Name: Nieuwe passieve methoden voor de snelle productie van optische transparantie in hele CNS weefsel wissen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Ontdek psPACT en mPACT voor snelle optische transparantie van intact CNS-weefsel bij muizen en ratten. Deze passieve methoden versnellen het wissen tot 14 dagen zonder elektroforetische schade.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de hersenen Korea 21 PLUS Project voor de medische wetenschap, Yonsei Universiteit. Dit werk werd bovendien gesteund door een subsidie van de National Research Foundation Korea (NRF-2017R1D1A1B03030315).

Alle procedures zijn goedgekeurd door de ethische commissie van de onderzoeksopzet aan Yonsei University College of Medicine. Alle proefdieren worden opgeofferd overeenkomstig de richtsnoeren van de Commissie van de dierenverzorgers laboratorium aan Yonsei University College of Medicine.
1. bereiding van reagentia
Let op: Paraformaldehyde (PFA), acrylamide en natrium dodecyl sulfaat (SDS) zijn giftig irriterende stoffen en dus moet worden behandeld in een zuurkast met passende persoonlijke beschermingsmiddelen (PPE; laboratoriumjas, handschoenen, beschermende brillen).
<ol><li>4% acrylamide (A.A) oplossing (A4P0): Voeg toe 20 mL 40% acrylamide oplossing tot 180 mL 0,1 M met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
	<li>0,25% VA-044 oplossing: Voeg toe 0,5 g 2,2´-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride (VA-044) poeder tot 200 mL 0,1 M met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Terwijl de VA-044-poeder kan bij kamertemperatuur worden opgeslagen, moet het worden opgeslagen bij 4 ° C op solubilisatie in PBS. Voor de beste resultaten alleen de hoeveelheid oplossing die nodig zijn voor het experiment te bereiden.</li>
	<li>PACT cocktail oplossing: Voeg 10 g van acrylamide tot 225 mL van 4% paraformaldehyde (PFA)-oplossing en pas het volume aan 200 mL met 4% PFA. Toevoegen vóór gebruik, VA-044 poeder 100 mg tot 40 mL van het mengsel in een conische tube van 50 mL.</li>
	<li>PACT oplossing buffer wissen: 40 g natrium dodecyl sulfaat (SDS) aan 350 mL 0,1 M PBS toevoegen en regel het volume met 0,1 M PBS tot 500 mL. MPACT clearing oplossing, voegt toe 0,5% α-thioglycerol aan het PACT oplossing buffer clearing.</li>
	<li>De muizen gebruikt in deze studie waren 2-week-oude BALB mannelijke muizen; de ratten gebruikt in deze studie werden 2 weken oude mannelijke SD-ratten.</li>
</ol>2. narcose en perfusie chirurgie
Let op: PFA acrylamide zijn giftig irriterende stoffen en dus moeten worden behandeld in een zuurkast met passende PPE.
<ol><li>Anesthetize het dier in een pathogenen vrije kamer met 30 mg/kg zoletil met behulp van een injectiespuit 1 mL met een 26-gauge naald. Controleren van het dier voor 5-10 min.</li>
	<li>Zodra het dier een chirurgische vliegtuig van de verdoving bereikt, de teen-snuifje reactie-methode te gebruiken om te bepalen van de diepte van de verdoving. Bevestigen van apathie. Opmerking: De volgende stappen waarbij muis en rat chirurgie volgen een vergelijkbaar protocol dat wordt gebruikt in een eerdere studie11.</li>
	<li>Maak een incisie van 5-6 cm onder de ribbenkast, door middel van de omhulling en de buikwand.</li>
	<li>Gebogen, botte schaar gebruik te maken van een sneetje in het middenrif, Palperende het thoracale gebied om te zoeken op de site van incisie vooraf.</li>
	<li>De incisie uitbreidt tot de hele lengte van de ribbenkast bloot van de pleura holte.</li>
	<li>Zorgvuldig verdringen de longen. Het maken van een cut door middel van de ribbenkast tot het sleutelbeen. Met behulp van iris schaar, maken een kleine snede aan de achterste einde van het linkerventrikel. Een 18-gauge bot - of olijf-tipped perfusie naald invoegen door de oplopende aorta, passeren de gesneden ventrikel.</li>
	<li>Beveilig de naald en voorkomen lekkage door klemmen van het hart met een hemostat. U kunt een gemodificeerde hemostat klem de aorta rond de naald-tip.</li>
	<li>Maak een grote incisie in de juiste atrium, verzorgen om minimale schade aan de aflopende aorta. De rat is nu klaar voor perfusie.</li>
</ol>3. hele perfusie en dissectie van de Rat
Let op: PFA acrylamide zijn giftig irriterende stoffen en dus moeten worden behandeld in een zuurkast met passende PPE.
Opmerking: De volgende stappen van de hele perfusie zijn een vergelijkbaar met een protocol dat wordt gebruikt in een eerdere studie door Woo et al.. (2016) 10 , 11.
<ol><li>Het recht atrium van hart aan een 18-gauge-naald, verzorgen om eventuele luchtbellen niet koppelen.</li>
	<li>Met een 50 mL injectiespuit, snel en gelijkmatig pomp 50 mL koude 0,1 M PBS oplossing met heparine (10 eenheden/mL).</li>
	<li>De 18-gauge naald verbinden met de buis van de peristaltische pomp.</li>
