Name: Bouillon Microdilution In Vitro Screening: een gemakkelijke en snelle methode om te ontdekken van nieuwe antischimmel Compounds (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Leer de broth microdilution methode voor het screenen van nieuwe antischimmelverbindingen met kleine volumes en automatisering. Deze aanpak versnelt de ontwikkeling van effectieve antifungale therapieën aanzienlijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de CAPES-Brazilië, CNPq-Brazilië, FAP/DF voor financiële steun. Wij zijn dankbaar aan Dr Hugo Costa Paes voor de herziening van het manuscript.

1. oplossingen en Media
<ol><li>Bereiden van 2 X Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) 1640 medium, met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), Sabouraud dextrose Bouillon en Sabouraud dextrose agar volgens tabel 1.</li>
</ol>2. schimmel entmateriaal groei voorwaarden
<ol><li>Bewaar alle schimmel stammen als bevroren voorraden in 35% glycerol bij-80 ° C, totdat het nodig is.</li>
	<li>Voer de volgende stappen uit voor elk experiment.<ol>
<li>Voor Candida albicans stammen:<ol>
<li>Ontdooi een voorraad flesje en breng 200 µL tot 10 mL Sabouraud dextrose Bouillon in een steriele 50 mL polypropyleen buis met een GLB en cultuur 's nachts bij 30 ° C met agitatie (200 rpm). Vergeet niet om de helling van de buis en het GLB iets openlaten voor een betere ventilatie van de cultuur.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Voor Cryptococcus neoformans stammen:<ol>
<li>Schraap het bevroren oppervlak van een voorraad flacon. Plaat van de cellen op Sabouraud dextrose agar platen en incubeer gedurende 48 h bij 30 ° C. Na zichtbare groei van geïsoleerde kolonies, de platen in de ijskast (4 ° C) verzegeld met paraffine film voor maximaal 15 dagen te houden.</li>
			<li>Een middelgrote geïsoleerde kolonie van de plaat met een steriel tandenstoker of steriele inoculating lus verzamelen en Sabouraud dextrose Bouillon in een conische buis van steriele 50 mL 10 mL beënten. Incubeer gedurende ongeveer 24 h bij 30 ° C onder agitatie (200 rpm).</li>
			<li>De 24 uur incubatie niet overschrijden. Vergeet niet om de helling van de buis en het GLB iets openlaten voor een betere ventilatie. Het is altijd goed op de standaardisering van de fase van de groei van de cellen vóór elke proef, want dit is een belangrijke factor die van antimicrobiële resistentie. Opmerking: Beide schimmels bij 30 ° C voor snelle vermeerdering in onze experimenten zijn geteeld, maar de temperatuur kan worden aangepast aan de doelstellingen van de studie, bijvoorbeeld klinische behandeling (37 ° C). Bovenal moet dit eerste incubatietijd worden vooraf vastgesteld voor elke schimmel isolaat en onderhouden in alle tests om de reproduceerbaarheid.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na de groei van zwammen, verzamelen de cellen door centrifugeren van de conische buisjes bij 1.200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en voeg toe 10 mL PBS.</li>
	<li>Resuspendeer de cellen en centrifuge weer bij 1.200 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Herhaal de PBS wassen en centrifugeren tweemaal meer. Na de derde wash, resuspendeer de cellen in 5 mL (op basis van de grootte van de pellet) 2 X RPMI-1640 voedingsbodem.</li>
	<li>Bereiden 1 mL van een verdunning van het 1:100 of 1:1,000 in een microcentrifuge buis (afhankelijk van de troebelheid van de celsuspensie).</li>
	<li>Aliquot 10 µL met deze tweevoudige verdunning, plaatst u deze in een hemocytometer kamer en tellen het totale aantal cellen in de hoek van de vier kwadranten onder de Microscoop. Bereken de concentratie door de formule: (totaal cel nummer/4) x verdunning factor x 104 (kamer verdunning constant).<ol>
<li>Overwegen een 100% levensvatbaarheid als levensvatbaarheid graven en groei omstandigheden hebben systematisch zijn gecorreleerd voor het isolaat bestudeerd. Opmerking: De normalisatie en kwaliteitscontrole van de graven van de levensvatbaarheid kunnen worden gedaan door rug-plating in overeenstemming met de Europese Commissie minimaal inhiberende concentratie (MIC) antischimmel, antimicrobiële gevoeligheid testen (EUCAST) methode voor gisten10 .</li>
		<li>Als de groei/levensvatbaarheid correlatie is niet vastgesteld voor het isolaat bestudeerde, meten de schimmel levensvatbaarheid door het tellen van levende cellen in een hemocytometer met behulp van kleurstoffen die selectief kleur dode cellen, zoals phloxine B11, trypan-blauw 12, of Janus groen13. De schimmel cellen gebruiken voor dit protocol alleen als de levensvatbaarheid van de bevolking op dit punt 90 is % of hoger. Opmerking: Dead/alive kleurstoffen kunnen niet goed werken met de schimmel van keuze. Gelieve te testen ze vóór gebruik. De trypan blauwe kleurstof werkt bijvoorbeeld niet goed met C. neoformans.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Daarna bereiden de schorsingen van de cel in 2 X RPMI-1640 medium (2 X aangepast entmateriaal in RPMI-1640 medium). Overwegen een volume van 5 mL voor elke plaat voor 96-wells-platen.<ol>
<li>Voor alle C. albicans stammen, bereiden een voorraad celsuspensie van 4 x 10-3 cellen/mL. Deze concentratie is 2 X van de concentratie van de laatste cel in elk putje (2 x 103 cellen/mL).</li>
		<li>Voorbereiden voor C. neoformans stammen, een voorraadculturen van cellen 2 x 104 cellen/mL. Deze concentratie is twee keer de laatste cel concentratie in elk putje (1 x 104 cellen/mL).</li>
		<li>Voor andere schimmels, test met een bekende antimycoticum welke concentratie ideaal voor de specifieke studie met betrekking tot de incubatietijd zijn zal. Rekening tijd van het metabolisme en duplicatie van de schimmel.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. peptides (onbekende Agent)
