Bouillon Microdilution In Vitro Screening: een gemakkelijke en snelle methode om te ontdekken van nieuwe antischimmel Compounds

Het algemene doel van deze methode is om de activiteit van potentiële antischimmelmiddelen te evalueren, met behulp van een aanpassing van de broth microdilution gevoeligheidstest, die in klinische laboratoria wordt gebruikt. Deze methode wordt gebruikt om de schimmelactiviteit van natuurlijke of synthetische verbindingen te evalueren, een van de eerste tests bij de ontwikkeling van antischimmeltherapieën. We bieden instructies voor een eerste screening van nieuwe antischimmelmiddelen met behulp van kleine volumes in een korte tijd, vooral als de experimenten met automatisering worden uitgevoerd.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Daniel Zamith-Miranda, een postdoctoraal onderzoeker in mijn laboratorium. Begin deze procedure door de schimmelstammen voor het testen te laten groeien zoals beschreven in het tekstprotocol. Verzamel de volgende dag de cellen door de conische buisjes te centrifugeren bij 1200 G, gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Gooi de supernatant weg, voeg tien milliliter PBS toe aan elke buis en resuspendeer de cellen. Centrifugeer opnieuw bij 1200 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Herhaal de PBS-was en centrifugatie nog twee keer.

Na de derde was, resuspendeer de cellen in vijf milliliter dubbel sterk RPMI 1640-medium. Afhankelijk van de troebelheid van de celsuspensie, bereid een milliliter van een een-op-honderd of een-op-duizend verdunning van elke stam voor, in een microcentrifugebuisje. Aliquat tien microliters van deze verdunning, plaats het in een hemocytometerkamer en tel het totale aantal cellen in de vier hoekkwadranten onder de microscoop.

Na het berekenen van de dichtheid van elke celsuspensie, bereid stamcelsuspensies voor in dubbel sterk RPMI 1640-medium. Bereid 4.000 cellen per milliliter voor C.albicans-stammen en 20.000 cellen per milliliter voor C.neoformans-stammen. De lyofilisaatpeptiden worden in alikwaten opgeslagen voor eenmalig gebruik bij min twintig graden Celsius en worden alleen opgelost in gedeïoniseerd water voor elk experiment.

De peptideconcentratie moet twee keer de hoogste uiteindelijke concentratie zijn die in de test wordt getest. Referentiële antischimmelmiddelen worden ook bereid. De antischimmeltest wordt uitgevoerd in drievoudig en in 96-wells polystyreen microplaten.

Gebruik een tweevoudige seriële verdunning van elk peptide en controle-antischimmelmiddel, en een uiteindelijk volume van 50 microliter per putje. De meest cruciale stap in het protocol is de seriële verdunning, dus wees zeer voorzichtig tijdens de volgende stappen om fouten te voorkomen die uw hele analyse zullen compromitteren. Voeg met een pipette 100 microliter van het antischimmelpeptide in de dubbele sterkteconcentratie van de hoogste gewenste uiteindelijke concentratie toe aan kolommen een tot drie in rij A.Voeg met een multikanaals pipette 50 microliter steriele water toe aan de andere putjes in rijen B tot H.Verwijder 50 microliter uit de putjes met de hoogste concentratie.

Breng over naar de bijbehorende putjes van de volgende concentratie en homogeniseer door meerdere keren omhoog en omlaag te pipetten. Herhaal de seriële verdunning totdat de putjes met de laagste concentratie zijn bereikt, en gooi 50 microliter uit deze putjes weg. Laat kolommen 11 en 12 van rijen A, B en C met alleen water achter voor blanco controles, of negatieve groeicontroles.

Voeg 50 microliter van de dubbele sterkte aangepaste inoculum in RPMI 1640-medium toe aan elk putje van kolommen een tot drie, plus kolom 11. De uiteindelijke concentratie voor C.albicans zal 2.000 cellen per milliliter zijn. De uiteindelijke concentratie voor C.neoformans zal 10.000 cellen per milliliter zijn.

Bereid negatieve groeicontroles voor door 50 microliter water en 50 microliter aangepast inoculum zonder antischimmelmiddel te mengen. Bereid blanco controles voor door 50 microliter water en 50 microliter medium zonder cellen te combineren. Laad de controles in de juiste putjes.

Bekijk alle putjes met een omgekeerde optische microscoop en incubeer vervolgens de platen bij 37 graden met schommelen bij 200 rpm. Observeer na de incubatieperiode alle putjes opnieuw om veranderingen in morfologie te verifiëren, evenals om te controleren op tekenen van contaminatie. Maak een afbeelding van elke plaat met een digitale camera.

In deze representatieve test werden drie antimicrobiële peptiden, of AMP's, met concentraties variërend van 100 micromolair tot punt zeven acht micromolair, geëvalueerd op antischimmelactiviteit tegen C.neoformans. Een groeicontrole en een blanco werden opgenomen. Elke put met helder medium vergelijkbaar met de blanco putjes wordt beschouwd als een positief resultaat, terwijl elke put met troebelheid analoog aan de negatieve groeicontroleputjes als negatief wordt beschouwd.

Aangezien de minimale remmende concentratie, of MIC, wordt gedefinieerd als de laagste concentratie antimicrobieel middel dat volledig zichtbare schimmelgroei aan het einde van de incubatieperiode remt, wordt 25 micromolair beschouwd als de MIC voor AMP1. En 12,5 micromolair, de MIC voor AMP2. AMP3 zal opnieuw moeten worden geëvalueerd, aangezien de schimmel op alle geteste concentraties groeide.

Op dezelfde manier toonden drie verschillende peptiden getest tegen C.albicans aan dat 50 micromolair de MIC is voor AMP1. Zes micromolair is de MIC voor AMP2, en 25 micromolair is de MIC voor AMP3. Een voorbeeld van een slecht resultaat, waarschijnlijk door onjuist pipetteren tijdens de verdunningsstap, wordt geïllustreerd door kolommen vijf tot zeven van rij C op deze plaat, waar verschillen in C.neoformans-groei tussen replica's aanwezig zijn.

Eenmaal beheerst, kan deze techniek in ongeveer twee uur worden uitgevoerd, plus de tijd van schimmelgroei, als het op de juiste manier wordt uitgevoerd. Denk eraan om op de hoogte te zijn van de fysisch-chemische kenmerken van deze geteste moleculen. Gebruik vervolgens geschikte oplosmiddelen als controle voor het geval ze nodig zijn, en gebruik altijd de cellen in dezelfde groeifase.

Volgens deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals een tijddood