Name: Microfluidic Chips voor In Situ Crystal röntgendiffractie en In Situ Dynamische lichtverstrooiing voor seriële kristallografie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Leer microfluidische chips fabriceren voor eiwitkristallisatie en röntgendiffractie bij kamertemperatuur. Deze methode minimaliseert mechanische verstoring van kristallen en maakt efficiënte dataverzameling mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Fonds zaad PIER PIF-2015-46, de goedgekeurd verleent 05K16GUA en 05K12GU3, en de "The Hamburg Centrum voor ultrasnelle Imaging-structuur, dynamiek en controle van kwestie op de atoomschaal" excellentie cluster van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Het werk van auteurs verbonden met het centrum voor vrije-elektron Laser Science werd gefinancierd door de vereniging van de Helmholtz via gerichte programmamiddelen. De synchrotron MX gegevens zijn verzameld op beamline P14 geëxploiteerd door EMBL Hamburg op de ring van PETRA III opslag (DESY, Hamburg, Duitsland).

<ol><li>Rasmussen, B. F., Stock, A. M., Ringe, D., Petsko, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystalline+ribonuclease+A+loses+function+below+the+dynamical+transition+at+220+K%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystalline ribonuclease A loses function below the dynamical transition at 220 K.</a> Nature. 357 (6377), 423-424 (1992).</li>
<li>Tilton, R. F. J. R., Dewan, J. C., Petsko, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+temperature+on+protein+structure+and+dynamics%3A+X-ray+crystallographic+studies+of+the+protein+ribonuclease-A+at+nine+different+temperatures+from+98+to+320+K%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of temperature on protein structure and dynamics: X-ray crystallographic studies of the protein ribonuclease-A at nine different temperatures from 98 to 320 K.</a> Biochemistry. 31 (9), 2469-2481 (1992).</li>
<li>Fraser, J. S., Clarkson, M. W., Degnan, S. C., Erion, R., Kern, D., Alber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+alternative+structures+of+proline+isomerase+essential+for+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hidden alternative structures of proline isomerase essential for catalysis.</a> Nature. 462 (7273), 669-673 (2009).</li>
<li>Juers, D. H., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+solvent+transport+in+cryo-annealing+of+macromolecular+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">The role of solvent transport in cryo-annealing of macromolecular crystals.</a> Acta Crystallogr. D. 60 (Pt 3), 412-421 (2004).</li>
<li>Huang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+meso+in+situ+serial+X-ray+crystallography+of+soluble+and+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">In meso in situ serial X-ray crystallography of soluble and membrane proteins.</a> Acta Crystallogr. D. 71 (Pt 6), 1238-1256 (2015).</li>
<li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+structure+of+granulin+determined+from+native+nanocrystalline+granulovirus+using+an+X-ray+free-electron+laser%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser.</a> P. Natl. Acad. Sci. USA. 114 (9), 2247-2252 (2017).</li>
<li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+crystallography+on+in+vivo+grown+microcrystals+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (Pt 2), 87-94 (2014).</li>
<li>von Dreele, R. B. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?S0021889806045493">Multipattern Rietveld refinement of protein powder data.</a> J. Appl. Crystallogr. 40 (1), 133-143 (2007).</li>
<li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+technologies+for+membrane+protein+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 21 (4), 559-566 (2011).</li>
<li>Gati, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGati%2C+C+%22Data+processing+and+analysis+in+serial+crystallography+at+advanced+X-ray+sources%22">Data processing and analysis in serial crystallography at advanced X-ray sources</a>. , Dissertation, Hamburg (2015).</li>
<li>Stellato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+macromolecular+serial+crystallography+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (Pt 4), 204-212 (2014).</li>
<li>Botha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+serial+crystallography+at+synchrotron+X-ray+sources+using+slowly+flowing+free-standing+high-viscosity+microstreams%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams.</a> Acta Crystallogr. D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).</li>
<li>Nogly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+serial+millisecond+crystallography+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 2 (Pt 2), 168-176 (2015).</li>
<li>Martin-Garcia, J. M., Conrad, C. E., Coe, J., Roy-Chowdhury, S., Fromme, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4909539/">Review: Serial femtosecond crystallography: A revolution in structural biology.</a> Arch. Biochem. Biophys. 602, 32-47 (2016).</li>
<li>White, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?db5097">CrystFEL: A software suite for snapshot serial crystallography.</a> J Appl Crystallogr. 45 (2), 335-341 (2012).</li>
<li>Perry, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+approach+for+protein+structure+determination+at+room+temperature+via+on-chip+anomalous+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic approach for protein structure determination at room temperature via on-chip anomalous diffraction.</a> Lab Chip. 13 (16), 3183-3187 (2013).</li>
<li>Schlichting, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+femtosecond+crystallography%3A+the+first+five+years%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Serial femtosecond crystallography: the first five years.</a> IUCrJ. 2 (Pt 2), 246-255 (2015).</li>