<ol><li>Slaan de gelyofiliseerd peptiden bij-20 ° C, en hen in gedeïoniseerd water vóór elk experiment op te lossen. De maximale opslagtijd eenmaal opgelost in water zal afhangen van de aard van elke peptide.</li>
	<li>Bereid hoeveelheden van twee keer de hoogste eindconcentratie getest in de analyse (2 X). In het ideale geval bereiden een klein aantal aliquots met genoeg peptide voor één keer wordt gebruikt om te voorkomen dat cycli bevriezen-ontdooien. Opmerking: De keuze van de concentratie moet worden gebaseerd op literatuur en de eigenschappen van de peptide. Het is aanbevolen om de seriële verdunningen beginnen met ongeveer 100 µM van de peptide, en vervolgens vergroten of verkleinen deze concentratiebereik afhankelijk van de verkregen resultaten.</li>
</ol>4. verwijzing antischimmelmiddelen (positieve controles)
<ol><li>Voor degenen verdund in water: bereid een 2 X-oplossing van de hoogste concentratie van de analyse (zie sectie 5: antischimmel Assay voor de verdunning stappen).<ol>
<li>Bereid voor C. albicans stammen, een oplossing van 128 µg/mL fluconazol of 128 µg/mL caspofungine. De concentratie van de plaat voor beide zullen 64 µg/mL.</li>
		<li>Bereid voor C. neoformans stammen, een oplossing van 32 µg/mL amfotericine B (in water oplosbare oplossing). De plaat concentratie zullen 16 µg/mL. Opmerking: Normaal amfotericine B wordt verdund in dimethylsulfoxide (DMSO), aangezien dit anti-schimmel slecht oplosbaar in water is. Er zijn echter in water oplosbare amfotericine B preparaten commercieel beschikbaar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voor antischimmelmiddelen verdund in een organisch oplosmiddel: een 100 X stockoplossing in DMSO bereiden en Verdun het tot 10 X in water voor gebruik. Opmerking: Dus in de put, de uiteindelijke concentratie van DMSO zal niet meer dan 1%. Een put waar de schimmel in de media met 1% DMSO zoals controle nodig is, gezien het feit dat sommige schimmels geen goed deze concentratie van het oplosmiddel tolereren zal groeien. Vergeet niet dat DMSO lichtgevoelige is, dus de afdekplaat met folie of plaatst u deze in een donkere kamer voor de duur van de incubatietijd.</li>
</ol>5. antischimmel Assay
Opmerking: In vitro antischimmel tests zijn uitgevoerd op basis van de Bouillon microdilution gevoeligheid test uit Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 richtsnoeren met enkele wijzigingen.
<ol><li>Maak een tweeledig seriële verdunning van elke peptide en schimmeldodende in 96-Wells polystyreen microplates tot een eindvolume van 50 µL controle.<ol>
<li>Met behulp van een precisiepipet Voeg 100 µL van het antimycoticum/peptide in de 2 X-concentratie van de hoogste gewenste eindconcentratie in kolommen in rij 1-3, A.</li>
		<li>Voeg met behulp van een meerkanaalspipet 50 µL van steriel water in de andere putten, in rijen B aan H.</li>
		<li>Verwijderen van 50 µL van de putjes met de hoogste concentratie (rij A), overdracht naar het volgende goed van de volgende concentratie (rij B) en meng.</li>
		<li>Herhaal de bovenstaande stappen totdat de put met de laagste concentratie en gooi 50 µL van dit goed (rij H). Laat kolommen 11 en 12 (rijen A, B, C) met uitsluitend water voor blanco-controle of controle van de negatieve/groei.</li>
		<li>50 µL van de 2 X aangepast entmateriaal in RPMI-1640 medium toevoegen aan elk putje (kolommen 1-3 plus kolom 11 (negatief/groei control)); de uiteindelijke concentratie voor C. albicans zal worden 2 x 103 cellen/mL, en de uiteindelijke concentratie voor C. neoformans stammen 104 cellen/mL zullen.</li>
		<li>Bereiden van lege besturingselementen (50 µL water + 50 µL 2 X RPMI-1640 medium zonder cellen) en negatieve/groei controle (50 µL water + 50 µL aangepast entmateriaal 2 X RPMI-1640 medium zonder schimmeldodende) en lading in de goed plaat zoals beschreven hierboven.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herhaal de procedure voor elke verbinding worden getest en de gekozen antischimmel controle (kolommen 4-10). Opmerking: De seriële verdunningen mogelijk verticaal als het experiment hieronder, of horizontaal in de plaat (dat wil zeggen, als het aantal verdunningen van het gegeven samengestelde/extract dat moet getest worden acht of meer).<ol>
<li>Als u verwijst naar de verbindingen, drugs, of onderdelen daarvan zijn lichtgevoelige, uitvoeren van de bepaling in lagere licht, dekking van de platen met folie of plaats in een donkere kamer tijdens incubations.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Houd rekening met de volgende optionele aanbevelingen.<ol>
<li>Verzegel de plaat met een duidelijke afdekplaat waarmee gasuitwisseling, als dit helpt verdamping verminderen.</li>
		<li>Plaats de plaat in een vochtige kamer; het zal ook helpen verminderen van verdamping.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 24 uur of 48 uur voor alle C. albicans stammen, en gedurende 48 uur met 200 rpm schudden voor C. neoformans. De lagere eindvolume (100 µL) zorgt ervoor dat geen spillover optreedt. Opmerking: Werd geen significant verschil waargenomen tussen MIC lezingen op 24 uur en 48 uur voor C. albicans stammen. Lezingen op 48 uur zijn echter gemakkelijker om te visualiseren.</li>
	<li>Observeer alle putjes, met de hulp van een omgekeerde optische Microscoop, voordat de incubatietijd en na om te controleren of veranderingen in de morfologie zo goed te controleren op tekenen van besmetting. Opmerking: Lezingen kunnen worden gedaan visueel en gefotografeerd aan het einde van het experiment. Vóór elke lezing, meng licht de plaat. Het leest kunnen ook worden uitgevoerd door het meten van de OD op 600 nm, als cel samengeklonterd of filamentation niet worden nageleefd.</li>
	<li>De experimenten uitvoeren ten minste driemaal op aparte data.</li>
</ol>