	<li>Wassen met 200 mL koud 0,1 M PBS oplossing met heparine (10 eenheden/mL) met een omloopsnelheid van 10 mL/min.</li>
	<li>Fix met 250 mL koude 4% PFA-oplossing met een omloopsnelheid van 10 mL/min. De rat moet in dit stadium stijf zijn.</li>
	<li>Verzamelen en opslaan van de resterende PFA-oplossing voor verwijdering.</li>
	<li>Perfuse weefsels met een gekoelde cocktail PACT-oplossing van 4% PFA, 4% acrylamide en 0,25% VA-044 poeder met een 18-gauge naald PACT, en verwijder vervolgens het hoofd en wervelkolom. De schedel bloot doordat een insnijding van de middellijn vanaf de nek tot de neus. Deze extra perfusie stap is niet nodig voor de methoden psPACT en mPACT; na fixatie, onmiddellijk isoleren van het hoofd en wervelkolom en bloot de schedel.</li>
	<li>De basis van de schedel bloot door het verwijderen van alle resterende nek en rug spier.</li>
	<li>Gebruik rongeurs en schaar te schillen weg de schedel. Verwijderen de hersenen en het ruggenmerg.</li>
	<li>Opslaan van het weefsel in 4% PFA bij 4 ° C; weefsels kunnen worden opgeslagen voor maximaal 1 week.</li>
</ol>4. Hydrogel monomeer infusie en polymerisatie van de Rat en muis CNS
Let op: Acrylamide SDS, α-thioglycerol en de PFA zijn irriterende stoffen en dus moeten worden behandeld in een zuurkast en met passende plassen.
<ol><li>
PACT (Passive Clearing techniek)
	<ol>
<li>Isoleren en cultuur het hele centraal zenuwstelsel (hersenen en ruggenmerg) uit vaste muizen en ratten aan een tube van 50 mL met een gekoelde cocktail PACT-oplossing van 4% PFA, 4% acrylamide, en 0,25% VA-044 poeder en bewaren bij 4 ° C voor 24 h. Zorg ervoor dat het weefsel volledig is ondergedompeld in de s olution.</li>
		<li>Insluiten van het monster in stikstofgas voor 10 min met behulp van een tissue gel hybridisatie systeem verbonden met een stikstof tank: Stel het systeem in op 37 ° C. Weefsels overbrengen in een tube van 50 mL met verse koud (4 ° C) PACT cocktail oplossing en sluit met buis GLB, dan zet het vacuüm.</li>
		<li>Om het polymeriseren de hydrogel, plaatst u de buis met het monster in een schudden incubator (150 rpm, 37 ° C) gedurende 3 uur, of totdat de polymerisatie voltooid is.</li>
		<li>Met behulp van Vloeipapier (Zie Tabel of Materials), verwijder het resterende gepolymeriseerde hydrogel omringende weefsels.</li>
		<li>Het weefsel overbrengen in een tube van 50 mL met clearing oplossing (8% SDS in 0,1 M PBS, pH 8,0).</li>
		<li>Leg het monster in een schudden incubator ingesteld op 37 ° C en 150 rpm totdat het weefsel is gewist. Gemiddeld duurt het ongeveer 20 dagen voor de muis CNS om volledige duidelijkheid.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
psPACT (verwerken aparte passieve Clearing-techniek)
	<ol>
<li>Isoleren van het hele centraal zenuwstelsel (hersenen en ruggenmerg) met een bot mes en schaar van PFA-vaste muizen en ratten op een schone bankje.</li>
		<li>Overdracht van weefsels voor een tube van 50 mL met 4% PFA, en bewaren bij 4 ° C voor 24 h. zorgen ervoor dat het weefsel volledig is ondergedompeld in het fixeer.</li>
		<li>Wassen van het vast weefsel voor 1 h in 0,1 M PBS en vervolgens overbrengen naar A4P0 oplossing (4% acrylamide in 0,1 M PBS). Winkel bij 37 ° C gedurende 24 uur.</li>
		<li>Het weefsel gedurende 5 minuten wassen in 0,1 M PBS.</li>
		<li>Dompel het weefsel in 0,25% VA-044 in 0,1 M PBS. Opslaan bij 37 ° C gedurende 6-24 h, en vervolgens overbrengen naar verse 0,25% VA-044/PBS oplossing.</li>
		<li>Insluiten van het monster in stikstofgas voor 10 min met behulp van een tissue gel hybridisatie systeem (Zie Tabel van materialen) aangesloten op een stikstof tank: weefsels overbrengen in een tube van 50 mL verse koud (4 ° C) met 0,25% VA-044/PBS-oplossing, en verbinden met buis GLB. Schakel in het vacuüm.</li>
		<li>Overbrengen in het weefsel oplossing (8% SDS in 0,1 M PBS, pH 8,0) wissen.</li>
		<li>Incubeer het monster in een schudden incubator ingesteld op 37 ° C en 150 rpm totdat het weefsel is gewist. Gemiddeld duurt het ongeveer 17 dagen voor muis CNS om volledige duidelijkheid.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
mPACT (gemodificeerde passieve Clearing techniek)
	<ol>
<li>Isoleren van het hele centraal zenuwstelsel (hersenen en ruggenmerg) met een bot mes en schaar van PFA-vaste muizen en ratten op een schone bankje.</li>
		<li>Stappen 4.2.2 - 4.2.8 van het psPACT-protocol.</li>
		<li>Overbrengen in het weefsel clearing oplossing. Merk op dat in tegenstelling tot het PACT en psPACT protocollen, mPACT vereist een clearing-oplossing bestaande uit 0,5% α-thioglycerol naast 8% SDS in 0,1 M PBS, pH 8,0. Α-thioglycerol is een door de VN browning agent waarmee sprake is van een weefsel duidelijk meer snel en effectief. Zorg ervoor dat het weefsel volledig is ondergedompeld in de oplossing.</li>