<li>Sui, S., Perry, S. L. <a target="_blank" href="http://aca.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.4979640">Microfluidics: From crystallization to serial time-resolved crystallography.</a> Struct. Dynam.-US. 4 (3), (2017).</li>
<li>Ghazal, A., Lafleur, J. P., Mortensen, K., Kutter, J. P., Arleth, L., Jensen, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+X-ray+compatible+microfluidics+for+applications+in+soft+materials+and+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Recent advances in X-ray compatible microfluidics for applications in soft materials and life sciences.</a> Lab Chip. 16 (22), 4263-4295 (2016).</li>
<li>Heymann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Room-temperature+serial+crystallography+using+a+kinetically+optimized+microfluidic+device+for+protein+crystallization+and+on-chip+X-ray+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Room-temperature serial crystallography using a kinetically optimized microfluidic device for protein crystallization and on-chip X-ray diffraction.</a> IUCrJ. 1 (Pt 5), 349-360 (2014).</li>
<li>Schubert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicrystal+diffraction+data-collection+approach+for+studying+structural+dynamics+with+millisecond+temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">A multicrystal diffraction data-collection approach for studying structural dynamics with millisecond temporal resolution.</a> IUCrJ. 3 (Pt 6), 393-401 (2016).</li>
<li>Weierstall, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidic+cubic+phase+injector+facilitates+membrane+protein+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography.</a> Nat. Commun. 5, 3309(2014).</li>
<li>Conrad, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+inert+crystal+delivery+medium+for+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography.</a> IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).</li>
<li>Cohen, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goniometer-based+femtosecond+crystallography+with+X-ray+free+electron+lasers%5BTitle%5D)+AND+%22P.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Goniometer-based femtosecond crystallography with X-ray free electron lasers.</a> P. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (48), 17122-17127 (2014).</li>
<li>Erskine, D., YU, P. Y., Freilich, S. C. <a target="_blank" href="http://www.spectralfringe.org/EDI/MyOlderPubs/PolyImide1988.pdf">High-Pressure Visible Spectroscopy of Polyimide Film.</a> J. Polym. Sci. Pol. Lett. 26 (11), 465-468 (1988).</li>
<li>Tsai, C. -L., Yen, H. -J., Chen, W. -C., Liou, G. -S. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2012/jm/c2jm32480f">Novel solution-processable optically isotropic colorless polyimidothioethers-TiO2 hybrids with tunable refractive index.</a> J. Mater. Chem. 22 (33), 17236-17244 (2012).</li>
<li>Destremaut, F., Salmon, J. -B., Qi, L., Chapel, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+with+on-line+dynamic+light+scattering+for+size+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidics with on-line dynamic light scattering for size measurements.</a> Lab Chip. 9 (22), 3289-3296 (2009).</li>
<li>Chastek, T. Q., Iida, K., Amis, E. J., Fasolka, M. J., Beers, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+platform+for+integrated+synthesis+and+dynamic+light+scattering+measurement+of+block+copolymer+micelles%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic platform for integrated synthesis and dynamic light scattering measurement of block copolymer micelles.</a> Lab Chip. 8 (6), 950-957 (2008).</li>
<li>Heymann, M., Fraden, S., Kim, D. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/6589983/">Multi-Height Precision Alignment With Selectively Developed Alignment Marks.</a> J. Microelectromech. S. 23 (2), 424-427 (2014).</li>
<li>Schubert, R., et al. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?jo5012">Reliably distinguishing protein nanocrystals from amorphous precipitate by means of depolarized dynamic light scattering.</a> J Appl Crystallogr. 48 (5), 1476-1484 (2015).</li>
<li>Aghvami, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0925400517304318">Rapid prototyping of cyclic olefin copolymer (COC) microfluidic devices.</a> Sensor Actuat. B-Chem. 247, 940-949 (2017).</li>
<li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWalker%2C+JM+%22The+Proteomics+Protocols+Handbook%22">The Proteomics Protocols Handbook</a>. , Humana Press Inc. Totowa, NJ. (2005).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2815665/">XDS.</a> Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 125-132 (2010).</li>
<li>Vagin, A., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?dz5175">Molecular replacement with MOLREP.</a> Acta Crystallogr. D. 66 (Pt 1), 22-25 (2010).</li>
<li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta Crystallogr. D. 67, 235-242 (2011).</li>
<li>Murshudov, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REFMAC5+for+the+refinement+of+macromolecular+crystal+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures.</a> Acta Crystallogr. D. 67 (Pt 4), 355-367 (2011).</li>
<li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+development+of+Coot%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr. D. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li>
<li>Owen, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+fast+detectors+to+enter+a+new+dimension+in+room-temperature+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">Exploiting fast detectors to enter a new dimension in room-temperature crystallography.</a> Acta Crystallogr. D. 70 (Pt 5), 1248-1256 (2014).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?wi0022">Automatic-Indexing of Rotation Diffraction Patterns.</a> J. Appl. Crystallogr. 21, 67-71 (1988).</li>