<ol><li>Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neglected+epidemic%3A+fungal+infections+in+HIV%2FAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS.</a> Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).</li>
<li>Romani, L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21394104">Immunity to fungal infections.</a> Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).</li>
<li>Pfaller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+drug+resistance%3A+mechanisms%2C+epidemiology%2C+and+consequences+for+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Med%22%5BJournal%5D)">Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment.</a> Am J Med. 125 (1 Suppl), S3-S13 (2012).</li>
<li>Hancock, R. E., Diamond, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cationic+antimicrobial+peptides+in+innate+host+defences%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of cationic antimicrobial peptides in innate host defences.</a> Trends Microbiol. 8 (9), 402-410 (2000).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snake+cathelicidin+from+Bungarus+fasciatus+is+a+potent+peptide+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Snake cathelicidin from Bungarus fasciatus is a potent peptide antibiotics.</a> PLoS One. 3 (9), e3217(2008).</li>
<li>Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AaeAP1+and+AaeAP2%3A+novel+antimicrobial+peptides+from+the+venom+of+the+scorpion%2C+Androctonus+aeneas%3A+structural+characterisation%2C+molecular+cloning+of+biosynthetic+precursor-encoding+cDNAs+and+engineering+of+analogues+with+enhanced+antimicrobial+and+anticancer+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">AaeAP1 and AaeAP2: novel antimicrobial peptides from the venom of the scorpion, Androctonus aeneas: structural characterisation, molecular cloning of biosynthetic precursor-encoding cDNAs and engineering of analogues with enhanced antimicrobial and anticancer activities.</a> Toxins (Basel). 7 (2), 219-237 (2015).</li>
<li>Benincasa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungicidal+activity+of+five+cathelicidin+peptides+against+clinically+isolated+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Fungicidal activity of five cathelicidin peptides against clinically isolated yeasts.</a> J Antimicrob Chemother. 58 (5), 950-959 (2006).</li>
<li>CLSI. <a target="_blank" href="https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m27s/">Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibiliy Testing of Yeasts; Approved Standard -Third Edition. CLSI document M27-A3</a>. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA. (2008).</li>
<li>Guilhelmelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+Scorpion+Venom-Derived+Antifungal+Peptides+against+Planktonic+Cells+of+Candida+spp.+and+Cryptococcus+neoformans+and+Candida+albicans+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Activity of Scorpion Venom-Derived Antifungal Peptides against Planktonic Cells of Candida spp. and Cryptococcus neoformans and Candida albicans Biofilms.</a> Front Microbiol. 7, 1844(2016).</li>
<li>The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing. Method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts, version, 7.3.1 2017. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/AFST/Files/EUCAST_E_Def_7_3_1_Yeast_testing__definitive.pdf">http://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/AFST/Files/EUCAST_E_Def_7_3_1_Yeast_testing__definitive.pdf</a> (2017).</li>
<li>Roongruangsree, U. T., Kjerulf-Jensen, C., Olson, L. W., Lange, L. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1439-0434.1988.tb04474.x/full">Viability Tests for Thick Walled Fungal Spores (ex: Oospores of Peronospora manshurica).</a> Journal of Phytopathology. 123 (3), 244-252 (1988).</li>
<li>Boedijn, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+as+stain+for+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue as stain for fungi.</a> Stain Technol. 31 (3), 115-116 (1956).</li>
<li>Goihman-Yahr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+plating+efficiency+and+estimation+of+viability+of+suspensions+of+Paracoccidioides+brasiliensis+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells.</a> Mycopathologia. 71 (2), 73-83 (1980).</li>
<li>Tati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histatin+5-spermidine+conjugates+have+enhanced+fungicidal+activity+and+efficacy+as+a+topical+therapeutic+for+oral+candidiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Histatin 5-spermidine conjugates have enhanced fungicidal activity and efficacy as a topical therapeutic for oral candidiasis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58 (2), 756-766 (2014).</li>
<li>Petrou, M. A., Shanson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+Cryptococcus+neoformans+by+the+NCCLS+microdilution+and+Etest+methods+using+five+defined+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of Cryptococcus neoformans by the NCCLS microdilution and Etest methods using five defined media.</a> J Antimicrob Chemother. 46 (5), 815-818 (2000).</li>
<li>Zaragoza, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+analysis+of+variables+for+standardization+of+antifungal+susceptibility+testing+of+nonfermentative+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Process analysis of variables for standardization of antifungal susceptibility testing of nonfermentative yeasts.</a> Antimicrob Agents Chemother. 55 (4), 1563-1570 (2011).</li>
<li>Rodriguez-Tudela, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+shaking+on+antifungal+susceptibility+testing+of+Cryptococcus+neoformans%3A+a+comparison+of+the+NCCLS+standard+M27A+medium%2C+buffered+yeast+nitrogen+base%2C+and+RPMI-2%25+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).</li>
<li>Beggs, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+phase+in+relation+to+ketoconazole+and+miconazole+susceptibilities+of+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans.</a> Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).</li>
<li>Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungicidal+properties+of+defensin+NP-1+and+activity+against+Cryptococcus+neoformans+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro.</a> Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Microdilution tests kunnen analyseren van de potentiële antischimmel activiteit van een doel samengesteld met behulp van kleine hoeveelheden van de stof, en tegelijkertijd testen in een aantal uiteenlopende concentraties. Dienovereenkomstig, dit protocol wordt aanbevolen als een eerste stap in de screening voor potentiële nieuwe antischimmel compounds. Het hier gepresenteerde protocol is gebaseerd op de M27-A3-protocol, in eerste instantie ontworpen om te helpen bij de keuze van antifungale therapie in klinieken, en kan ...