		<li>Leg het monster in een schudden incubator ingesteld op 37 ° C en 150 rpm totdat het weefsel is gewist. Gemiddeld duurt het ongeveer 2 weken voor muis CNS om volledige duidelijkheid.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. brekingsindex Matching en immunokleuring van gewiste CNS
Opmerking: nvelgen (Nycodenz gebaseerde Refractive Index Matching oplossing) bestaat uit 0,8 g/mL Nycodenz poeder opgelost in 30 mL base buffer (0,01% natriumazide en Tween-20 in 0,1 M PBS, pH 8,0). Het wordt aanbevolen dat de oplossing is geplaatst in een 37 ° C incubator te voorzien van de juiste Solvatatie van het poeder te schudden.
<ol><li>Incubeer weefsels in 0,1% Triton X-100 in 0,1 M PBS voor 2 h, dan blokkeren met 2% bovien serumalbumine (BSA) in 0,1 M PBS voor 6 uur.</li>
	<li>Secties in PBST driemaal wassen (0,1% Tween-20 in 0,1 M PBS) voor 2 h. Stain secties met primaire antilichamen (in dit geval, een antilichaam voor anti-konijn-PECAM-CD31, die vlekken bloedvaten) voor 2 dagen.</li>
	<li>Vlek secties met secundaire antilichamen (in dit geval een geit anti-konijn IgG Cy3 fluorescerende geconjugeerde) in 2% BSA voor 2 dagen.</li>
	<li>Wash label weefsels driemaal in PBST gedurende 2 uur, en op te slaan in 15 mL nvelgen voor 2-10 dagen.</li>
	<li>Voor imaging, door gelabelde weefsels naar een kleine hoeveelheid nvelgen op 35 - of 60-mm weefselkweek gerechten te verplaatsen. Fix met siliconen rond de onderkant van de schotel.</li>
	<li>Voeg 1,5-2 mL verse nvelgen.</li>
</ol>6. de beeldverwerking
<ol><li>Verwerven van beelden van gewiste weefsels met tegel scannen met behulp van een confocale laser scanning microscopewith 10 x vergroting (Zie Tabel van materialen). Gebruik voor Cy3-geëtiketteerden weefsel, golflengten van 550-600 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+brain+imaging%3A+A+powerful+tool+for+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience.</a> Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).</li>
<li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+reveals+dynamics+of+ovarian+follicular+architecture+and+vasculature+in+three-dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions.</a> Sci Rep. 7, 44810(2017).</li>
<li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology%2C+CLARITY%2C+to+intact+solid+organs+including+brain%2C+pancreas%2C+liver%2C+kidney%2C+lung%2C+and+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Dev Biol. 14, 48(2014).</li>
<li>Jensen, K. H. R., Berg, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+perspectives+in+tissue+clearing+using+CLARITY%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY.</a> J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).</li>
<li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+tissue+clearing+%28PACT%29%3A+Technical+evaluation+and+new+perspectives+in+immunofluorescence%2C+histology%2C+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Sci Rep. 6, 34331(2016).</li>
<li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Exp Mol Med. 48 (12), 274(2016).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li>
<li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+clearing+of+the+mouse+central+nervous+system+using+passive+CLARITY%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+A+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Choi, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+the+receptor+for+advanced+glycation+end+products+in+neurons+and+astrocytes+in+a+triple+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Exp Mol Med. 46, 75(2014).</li>
<li>Chang, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contralaterally+transplanted+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells+%28ENStem-A%29+migrate+and+improve+brain+functions+in+stroke-damaged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats.</a> Exp Mol Med. 45, 53(2013).</li>
<li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+differential+plaque+depositions+in+the+brains+of+Tg2576+and+Tg-APPswe%2FPS1dE9+transgenic+mouse+models+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease.</a> Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).</li>
<li>Kinameri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prdm+proto-oncogene+transcription+factor+family+expression+and+interaction+with+the+Notch-Hes+pathway+in+mouse+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis.</a> PLoS One. 3 (12), e3859(2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Terwijl de passieve, niet-elektroforetische extractiemethoden werkzaam verbeterd PACT aanzienlijk de consistentie bereikt met vorige weefsel clearing methoden zoals duidelijkheid2,,3,,4,7 , 8, de techniek draagt nog steeds een aantal tekortkomingen, de meest urgente van die de lengte van de benodigde tijd is voor het bereiken van maximale weefsel duidelijkheid...