<li>Zarrine-Afsar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallography+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">Crystallography on a chip.</a> Acta Crystallogr. D. 68 (Pt 3), 321-323 (2012).</li>
<li>Boukellal, H., Selimović, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+robust+storage+of+drops+and+fluids+in+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple, robust storage of drops and fluids in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).</li>
<li>Aghvami, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+of+cyclic+olefin+copolymer+%28COC%29+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Sens.+Actuator+B+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping of cyclic olefin copolymer (COC) microfluidic devices.</a> Sens. Actuator B Chem. 247, 940-949 (2017).</li>
<li>Shemesh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stationary+nanoliter+droplet+array+with+a+substrate+of+choice+for+single+adherent%2Fnonadherent+cell+incubation+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Stationary nanoliter droplet array with a substrate of choice for single adherent/nonadherent cell incubation and analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (31), 11293-11298 (2014).</li>
<li>Sun, M., Bithi, S. S., Vanapalli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+static+droplet+arrays+with+tuneable+gradients+in+material+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic static droplet arrays with tuneable gradients in material composition.</a> Lab Chip. 11 (23), 3949-3952 (2011).</li>
<li>Shim, J. -U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+and+measurement+of+the+phase+behavior+of+aqueous+solutions+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Control and measurement of the phase behavior of aqueous solutions using microfluidics.</a> J. Am. Chem. Soc. 129 (28), 8825-8835 (2007).</li>
<li>Schubert, R., Meyer, A., Baitan, D., Dierks, K., Perbandt, M., Betzel, C. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.cgd.6b01826">Real-Time Observation of Protein Dense Liquid Cluster Evolution during Nucleation in Protein Crystallization.</a> Cryst. Growth Des. 17 (6), 3579(2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Wij fabriceren microfluidic apparaten voor in situ röntgendiffractie door patronen van epoxyhars als vulling materiaal en polyimide folie als venster materiaal. Onze procedure geoptimaliseerd verschillende stappen van het fabricageproces over vorige X-ray chip ontwerpen16,21. Wij verminderd de venster dikte en daarmee de achtergrond verstrooiing terwijl ook versoepeling fabricage als minder processtappen zijn vereist. in situ kristallisatie via het protocol beschreven heeft aanzienlijke voordelen. Het verzamelen van de gegevens van de diffractie staat bij kamertemperatuur en daarmee sluit de noodzaak cryo bescherming, die in sommige gevallen het risico bevat van de invoering van artefacten in de eiwitstructuur. Bovendien, de kristallen gelden geen fysieke spanning, omdat de overdracht van de kristallen uit hun oorspronkelijke omgeving kan worden vermeden. Via deze procedure, de kristallen handhaven van de hoogste kwaliteit en lijdt niet aan elke behandeling.
In onze ervaring rond de belangrijkste stappen in het protocol beheersen de kristallisatie proces. De parameters voor het verkrijgen van X-ray geschikt kristallen met passende afmetingen moeten empirisch worden geïdentificeerd en rechtstreeks vanuit de damp diffusie experimenten kunnen worden genomen. Met behulp van identieke concentraties van eiwitten en neerslaande niet altijd leiden tot kristallen in verschillende chips, of soms in verschillende putten binnen dezelfde chip. Dit geeft aan dat alle factoren die beïnvloeden crystal nucleatie en groei moeten zorgvuldig worden, zoals moeder liquor samenstelling of kristallisatie kinetiek (via het traject van de verdamping). Als grotere kristallen met hogere resolutie diffract, worden voldoende grote kristallen ideaal gekweekt. Het proces van crystal nucleatie en groei kan worden gevolgd met DLS metingen. Aanpassing van de laser focus binnen de ~ 50 µm kunnen dunne kristallisatie compartimenten van de chip uitdagend en zorgvuldige handmatige aanpassing is mogelijk. Met behulp van putten dieper dan 100 µm, was laser auto-uitlijning haalbaar en betrouwbaar, zodat meerdere putten kunnen worden gecontroleerd door middel van geautomatiseerde overname regelingen.
De chips van polyimide gebaseerd X-ray produceren slechts een lage achtergrond en wij laten zien dat de geschiktheid van deze apparaten voor routine röntgendiffractie gegevensverzameling door het oplossen van de structuren voor drie model eiwitten. De beste resolutie verkregen in chip verschilden, vergeleken met de eerder bereikte resoluties, van aanzienlijk groter eiwit kristallen en conventionele röntgenfoto gegevensverzameling. Dit zou te wijten aan verschillende factoren en kristallisatie voorwaarde optimalisatie kan verder verbeterd de diffractie. Was het mogelijk om in situ diffractie gegevens tot 1,8 Å resolutie toepassen kristal met afmetingen kleiner dan 30 µm te verzamelen. De gedetailleerde analyse van Thaumatine diffractie gegevens geboden inzichten over schade door straling. Als u wilt beperken van de mate van schade door straling, slechts één enkel kristal dienen te worden blootgesteld plaatsen per compartiment in het microfluidic-apparaat, zoals de verspreiding van radicalen en in het naburige kristallen kan optreden. Ter verbetering van de snelheid van gegevensverzameling, moet dit worden geautomatiseerd in de toekomst.