Schimmelinfecties zijn geworden een belangrijke medische zorg in de afgelopen decennia aanzienlijk is gestegen voornamelijk te wijten aan een stijging van het aantal immuungecompromitteerde personen zoals die in de behandeling van kanker en degenen die met HIV/AIDS leven of getransplanteerde organen1,2. Echter bijdragen een zeer beperkt scala van beschikbare antischimmel geneesmiddelen en het toenemende aantal verslagen over schimmel weerstand tegen hen aan de grote problemen met betrekking tot de therapeutiek van systemische mycoses3.
Een potentiële bron van nieuwe antischimmel compounds zijn antimicrobiële peptiden (ampère), kleine kationische peptiden geproduceerd door vele organismen als onderdeel van hun aangeboren immune reactie op infectie4. De screeningsmethode voor het testen van deze verbindingen tegen schimmel ziekteverwekkers is echter niet gestandaardiseerd. Verschillende procedures zijn gebruikt om de antischimmel activiteiten beoordelen van versterkers, soms voor de dezelfde model micro-organisme5,6,7. Deze verschillen en het gebrek aan detail in sommige protocollen bemoeilijken vergelijkingen tussen verbindingen en belemmert reproduceerbaarheid.
Unidirectioneel om te standaardiseren het testen van nieuwe drugkandidaten is richtsnoeren gebruikt om te definiëren antischimmel gevoeligheid in klinische instellingen, zoals de klinische en laboratorium Standards Institute (CLSI) M27-A3 richtsnoeren te volgen. Deze antischimmel gevoeligheid tests zijn echter te beperkend, en niet rekening overweging variatie in metabolisme over soorten, als zij slechts voor een paar selecteren agenten waren gevestigd. Bijvoorbeeld, doen ze niet rekening houden met de metabolische behoeften van niet-fermenteren-gisten.
Dit protocol staat de beoordeling van de activiteit van potentiële antischimmel verbindingen, en hier is geïmplementeerd voor het zoeken naar antischimmel peptiden. Het is gebaseerd op de Bouillon microdilution gevoeligheid test van de CLSI M27-A3-richtlijnen met betrekking tot wijzigingen die de screening van nieuwe verbindingen8,9te optimaliseren. Deze wijzigingen toestaan voor het gebruik van kleine hoeveelheden van stof, variaties in temperatuur of eerste entmateriaal en verschillende media voor optimale pre-test groei, terwijl de resultaten met het gebruik van referentie antischimmelmiddelen als besturingselementen te standaardiseren. Deze methode, met het gebruik van multi goed cultuur platen, maakt het mogelijk om snel en betrouwbaar scherm een groot aantal verbindingen.
Als gevolg van de inherente flexibiliteit, kan dit protocol worden gebruikt met verschillende chemische klassen van samenstellingen en tegen andere micro-organismen, met enkele aanpassingen.