Een fundamentele doelstelling van wetenschappelijke en klinische onderzoek omvat het bereiken van een volledig inzicht in de structuur van het orgel en functie; echter dient de buitengewoon complexe aard van zoogdieren organen vaak als een barrière voor het volledig bereiken van deze doelstelling1. DUIDELIJKHEID (duidelijk lipide-uitgewisseld Acrylamide-gekruist rigide Imaging-compatibele Tisssue-hYdrogel)2,3,4, waarbij de opbouw van een hybride acrylamide gebaseerde hydrogel uit intact weefsels, behaalt optische Goedkeuringvande allerlei organen, met inbegrip van de hersenen, lever en milt, met behoud van hun structurele integriteit5. DUIDELIJKHEID heeft dus niet alleen de visualisatie, maar ook de mogelijkheid om complexe cellulaire netwerken en weefsel morphologies zonder de noodzaak voor afdelen fijn te ontleden.
Met het oog op goedkeuring van het weefsel, hanteert duidelijkheid elektroforetische methodes te verwijderen van het vetgehalte van het monster bij de hand. Terwijl duidelijkheid is opgemerkt voor de productie van fysiek stabiele weefsel-hydrogel hybriden, studies hebben aangetoond dat het gebruik van elektroforetische weefsel clearing (ETC) methoden variabele resultaten in termen van kwaliteit van weefsel levert, met inbegrip van bruinen, epitoop schade, en eiwit verlies5,6. Om deze kwesties te behandelen, geweest gewijzigde protocollen zoals PACT (passieve duidelijkheid techniek), waarbij de enz behandeling wordt vervangen door een passieve, Ionische-wasmiddel op basis delipidation-techniek, ontwikkelde7,8,9. Ondanks het bereiken van een grotere samenhang van resultaten, vereist PACT echter meer tijd om te verkrijgen maximale klaring. Bovendien, geen van deze technieken hebben nog zijn toegepast bij het hele CNS-formulier of in grotere modellen, knaagdieren zoals ratten en cavia's.
De huidige studie tracht te stellen deze beperkingen door het voorstellen van nieuwe methodologieën, psPACT (proces-aparte PACT) en mPACT (gemodificeerde PACT), ter vergemakkelijking van de snelle goedkeuring van het hele CNS en inwendige organen in zowel muis en rat modellen10. Specifiek, psPACT verwerkt weefsels in 4% acrylamide en 0,25% VA-044 uitgebracht in twee afzonderlijke stappen tijdens hydrogel vorming; mPACT hoofdzakelijk omvat de dezelfde stappen, maar vormt een aanvulling op de clearing SDS gebaseerde oplossing met 0,5% α-thioglycerol als een belangrijk reagens. Beide technieken benutten de endogene systemische en hersen bloedsomloop systems om aanzienlijk minder tijd nodig voor de productie van optische klaring. Als een bewijs van beginsel tonen wij het gebruik van de confocal microscopie bloedvat patronen in de gewiste weefsels10analyseren.