Als gevolg van crystal morfologie, in sommige gevallen kan een voorkeur oriëntatie optreden. Dit was bijvoorbeeld het geval met de dataset thioredoxin, waar de kristallen had een sterk voorkeur oriëntatie ten opzichte van de Vensters van de chip. Zelfs hier, kunnen wij een volledige diffractie dataset verzamelen. Als kristallen een voorkeur oriëntatie in chip vertonen en in het bijzonder als de bijbehorende ruimtegroep ook een lage symmetrie heeft, vervolgens de volledigheid van de dataset moet worden gecontroleerd tijdens de collectie zodanig dat voldoende diffractie patronen riet verzameld.
Time-resolved studies met behulp van deze chips zijn direct mogelijk wanneer met behulp van licht reacties met een benadering van de pomp-sonde geïnduceerde. De polyimide folie lichttransmissie, zodat de laser van de pomp moet worden opgehelderd en anderzijds duidelijke optisch polyimide of COC kan worden gebruikt. De huidige microfluidic geometrieën toegestaan niet voor substraat mixen experimenten nadat de kristallen zijn gegroeid. We verwachten echter dat de beschreven X-ray chip fabricage protocol ook geschikt is voor dergelijke ontwerpen voor beide röntgendiffractie time-resolved mengen evenals verstrooiing benaderingen19.

Het kennen van de 3D structuur van een eiwit is essentieel om te begrijpen van de functionaliteit. In de buurt van de atomaire resolutie structuren zijn tot nu toe meestal verkregen door middel van röntgendiffractie. Deze techniek bloot eiwit kristallen aan Röntgen straling en de resulterende diffractie patronen worden vervolgens geanalyseerd voor structuurbepaling en verfijning. In traditionele röntgendiffractie, is een volledige diffractie dataset opgenomen van een enkele, ideaal groot, kristal bij cryogene temperaturen. Deze kristallen, zijn echter meestal niet triviaal om te groeien en te identificeren van geschikte cryo-behoud voorwaarden kan worden uitdagend op zichzelf en kan soms ook leiden tot afwijkingen van de inheemse proteïne structuur5.
Recente technologische vooruitgang in X-ray gratis-elektron laser (FEL) en synchrotron straallijnen hebben toegestaan om op te lossen structuren van kleinere kristallen, als nieuwe micro-focusing straallijnen, verhoogde X-ray beam schittering en verbeterde X-ray detectoren werd beschikbaar:6,7. Kleine kristallen zijn doorgaans gemakkelijker te groeien dan grote en defect gratis kristallen8,9. Echter lijden kleine kristallen X-ray stralingsschade veel sneller dan grote kristallen. Dit is omdat in vergelijking met een groot kristal, een hogere dosis van X-ray in een kleiner volume van het kristal te diffract naar vergelijkbare resolutie moet worden geprojecteerd. Zelfs cryogene bescherming is daarom vaak niet voldoende om vast te leggen van een volledige diffractie-gegevensset van een enkele microcrystal.
Om te overwinnen deze hindernis, seriële kristallografie uitgegroeid tot de methode van keuze te verzamelen en samenvoegen van diffractie patronen uit vele willekeurig georiënteerde microcrystals te verkrijgen van een volledige dataset. Straling geïnduceerde crystal schade wordt geminimaliseerd door het verspreiden van de totale dosis röntgenstraling gebruikt bij het oplossen van de eiwitstructuur van een over een groot aantal kristallen5,10. In een ' diffract voordat vernietigen ' FEL experimenteren, elk kristal wordt alleen gebruikt voor één blootstelling met behulp van femto-tweede X-ray pulsen. Micro-focus straallijnen op derde generatie synchrotron bronnen kunnen op hun beurt uitvoeren seriële kristallografie met een paar milliseconden korte X-ray blootstelling11,12,13,14. Zonder een kristal trilling of rotatie tijdens het verzamelen van gegevens, echter alleen gedeeltelijke Bragg reflecties kunnen worden opgenomen en dus tienduizenden of meer diffractie patronen zijn meestal nodig voor de structuur vastberadenheid15. Tot op heden, is een gevarieerde set van methoden voor het afleveren van monster ontwikkeld voor seriële kristallografie, als onlangs herziene14,16,17,18,19. Onder degenen, verschillende vaste-target gebaseerd monster levering strategieën werden met succes gecombineerd met crystal rotatie tijdens X-ray belichtingen zodanig dat aanzienlijk minder diffractie patronen ook volledige bestanden bieden kunnen terwijl het ook verbruiken minder monster in vergelijking tot klassieke seriële kristallografie experimenten waar stilstaande beelden zijn opgenomen7,16,20,21,22,23 , 24.
