingen voor de polymerisatiefasen van de hydrogel en de clearing-fasen.
- Vereist standaardisatie tussen teams voor de bereiding van oplossingen (bijv. VA-044, SDS-concentraties) en tijdbeheersing om de reproduceerbaarheid tussen laboratoria te garanderen.
- Aanpassing aan niet-CZS-weefsels (bijv. nier, milt) vereist validatie van de clearing-tijden en structurele preservatie, zoals vermeld in het bronmateriaal.
- Praktische beperking: Het succes van het protocol hangt af van een nauwkeurige uitvoering vanwege de meerdere preparatiestappen, waarbij afwijkingen kunnen leiden tot onvolledige clearing of weefselschade.