<table><tbody><tr><td>Media en Reagentia</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium met l-glutamine, zonder natriumbicarbonaat</td><td>Thermo Fisher</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-morfolino) propaansulfonzuur (MOPS) (wat we gebruiken heeft een natrium, vul de naam alsjeblieft aan)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Gebruik om 2X RPMI medium te bufferen</td></tr><tr><td>Natriumchloride (NaCl)</td><td>Din&acirc;mica</td><td>1528-1</td><td>137 mM voor fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)</td></tr><tr><td>Kaliumchloride (KCl)</td><td>J.T.Baker</td><td>3040-01</td><td>2,7 mM voor fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)</td></tr><tr><td>Natriumfosfaat dibasisch (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V000129</td><td>10 mM voor fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)</td></tr><tr><td>Kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60230</td><td>2 mM voor fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)</td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud dextrose bouillon</td><td>BD</td><td>238230</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Sabouraud Dextrose Agar</td><td>BD</td><td>210950</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V000123</td><td>35% voor (stockoplossing? Cryopreservatie?)</td></tr><tr><td>Steriele water</td><td></td><td></td><td>Voor het verdunnen van geneesmiddelen in seriële verdunning</td></tr><tr><td>Antifungale geneesmiddelen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Fluconazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8929</td><td></td></tr><tr><td>Caspofungine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1160</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoffen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL kegelbuis</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Petrischaal</td><td>J.Prolab</td><td>0304-5</td><td></td></tr><tr><td>96 well plaat</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Steriele oplossingsreservoir</td><td>KASVI</td><td>K30-208</td><td>Gebruik om de oplossingen te pipetten met de meerkanaalspipet</td></tr><tr><td>Apparatuur en andere materialen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optische microscoop</td><td>Nikon</td><td>E200MV</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugaat</td><td>Thermo Fisher</td><td>MegaFuge 16R</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Ethik Technology</td><td>403-3D</td><td>Instellen op 37&deg; C</td></tr><tr><td>Schudder</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Excella E25</td><td>Instellen op 37&deg; C, 200 RPM</td></tr><tr><td>Celtellingskamer, Neubauer</td><td>BOECO Duitsland</td><td>BOE 13</td><td></td></tr><tr><td>Meerkanaalspipet</td><td>HTL</td><td>5123</td><td></td></tr></tbody></table>

bouillon microdilution in vitro screening: een gemakkelijke en snelle methode om te ontdekken van nieuwe antischimmel compounds