We presenteren een protocol om het fabriceren van microfluidic apparaten met lage X-ray achtergrond. De apparaten zijn patroon van 5-min epoxy lijm met behulp van zachte lithografie en zijn geschikt voor in-situ röntgendiffractie experimenten bij kamertemperatuur, die profiteren van de integratie van de bereiding van de monsters rechtstreeks in de X-ray set-up, in voorkomend geval met time-resolved studies die mengen-geïnduceerde kinetiek18,19 volgen. Microfluidic kanalen zijn hardplastic aan beide zijden met polymere polyimide folie, resulterend in X-ray windows met een gecombineerde dikte van ongeveer 16 µm waarmee voor lage X-ray achtergrond imaging. Alle gebruikte materialen bieden goede oplosmiddel weerstand. Deze fabricage methode is relatief eenvoudig en goedkoop. Na de inkoop van een SU-8 meester wafer, kan alle fabricage worden uitgevoerd buiten een cleanroom in een typische onderzoek lab omgeving.
In een toepassing bijvoorbeeld beschrijven we chips voor goniometer vaste doelstelling seriële kristallografie gebaseerde. Ten eerste, het ontwerp en de fabricage overwegingen voor het gebruik van de capillaire kleppen te splitsen een waterige reactie in een geselecteerd aantal nanoliter formaat druppels microfluidically worden besproken. Dit mechanisme laden vermijdt het verlies van de steekproef van kanaal doden-volume en splitsen kan gemakkelijk uitgevoerd worden handmatig zonder gebruik te maken van pompen of andere apparatuur voor vloeiende bediening. Deze geïsoleerde nanoliter formaat druppels eiwit oplossing zijn gecontroleerde in situ met behulp van Dynamische lichtverstrooiing (DLS &AMP;) controle eiwit crystal nucleatie en groei. Eerder is gebleken dat DLS in microfluidic apparaten die bestaat uit een structuur van de Polydimethylsiloxaan (PDMS metingenmogen) gebonden aan een glas dia25,26. Omdat de polyimide laag een hoge transmissie voor golflengtes langer dan 550 heeft nm, de aanpak kan worden uitgebreid naar maten in X-ray transparante chips, bij gebruik van een passende laser golflengte27,28. Gebaseerd op de resultaten van Distributielijsten, eerste nucleatie kan worden waargenomen, en verdere druppel verdamping kan worden gestopt met het oog op minder, maar grotere eiwit kristallen.
Na voldoende kristallen geteeld worden, kan volledige röntgendiffractie datasets dan worden verzameld met behulp van goniometer gebaseerd in situ vaste doelstelling seriële röntgendiffractie bij kamertemperatuur. Diffractie datasets worden verwerkt met behulp van een reeks softwarehulpmiddelen en aangepaste scripts op te lossen de kristalstructuur van eiwit. Deze techniek vermijdt artefacten vaak geïnduceerde tijdens cryo-behoud gebruikt in conventionele kristallografie experimenten.
We vergelijken drie eiwit doel structuren die werden opgelost met behulp van over 10-20 µm kleine kristallen gegroeid in chip beter dan 2 Å resolutie. Door het kristalliseren en buigingsinrichting in situ, overslag en vandaar mechanische storingen van fragiele kristallen wordt geminimaliseerd. Dit protocol kan worden toegepast voor eiwit kristallen die diffract op hoge resolutie, evenals lage resolutie (1.7 Å naar 3.0 Å). Zoals bijna elke crystal worden voor diffractie gebruikt kan, wordt kleine monster verspild, waardoor dit een zeer efficiënte crystal leveringsmethode.
Dit protocol biedt een gedetailleerde gids over hoe voor te bereiden X-ray transparante microfluidic chips in situ eiwit kristallisatie en diffractie gegevensverzameling. De procedure is zorgvuldig ontworpen om te profiteren van de microfluidic precisie zonder geavanceerde apparatuur in het lab. Verzamelen van de gegevens op de synchrotron beamline, kan ook door niet-deskundigen zonder een gespecialiseerde goniometer of luchtbevochtiger te gemakkelijk reproduceren de resultaten te worden uitgevoerd. De gepresenteerde techniek kan worden toegepast voor seriële milliseconde kristallografie gegevensverzameling bij kamertemperatuur terwijl de stralingsschade minimaal en zonder invoering van stress aan de kristallen na groei door cryo-bescherming of crystal behandeling. Vandaar dat de beschreven methode is geschikt voor elk eiwit kristallisatie project.