<table><tbody><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Affymetrix, Inc.</td><td>75819</td><td>Clearing solution</td></tr><tr><td>Nycodenz</td><td>Axia-Shield</td><td>1002424</td><td>nRIMS solution</td></tr><tr><td>40% Acrylamide Solution</td><td>Bio Rad Laboratories, Inc.</td><td>161-0140</td><td>Polymerization (A4P0)</td></tr><tr><td>2,2&acute;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>017-19362</td><td>Polymerization (VA-044)</td></tr><tr><td>1-Thioglycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1753-100ML</td><td>Clearing solution (mPACT)</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Georgiachem</td><td>9005-64-5</td><td>nRIMS solution</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-50ML</td><td>Immuno Staining</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Bovogen</td><td>BSA100</td><td>Immuno Staining</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Merck Millipore</td><td>375095</td><td>Perfusion (PBS)</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td>nRIMS solution</td></tr><tr><td>PECAM-CD31 antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td><td>sc-28188</td><td>Immuno Staining</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td><td>111-165-003</td><td>Immuno Staining</td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td>Tech &amp; Innovation</td><td>BPP-9004</td><td>Perfusion, Polymerization</td></tr><tr><td>20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4)</td><td>Tech &amp; Innovation</td><td>BPB-9121</td><td>Perfusion, Buffer</td></tr><tr><td>10 mL stripette</td><td>Coatar</td><td>4488</td><td>Solution transfer</td></tr><tr><td>50 mL tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>Clearing tube</td></tr><tr><td>35 mm Cell culture dish</td><td>SPL</td><td>20035</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Confocal dish</td><td>SPL</td><td>211350</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>Korea vaccine Co., Ltd</td><td>26G 1/2</td><td>Anesthetize&nbsp;</td></tr><tr><td>50 mL syringe</td><td>Korea vaccine Co., Ltd</td><td>21G1 1/4</td><td>Perfusion</td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td>Polymerization (A4P0)</td></tr><tr><td>Whatman 3MM paper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z270849</td><td>Blotting paper for gel removal</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM780</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>ZEN lite Software</td><td>Zeiss</td><td>ZEN 2012</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Longerpump</td><td>BT100-1F</td><td>Perfusion</td></tr><tr><td>EasyGel</td><td>Lifecanvas Technologies</td><td>EasyGel</td><td>Tissue gel hybridization system</td></tr></tbody></table>