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Schimmelinfecties zijn een belangrijke medische voorwaarde geworden in de laatste decennia, maar het aantal beschikbare antischimmel geneesmiddelen is beperkt. In dit scenario is het zoeken naar nieuwe antischimmel geneesmiddelen nodig. Het protocol gemeld hier gegevens een methode om scherm peptiden voor hun schimmeldodende eigenschappen. Het is gebaseerd op de Bouillon microdilution gevoeligheid test van de Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 richtsnoeren met wijzigingen aan het onderzoek van antimicrobiële peptiden als potentiële nieuwe antischimmelmiddelen. Dit protocol beschrijft een functionele test om te evalueren van de activiteiten van antischimmel verbindingen en kan eenvoudig worden aangepast om aan te passen van een bepaalde categorie van moleculen onder onderzoek. Aangezien de testen worden uitgevoerd in 96-wells-platen met behulp van kleine volumes, kan een grootschalig onderzoek worden uitgevoerd in een korte hoeveelheid tijd, vooral als uitgevoerd in een omgeving van automatisering. Deze procedure laat zien hoe een gestandaardiseerde en verstelbare klinische protocol het nastreven van de Bank-werk van nieuwe moleculen ter verbetering van de therapie van schimmelziekten kan helpen.

De MIC wordt gedefinieerd als het laagste antimicrobiële samengestelde concentratie dat volledig de groei van de zichtbare zwammen aan het eind van de incubatietijd remt. Aangezien de doelstelling van dit protocol een snelle methode om scherm potentiële antischimmelmiddelen is, elk goed met duidelijke media vergelijkbaar met de lege putten wordt beschouwd als een positief resultaat, overwegende dat een goed met troebelheid analoog aan de negatieve/groei-controleputjes als negatief beschou...

Een eenvoudig en flexibel Bouillon microdilution methode voor het screenen van antischimmel verbindingen en extracten.

Bouillon Microdilution In Vitro Screening: een gemakkelijke en snelle methode om te ontdekken van nieuwe antischimmel Compounds