<table><tbody><tr><td>SU-8 3000 Series</td><td>MicroChem Corp.</td><td>SU-8 3000</td><td>Photoresist</td></tr><tr><td>PGMEA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484431</td><td>Ontwikkelaar</td></tr><tr><td>Isopropyl alcohol</td><td></td><td></td><td>Oplosmiddel</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>Oplosmiddel</td></tr><tr><td>Epoxy lijm</td><td>UHU</td><td>Plus Schnellfest 5 min</td><td>Epoxy lijm</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>Silicone</td></tr><tr><td>Kaptonfolie</td><td>Dupont/ American Durafilm</td><td>HN grade, gauge 30 (7.5 &mu;m)</td><td>Polyimide folie</td></tr><tr><td>APTS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td>Chemische stof</td></tr><tr><td>GPTS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440167</td><td>Chemische stof</td></tr><tr><td>Cytop CTX-109AE</td><td>Asahi Glass Co. Ltd</td><td>Cytop CTX-109AE</td><td>Cytop fluoropolymeercoating</td></tr><tr><td>CT-Solv 100E</td><td>Asahi Glass Co. Ltd</td><td>CT-Solv 100E</td><td>Cytop fluoro-oplosmiddel</td></tr><tr><td>HFE-7500</td><td>3M</td><td>Novec 7500</td><td>Gefluoreerd olie</td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>AutoDesk Inc.</td><td>AutoCAD</td><td>CAD-software</td></tr><tr><td>Biopsy Punch</td><td>Harris</td><td>Uni-core 0.75 mm</td><td></td></tr><tr><td>Fotomasker</td><td>JD Photo Data</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 inch wafer</td><td>University Wafer</td><td></td><td>Silicium wafer</td></tr><tr><td>Masker aligner</td><td>S&Uuml;SS MicroTec</td><td>MJB4</td><td>Masker aligner</td></tr><tr><td>PDMS mixer</td><td>Thinky</td><td>ARE-250</td><td></td></tr><tr><td>Plasmamachine</td><td>Diener electronic</td><td>Zepto</td><td></td></tr><tr><td>Thaumatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7638</td><td>Proteïne</td></tr><tr><td>Glucose Isomerase</td><td>Hamton Research</td><td>HR7-102</td><td>Proteïne</td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B9754</td><td>Chemische stof</td></tr><tr><td>Natriumtartraat</td><td>Merck</td><td>106664</td><td>Chemische stof</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10812846001</td><td>Chemische stof</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>6763.2</td><td>Chemische stof</td></tr><tr><td>Magnesiumchloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208337</td><td>Chemische stof</td></tr><tr><td>Ammoniumsulfaat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4418</td><td>Chemische stof</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td>Chemische stof</td></tr><tr><td>Natriumchloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1064060250</td><td>Chemische stof</td></tr><tr><td>PEG1500</td><td>Molecular Dimensions</td><td>MD2-100-6</td><td>Chemische stof</td></tr><tr><td>SPG buffer</td><td>Jena Bioscience</td><td>CSS-389</td><td>Chemische stof</td></tr><tr><td>SpectroLight600</td><td>XtalConcepts</td><td></td><td>DLS-instrument</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Spectrofotometer</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultimaker2</td><td>Ultimaker</td><td></td><td>3D-printer</td></tr><tr><td>Form2</td><td>Formlabs</td><td></td><td>3D-printer</td></tr><tr><td>Amicon Filter</td><td>Sartorius Stedim</td><td></td><td>0.2 &micro;m filter</td></tr><tr><td>Slangen</td><td>Adtech Polymer Engineering Ltd</td><td>Bioblock/05</td><td>PTFE-slang 0,3 mm binnendiameter x 0,76 mm buitendiameter</td></tr><tr><td>Spuiten&nbsp;</td><td>BD</td><td>309628</td><td>1ml Luer-Lock Tip</td></tr><tr><td>Naald&nbsp;</td><td>Terumo Agani Needle</td><td>AN*2716R1</td><td>27Gx5/8"</td></tr></tbody></table>

microfluidic chips voor in situ crystal röntgendiffractie en in situ dynamische lichtverstrooiing voor seriële kristallografie

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Dit protocol beschrijft om microfluidic apparaten met lage X-ray achtergrond geoptimaliseerd voor goniometer vaste doelstelling seriële kristallografie gebaseerde. De apparaten zijn patroon van epoxy lijm met behulp van zachte lithografie en zijn geschikt voor in situ röntgendiffractie experimenten bij kamertemperatuur. De monster-putten zijn hardplastic aan beide zijden bekleed met polymere polyimide folie windows waarmee diffractie gegevensverzameling met lage X-ray achtergrond. Deze fabricage methode is undemanding en goedkoop. Na de inkoop van een SU-8 meester wafer, kan alle fabricage worden uitgevoerd buiten een cleanroom in een