nieuwe passieve methoden voor de snelle productie van optische transparantie in hele cns weefsel wissen

Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Sinds de ontwikkeling van duidelijkheid, een bioelectrochemical clearing techniek die het mogelijk maakt voor toewijzing van de driedimensionale fenotype binnen transparante weefsels, een veelheid van nieuwe clearing methodologieën, met inbegrip van CUBIC (de weergave van de duidelijke, unobstructed hersenen cocktails en computationele analyse), schakelaar (systeembrede controle van interactie tijd) en kinetiek van chemische stoffen, kaart (vergrote analyse van het proteoom), PACT (passieve duidelijkheid techniek), zijn opgezet en verder uit te breiden de bestaande toolkit voor de microscopische analyse van biologische weefsels. De huidige studie is gericht op het verbeteren en optimaliseren van de oorspronkelijke PACT procedure voor een matrix van intact knaagdier weefsel, met inbegrip van de hele centrale zenuwstelsel (CNS), de nieren, de milt, en de hele muis embryo's. PsPACT (proces-aparte PACT) en mPACT (gemodificeerde PACT) genoemd, dienen deze nieuwe technieken als zeer doeltreffend middel om mapping cel circuits en visualiseren van subcellular structuren in intact normale en pathologische weefsels. In het volgende protocol bieden wij een gedetailleerde, stapsgewijze overzicht over het bereiken van maximale weefsel goedkeuring met minimale invasie van hun structurele integriteit via psPACT en mPACT.

Generatie van een transparant model voor de hele CNS met behulp van geoptimaliseerde passieve clearing technieken
Optische Goedkeuringvande muis en rat hele CNS weefsels snel tot stand gekomen met behulp van diverse technieken van de passieve clearing (Figuur 1). Een schematische voorstelling van weefsel wissen na verloop van tijd wordt weergegeven in figuur 2A<...

Hier presenteren we twee nieuwe methodologieën, psPACT en mPACT, voor het bereiken van maximale optische transparantie en latere microscopische analyse van weefsel therapieën in het intact knaagdier hele CNS.

Nieuwe passieve methoden voor de snelle productie van optische transparantie in hele CNS weefsel wissen