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

Het algemene doel van deze methode is om de activiteit van potentiële antischimmelmiddelen te evalueren, met behulp van een aanpassing van de broth microdilution gevoeligheidstest, die in klinische laboratoria wordt gebruikt. Deze methode wordt gebruikt om de schimmelactiviteit van natuurlijke of synthetische verbindingen te evalueren, een van de eerste tests bij de ontwikkeling van antischimmeltherapieën. We bieden instructies voor een eerste screening van nieuwe antischimmelmiddelen met behulp van kleine volumes in een korte tijd, vooral als de experimenten met automatisering worden uitgevoerd.De procedure zal worden gedemonstreerd door Daniel Zamith-Miranda, een postdoctoraal onderzoeker in mijn laboratorium. Begin deze procedure door de schimmelstammen voor het testen te laten groeien zoals beschreven in het tekstprotocol. Verzamel de volgende dag de cellen door de conische buisjes te centrifugeren bij 1200 G, gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Gooi de supernatant weg, voeg tien milliliter PBS toe aan elke buis en resuspendeer de cellen. Centrifugeer opnieuw bij 1200 G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Herhaal de PBS-was en centrifugatie nog twee keer.Na de derde was, resuspendeer de cellen in vijf milliliter dubbel sterk RPMI 1640-medium. Afhankelijk van de troebelheid van de celsuspensie, bereid een milliliter van een een-op-honderd of een-op-duizend verdunning van elke stam voor, in een microcentrifugebuisje. Aliquat tien microliters van deze verdunning, plaats het in een hemocytometerkamer en tel het totale aantal cellen in de vier hoekkwadranten onder de microscoop.Na het berekenen van de dichtheid van elke celsuspensie, bereid stamcelsuspensies voor in dubbel sterk RPMI 1640-medium. Bereid 4.000 cellen per milliliter voor C.albicans-stammen en 20.000 cellen per milliliter voor C.neoformans-stammen. De lyofilisaatpeptiden worden in alikwaten opgeslagen voor eenmalig gebruik bij min twintig graden Celsius en worden alleen opgelost in gedeïoniseerd water voor elk experiment.De peptideconcentratie moet twee keer de hoogste uiteindelijke concentratie zijn die in de test wordt getest. Referentiële antischimmelmiddelen worden ook bereid. De antischimmeltest wordt uitgevoerd in drievoudig en in 96-wells polystyreen microplaten.Gebruik een tweevoudige seriële verdunning van elk peptide en controle-antischimmelmiddel, en een uiteindelijk volume van 50 microliter per putje. De meest cruciale stap in het protocol is de seriële verdunning, dus wees zeer voorzichtig tijdens de volgende stappen om fouten te voorkomen die uw hele analyse zullen compromitteren. Voeg met een pipette 100 microliter van het antischimmelpeptide in de dubbele sterkteconcentratie van de hoogste gewenste uiteindelijke concentratie toe aan kolommen een tot drie in rij A.Voeg met een multikanaals pipette 50 microliter steriele water toe aan de andere putjes in rijen B tot H.Verwijder 50 microliter uit de putjes met de hoogste concentratie.Breng over naar de bijbehorende putjes van de volgende concentratie en homogeniseer door meerdere keren omhoog en omlaag te pipetten. Herhaal de seriële verdunning totdat de putjes met de laagste concentratie zijn bereikt, en gooi 50 microliter uit deze putjes weg. Laat kolommen 11 en 12 van rijen A, B en C met alleen water achter voor blanco controles, of negatieve groeicontroles.Voeg 50 microliter van de dubbele sterkte aangepaste inoculum in RPMI 1640-medium toe aan elk putje van kolommen een tot drie, plus kolom 11. De uiteindelijke concentratie voor C.albicans zal 2.000 cellen per milliliter zijn. De uiteindelijke concentratie voor C.neoformans zal 10.000 cellen per milliliter zijn.Bereid negatieve groeicontroles voor door 50 microliter water en 50 microliter aangepast inoculum zonder antischimmelmiddel te mengen. Bereid blanco controles voor door 50 microliter water en 50 microliter medium zonder cellen te combineren. Laad de controles in de juiste putjes.Bekijk alle putjes met een omgekeerde optische microscoop en incubeer vervolgens de platen bij 37 graden met schommelen bij 200 rpm. Observeer na de incubatieperiode alle putjes opnieuw om veranderingen in morfologie te verifiëren, evenals om te controleren op tekenen van contaminatie. Maak een afbeelding van elke plaat met een digitale camera.In deze representatieve test werden drie antimicrobiële peptiden, of AMP's, met concentraties variërend van 100 micromolair tot punt zeven acht micromolair, geëvalueerd op antischimmelactiviteit tegen C.neoformans. Een groeicontrole en een blanco werden opgenomen. Elke put met helder medium vergelijkbaar met de blanco putjes wordt beschouwd als een positief resultaat, terwijl elke put met troebelheid analoog aan de negatieve groeicontroleputjes als negatief wordt beschouwd.Aangezien de minimale remmende concentratie, of MIC, wordt gedefinieerd als de laagste concentratie antimicrobieel middel dat volledig zichtbare schimmelgroei aan het einde van de incubatieperiode remt, wordt 25 micromolair beschouwd als de MIC voor AMP1. En 12,5 micromolair, de MIC voor AMP2. AMP3 zal opnieuw moeten worden geëvalueerd, aangezien de schimmel op alle geteste concentraties groeide.Op dezelfde manier toonden drie verschillende peptiden getest tegen C.albicans aan dat 50 micromolair de MIC is voor AMP1. Zes micromolair is de MIC voor AMP2, en 25 micromolair is de MIC voor AMP3. Een voorbeeld van een slecht resultaat, waarschijnlijk door onjuist pipetteren tijdens de verdunningsstap, wordt geïllustreerd door kolommen vijf tot zeven van rij C op deze plaat, waar verschillen in C.neoformans-groei tussen replica's aanwezig zijn.Eenmaal beheerst, kan deze techniek in ongeveer twee uur worden uitgevoerd, plus de tijd van schimmelgroei, als het op de juiste manier wordt uitgevoerd. Denk eraan om op de hoogte te zijn van de fysisch-chemische kenmerken van deze geteste moleculen. Gebruik vervolgens geschikte oplosmiddelen als controle voor het geval ze nodig zijn, en gebruik altijd de cellen in dezelfde groeifase.Volgens deze procedure kunnen andere methoden worden uitgevoerd, zoals een tijddood

broth-microdilution-vitro-screening-an-easy-fast-method-to-detect-new

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Beschrijven we een eenvoudige, snelle en robuuste methode voor de vorming...

Een 96 Goed microtiterplaat-gebaseerde methode voor de controle Formation en schimmelwerende gevoeligheid testen van Candida albicans Biofilms

We hebben een hoge dichtheid microarray platform bestaande uit 3D nano-biofilms...