typische onderzoeksomgeving lab. Het protocol voor ontwerp en fabricage van chip gebruiken capillaire kleppen te splitsen een waterige reactie in gedefinieerde nanoliter formaat druppeltjes microfluidically. Dit mechanisme laden vermijdt het verlies van de steekproef van dode-volume kanaal en kan gemakkelijk handmatig worden uitgevoerd zonder gebruik te maken van pompen of andere apparatuur voor vloeiende bediening. We beschrijven hoe geïsoleerd nanoliter formaat druppels eiwit oplossing kan worden gecontroleerd in situ door dynamische licht verstrooiing controle eiwit crystal nucleatie en groei. Nadat geschikt kristallen geteeld worden, kan volledige röntgendiffractie datasets worden verzameld met behulp van goniometer gebaseerd in situ vaste doelstelling seriële röntgendiffractie bij kamertemperatuur. Het protocol biedt aangepaste scripts voor het verwerken van diffractie datasets met behulp van een suite van softwaretools op te lossen en verfijnen van de eiwit-kristalstructuur. Deze aanpak voorkomt de artefacten die eventueel veroorzaakte tijdens cryo-behoud of handmatige crystal behandeling in conventionele kristallografie experimenten. We presenteren en vergelijk drie eiwit structuren die werden opgelost met behulp van kleine kristallen met afmetingen van ongeveer 10-20 µm gegroeid in chip. Door het kristalliseren en buigingsinrichting in situ, overslag en vandaar mechanische storingen van fragiele kristallen wordt geminimaliseerd. Het protocol detailleert hoe te fabriceren van een aangepaste X-ray transparante microfluidic chip geschikt voor in situ seriële kristallografie. Zoals bijna elke crystal kan worden gebruikt voor het verzamelen van de gegevens van diffractie, zijn deze microfluidic chips een zeer efficiënt crystal leveringsmethode.

Dit protocol beschrijft in detail hoe te fabriceren en te exploiteren van microfluidic apparaten voor röntgendiffractie gegevensverzameling bij kamertemperatuur. Bovendien, het beschrijft hoe eiwitten kristallisatie controleren door Dynamische lichtverstrooiing en hoe om te verwerken en analyseren diffractie gegevens verkregen.

Microfluidic Chips voor In Situ Crystal röntgendiffractie en In Situ Dynamische lichtverstrooiing voor seriële kristallografie

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Het algemene doel van deze procedure is om een microfluïdisch apparaat te fabriceren en te bedienen voor het verzamelen van röntgendiffractiegegevens van eiwitkristallisatie bij kamertemperatuur. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat kristallisatie binnen de chip de mechanische verstoring van de eiwitkristallen minimaliseert. Deze röntgentransparante chips zijn eenvoudig te produceren, kunnen direct op goniometers van de meeste synchrotronstralenlijnen worden gemonteerd en maken efficiënt gebruik van beschikbare kristallen bij het verzamelen van röntgendiffractiegegevens.Plaats eerst een mastervorm van het ontwerp van de röntgenchip in een 10 centimeter grote Petrischaal bekleed met aluminiumfolie. Meng ongeveer 30 gram totaal PDMS-basis en verhardingsmiddel in een verhouding van 10 tot 1 en giet de PDMS op de master tot een hoogte van vier millimeter. Ontgast de PDMS gedurende vijf minuten in een vacuümexsiccator en blaas lucht om resterende luchtbellen op het oppervlak van de PDMS te verwijderen.Verhard de PDMS in een oven gedurende een uur bij 70 graden Celsius. Schil vervolgens voorzichtig de verharde PDMS-vorm van de master. Gebruik een scalpel om het overtollige PDMS weg te snijden.Voor de fabricage van de röntgenchip, zorg ervoor dat de werkruimte zo is ingericht dat er gemakkelijk toegang is tot alle benodigde apparatuur en componenten tijdens het gieten van het epoxy-vorm. Om de chipfabricage te beginnen, verdun de voorlopers van een tweede-component epoxyhars met ethanol tot een uiteindelijke ethanolmassaconcentratie van 40% per gewicht. Meng epoxyhars en ethanol samen met behulp van een vortexmixer.Ontgast de PDMS-vorm gedurende 30 minuten in een vacuümexsiccator om ervoor te zorgen dat de PDMS later kleine luchtbellen uit de epoxyhars kan absorberen. Snijd een stuk van 70 millimeter bij 70 millimeter van 7,5 micron dik polyimidefolie en wikkel de folie rond een glazen schuif van 75 millimeter bij 50 millimeter. Plak de randen van de folie op de achterkant van de schuif om een platte, stijve polyimide-oppervlakte te vormen.Behandel de polyimidefolie met een schuif achterin met zuurstofplasma gedurende 20 seconden. Bewaar