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Het algemene doel van deze psPACT- en mPACT-methoden is het snel klaren van heel CNS-weefsel zonder de noodzaak van een elektroforetisch weefselklaringssysteem. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in het onderzoeksmodel voor humane ziekten, zoals de ziekte van Alzheimer of letsel en degeneratie en tumorgenese. Het grote voordeel van deze techniek is dat het CNS-weefsel van de muis niet wordt beschadigd door de elektroforetische weefselklaring en het wordt snel geklaard door gewijzigde passieve klaring.We kregen het idee voor deze methode nadat we de originele PACT- en vorige methode voor hersenklaring hadden gebruikt. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien psPACT- en mPACT-methoden moeilijk uit te voeren zijn omdat deze methode meerdere stadia van monstervoorbereiding heeft. Begin met het bereiden van de PACT-cocktailoplossing door VA-044-poeder toe te voegen aan een oplossing van 4%PFA en 4%acrylamide bij een uiteindelijke concentratie van 0,25%. Nadat de weefsels met PACT-oplossing zijn geperfundeerd, dompelt u de hele hersenen en het ruggenmerg volledig onder in een buisje van 50 milliliter dat gekoelde PACT-oplossing bevat, en bewaar het gedurende 24 uur op vier graden Celsius.24 uur later, brengt u het weefsel over naar een buisje van 50 milliliter met verse, koude PACT-oplossing, en sluit u de buisdop aan op een weefselgel-hybridisatiesysteem, aangesloten op een stikstoftank en ingesteld op 37 graden Celsius. Schakel vervolgens de vacuüm en het gas gedurende 10 minuten in om het monster in stikstofgas in te bedden. Om de hydrogel te polymeriseren, plaatst u het buisje met het monster in een schudende incubator ingesteld op 150 rpm en 37 graden Celsius gedurende drie uur of tot de polymerisatie voltooid is.Na de incubatie, gebruikt u blottingpapier om de resterende gepolymeriseerde hydrogel rond de weefsels te verwijderen. Breng vervolgens het weefsel over naar een buisje van 50 milliliter met klaringsoplossing. Plaats het monster in een schudende incubator ingesteld op 37 graden Celsius en 150 rpm totdat het weefsel is geklaard.Gemiddeld duurt het ongeveer 20 dagen voordat het CNS van de muis volledige helderheid bereikt. Begin psPACT met het CNS van een muis geperfundeerd met 4%PFA die is post-gefixeerd in 4%PFA bij vier graden Celsius gedurende 24 uur. Was het gefixeerde weefsel gedurende een uur in 0,1 molair PBS.Na het wassen, brengt u het weefsel over naar A4P0-oplossing en incubeert u het gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius. De volgende dag, na het weefsel gedurende vijf minuten in PBS te hebben gewassen, dompelt u het weefsel in 0,25% VA-044 in PBS en incubeert u het gedurende zes tot 24 uur bij 37 graden Celsius. Het scheiden van de acrylamid- en daaropvolgende VA-044-stap vermijdt de noodzaak om resterende ongepolymeriseerde hydrogelmonomeren die het weefsel omringen te verwijderen, wat de uiteindelijke weefselintegriteit na het bereiken van transparantie met PACT kan aantasten.Na de incubatie, brengt u de weefsels over naar verse, koude VA-044-oplossing. Beweeg vervolgens het monster gedurende 10 minuten in stikstofgas. Breng het weefsel over naar klaringsoplossing.Beweeg vervolgens het monster in een schudende incubator ingesteld op 37 graden Celsius en 150 rpm totdat het weefsel is geklaard. Gemiddeld duurt het ongeveer 17 dagen voordat het CNS van de muis volledige helderheid bereikt. Voor mPACT volgt u het protocol voor psPACT tot aan de klaringsoplossingstap.Breng vervolgens de weefselklaringsoplossing die 0,5%alpha-thioglycerol, een on-bruiningsmiddel, bevat, naast 8%SDS in 0,1 molair PBS, volledig onder. Plaats het monster in een schudende incubator ingesteld op 37 graden Celsius en 150 rpm totdat het weefsel is geklaard. Gemiddeld duurt het slechts twee weken voordat het CNS van de muis volledige helderheid bereikt met behulp van mPACT.In het huidige onderzoek bereikten muizenhersenmonsters die via het mPACT-protocol werden behandeld optische transparantie na 14 dagen, voorafgaand aan monsters die via de PACT- en psPACT-protocolen werden behandeld. Rat-gehele CNS-monsters geklaard door mPACT bereikten maximale klaring na 20 dagen. Alleen volwassen rattenhersenen, in tegenstelling tot het hele CNS, werden in slechts vijf dagen met mPACT geklaard.Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in twee weken worden uitgevoerd met het hele CNS van de muis als deze correct wordt uitgevoerd. Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van neurowetenschappen en anatomie om pathofysiologische ziekten te onderzoeken, zoals weefselletsel, ontwikkelingsmisvormingen, kanker en neurodegeneratieve ziekten in zoogdier-CNS-modellen.

novel-passive-clearing-methods-for-rapid-production-optical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Hier beschrijven we een snelle en eenvoudige methode om de afbeelding fluorescent gelabelde cellen in semi-dikke hersenen plakken. Door de vaststelling van, snijden, en optisch clearing hersenweefsel beschrijven we hoe standaard epifluorescerende of confocale beeldvorming kan worden gebruikt om individuele cellen en neuronale netwerken binnen intact zenuwweefsel te visualiseren.

Een snelle aanpak van High-Resolution Imaging fluorescentie in Semi-Dik Brain Slices

Optische klaringstechnieken revolutioneren de manier waarop weefsels worden gevisualiseerd. In dit rapport beschrijven we aanpassingen van het oorspronkelijke Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol dat consistentere en goedkopere resultaten oplevert.