Candida albicans Biofilm Chip (Ca BChip) voor high-throughput antimycoticum Screening

Source: Koeth, L. M., et. al., A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the broth microdilution method for determining the minimum inhibitory concentration (MIC) of a lipoglycopeptide antibiotic against Gram-positive bacteria. It covers bacterial colony isolation, dilution, inoculation of microplate wells with varying antibiotic concentrations, and verification of culture...

A Broth Microdilution Method for Antibiotic Susceptibility Testing of Gram-Positive Bacteria

This video demonstrates an in vitro assay to screen antifungal compounds using a broth microdilution assay. Test compounds are serially diluted in a microtiter plate and incubated with a fungal inoculum. Post-incubation, the plate is examined for wells without visible fungal growth to assess the antifungal potential of the test compounds and their minimum inhibitory concentration (MIC).

An In Vitro Broth Microdilution Assay for the Screening of Antifungal Compounds

Hier beschrijven we een fenotypische test die van toepassing is op de high-throughput/high-content schermen van small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemische verbinding en Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. Deze methode is gebaseerd op de detectie van fluorescerend gelabelde Mycobacterium tuberculosis in fluorescerend gelabelde gastheercel met behulp van geautomatiseerde confocale microscopie.

Een microscopische fenotypische test voor de kwantificering van intracellulaire mycobacteriën aangepast voor screening met hoge doorvoer/hoge inhoud

Hier presenteren we een protocol voor de bepaling van dalbavancine-gevoeligheid van klinisch relevante grampositieve bacteriën met behulp van een bouillon microdilutie referentiemethode.

Referentie Bouillon microverdunningsplaten Methode voor dalbavancin<em&gt; In Vitro</em&gt; Gevoeligheid testen van Bacteriën die aNBAO Grow

Hier presenteren we protocollen om snel enzymen te screenen en te karakteriseren op antimicrobiële activiteit. De microslide-diffusietest en de kleurstof-releasetest maken gebruik van doelbacteriële substraten voor kwalitatieve en kwantitatieve evaluatie van enzymatische activiteit.

Kwalitatieve en Kwantitatieve Testen voor detectie en karakterisering van proteïne Antimicrobials

Er werd een doorvoer, real-time test ontwikkeld om gelijktijdig (1) eukaryotische cel-penetrante antibiotica te identificeren die zich richten op een intracellulair bacterieel pathogeen, en (2) de cytotoxiciteit van eukaryotische cellen te beoordelen. Een variatie op dezelfde technologie werd vervolgens gecombineerd met digitale doseertechnologie om gemakkelijke, hoge resolutie, dosis-respons en twee- en driedimensionale synergiestudies mogelijk te maken.

High Throughput, real-time, Dual-uitlezing Het testen van intracellulaire antimicrobiële activiteit en eukaryote cel cytotoxiciteit

We hebben een modulair high-throughput screening ontwikkeld voor het ontdekken van nieuwe verbindingen tegen Mycobacterium tuberculosis, intracellulaire targeting en-bouillon kweken bacteriën en cytotoxiciteit tegen de zoogdiergastheercel.

Systeem voor de werkzaamheid en cytotoxiciteit Screening van inhibitoren voor intracellulaire<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

We beschrijven een aangepaste methode op basis van agar die is ontworpen om de antischimmeleffecten van plantaardige producten te kwantificeren. Zowel volatiele als niet-volatiele bijdragen aan de antischimmelactiviteit kunnen via dit protocol worden beoordeeld. Bovendien kan de werkzaamheid tegen schimmels worden gemeten in belangrijke ontwikkelingsstadia in één experimentele opstelling.

Meten van vluchtige en niet-vluchtige antischimmelactiviteit van Biocontrol-producten

Een 96-well microtiter plaat-gebaseerd protocol met behulp van een 2,3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfofenyl)-5-carboxanilide-2H-tetrazolium (XTT) reductietest wordt hierin beschreven, om de effecten van antilichamen op biofilms gevormd door C. tropicalis te bestuderen. Dit in vitro protocol kan worden gebruikt om het effect van potentiële nieuwe antischimmelverbindingen op de metabole activiteit van Candida-soortencellen in biofilms te controleren.

Een oplosbare tetrazolium-gebaseerde reductietest om het effect van antilichamen op Candida tropicalis biofilms te evalueren

Leer de broth microdilution methode voor het screenen van nieuwe antischimmelverbindingen met kleine volumes en automatisering. Deze aanpak versnelt de ontwikkeling van effectieve antifungale therapieën aanzienlijk.

Bouillon Microdilution In Vitro Screening: een gemakkelijke en snelle methode om te ontdekken van nieuwe antischimmel Compounds

Meer video's verkennen