Optische Clearing van de Muis centrale zenuwstelsel met passieve DUIDELIJKHEID

ACT-PRESTO (actieve duidelijkheid techniek drukgerelateerde efficiënte en stabiele overdracht van macromoleculen in organen) maakt een snelle, efficiënte, maar goedkope weefsel clearing en snelle antilichaam penetratie in de weefsels ontruimd door passieve diffusie of druk bijgestaan ​​levering. Met behulp van deze methode, kan een breed scala van weefsels worden gewist, immunolabeled door meerdere antilichamen en volume-afgebeeld.

ACT-PRESTO: biologisch weefsel Clearing en immunokleuring Methoden voor Volume Imaging

De combinatie van antilichaam etikettering, optische clearing en geavanceerde Lichtmicroscopie maakt een driedimensionale analyse van complete structuren of organen mogelijk. Hier beschreven is een eenvoudige methode om immunolabeling van dikke nierschijfjes te combineren, optische clearing met ethyl CINNAMAAT, en confocale beeldvorming die visualisatie en kwantificering van driedimensionale nierstructuren mogelijk maakt.

Optische clearing en beeldvorming van Immunolabeled nierweefsel

Neuronale dendritische morfologie ligt vaak ten grondslag aan functie. Inderdaad, veel ziekteprocessen die de ontwikkeling van neuronen beïnvloeden, manifesteren zich met een morfologisch fenotype. Dit protocol beschrijft een eenvoudige en krachtige methode voor het analyseren van intacte dendritische priëlen en hun bijbehorende stekels.

Beeldvorming en kwantificering van intacte neuronale dendrieten via CLARITY Tissue Clearing

Het protocol biedt een gedetailleerde methode van neuronale beeldvorming in hersensegmenten met behulp van een weefselzuiveringsmethode, ScaleSF. Het protocol omvat hersenweefselvoorbereiding, weefselverheldering, behandeling van gewiste plakjes en confocale laserscanmicroscopie beeldvorming van neuronale structuren van mesoscopische tot microscopische niveaus.

Een weefselzuiveringsmethode voor neuronale beeldvorming van mesoscopische tot microscopische schalen

Tumorsferoïden worden steeds vaker gebruikt om tumorcel-micro-omgevingsinteracties en therapierespons te beoordelen. Het huidige protocol beschrijft een robuuste maar eenvoudige methode voor semi-high-throughput beeldvorming van 3D-tumorsferoïden met behulp van snelle optische clearing.

Snelle optische clearing voor semi-high-throughput analyse van tumorsferoïden

Het huidige protocol biedt een stapsgewijze procedure voor snelle en gelijktijdige optische clearing, multi-round labeling en 3D volumetrische reconstructie van tientallen postmortale menselijke hersensecties door de (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT weefseltransformatietechniek te combineren met light-sheet fluorescentiemicroscopiebeeldvorming in een routinematig high-throughput protocol.

Optische opheldering en etikettering voor lichtbladfluorescentiemicroscopie in grootschalige beeldvorming van het menselijk brein

Dit protocol combineert optische klaring en immunolabeling voor confocale beeldvorming van het hele netvlies van de hele montuur. Het behoudt de 3D-structuur, waardoor gedetailleerde visualisatie van belangrijke neuronale paden mogelijk is, waardoor de studie van retinale rijping, ruimtelijke organisatie en de mogelijke toepassingen ervan in ziektemodellering en gepersonaliseerde geneeskunde worden verbeterd.

Visualisatie van retinale organoïden voor de hele berg met cellulaire resolutie

Optische klaringstechnieken, zoals het absorberen van moleculenoplossingen, verminderen de lichtverstrooiing tijdelijk om de biologische beeldvorming te verbeteren en bieden biocompatibele, omkeerbare in vivo beeldvormingsstrategieën voor diep ingebedde organen. Dit protocol presenteert gedetailleerde experimentele procedures en geavanceerde beeldverwerking om hoogwaardige, dynamische beeldvorming te bereiken voor real-time dynamiek bij levende dieren.

Transiënte optische klaring met behulp van absorberende moleculen voor ex vivo en in vivo beeldvorming

Ontdek psPACT en mPACT voor snelle optische transparantie van intact CNS-weefsel bij muizen en ratten. Deze passieve methoden versnellen het wissen tot 14 dagen zonder elektroforetische schade.

Nieuwe passieve methoden voor de snelle productie van optische transparantie in hele CNS weefsel wissen

Meer video's verkennen