vervolgens de folie gedurende vijf minuten in een 1%volume-oplossing van APTS of GPTS bij 20 graden Celsius. Tijdens silanisatie, meng de epoxyharsvoorloperoplossingen grondig met een kleine spatel.Breng de ontgaste PDMS-vorm van de vacuümexsiccator naar een vlak oppervlak. Droog de gesilaniseerde polyimidefolie met geperste lucht of stikstofgas. Breng snel een druppel van het harsmengsel aan op elke microstructuur op de mal.Leg de polyimidefolie met een schuif achterin met de zijde naar beneden op het epoxyhars en druk stevig op de schuif. Bedek de samenstelling met een plastic folie en een metalen plaat. Plaats gewichten op de metalen plaat om een druk van maximaal 1,4 newton per vierkante centimeter op de samenstelling uit te oefenen.Na 15 minuten scheidt u voorzichtig de glazen schuif van de epoxy-gepaterde polyimidefolie en veegt u de polyimidefolie droog. Plaats de plastic folie, de metalen plaat en de gewichten weer terug. Laat het epoxy gedurende een uur bij kamertemperatuur uitharden.Verwijder vervolgens de gewichten, de metalen plaat en de plastic folie. Schil voorzichtig de gepaterde polyimidefolie van de PDMS-mal. Behandel de gepaterde folie gedurende 20 seconden met plasma en silaniseer de gepaterde folie met APTS of GPTS, zoals eerder beschreven.Silaniseer een ongerepte polyimidefolie met de andere silaniseringsoplossing onder dezelfde omstandigheden. Droog beide vellen met geperste lucht. Breng vervolgens een druppel gedeïoniseerd water aan op een schone, droge, platte ondergrond.Snijd individuele chipstructuren op polyimidefolie en plaats de gepaterde polyimidefolie met de epoxyzijde naar boven op de druppel water en maak de folie voorzichtig glad totdat deze volledig plat is. Plaats de tweede polyimidefolie op de gepaterde folie met de gesilaniseerde zijde naar beneden. Schuim voorzichtig met de hand de tweede folie van hoek tot tegenoverliggende hoek om luchtbellen te verdrijven en de polyimidevellen aan elkaar te hechten.Om de toegangspoorten te beginnen fabriceren, snijdt u uit een verharde, vier millimeter dikke PDMS-plaat een blok van voldoende grootte om alle poorten in de polyimide röntgenchip te bedekken zonder het kristallisatiecompartiment te bedekken. Behandel, silaniseer en droog de polyimidechip en de PDMS-blok. Druk het behandelde blok op de chip boven de poorten.Bedek de chip met een plastic folie, een schone glazen schuif en een metalen plaat. Oefen gedurende een uur 1,4 newton per vierkante centimeter druk uit. Gebruik vervolgens een 0,75 millimeter biopsiepons om inlaat- en uitlaatgaten te ponsen waar gemarkeerd in het chipontwerp.Verzegeld de achterkant van de chip met polyimide film elektrische isolatietape. Verdun vervolgens een 9%gewichtsoplossing van transparant fluoropolymeercoatingmateriaal tot 0,45%gewicht met een gefluoreerd oplosmiddel. Verbind een 27-gauge, 5/8-inch naald met de spuit.Pass de polytetrafluorethyleenbuis over het uiteinde van de naald. Laad de fluoropolymeeroplossing in een ene-milliliter Luer lock-spuit. Verbind het andere uiteinde van de buis met de röntgenchipuitlaat.Injecteer de fluoropolymeeroplossing in de chip totdat alle kanalen zijn gevuld en verwijder overtollige fluoropolymeeroplossing door een spuit gevuld met lucht te gebruiken. Plaats de gevulde chip met de platte kant naar beneden op een hotplate bij 190 graden Celsius. Verwarm de chip gedurende vijf minuten om het oplosmiddel te verdampen, waardoor de kanalen worden bedekt met het fluoropolymeer.Voor de kristallisatieprocedure, filter de gekozen eiwit-oplossing met een 0,2-micronfilter. Centrifugeer de oplossing gedurende 15 minuten bij 16.100 keer g en 20 graden Celsius en herstel het supernatant voor de kristallisatie-experimenten. Om de kristallisatieprocedure te beginnen, combineer gelijke volumes van een eiwit-oplossing en zijn precipitant.Zuig ongeveer

microfluidic-chips-for-situ-crystal-x-ray-diffraction-situ-dynamic

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Het gebruik van elektronenkanaliseringscontrastbeeldvorming in een rasterelektronenmicroscoop om defecten in III-V/Si heteroexpitaxiaal dunne films te karakteriseren, wordt beschreven. Deze methode levert vergelijkbare resultaten op als transmissie-elektronenmicroscopie met vlakbeeld, maar in aanzienlijk minder tijd vanwege het ontbreken van vereiste monstervoorbereiding.

Electron Channeling Contrast Imaging voor Rapid III-V hetero karakterisatie

We beschrijven de instelling van een beamline bedoeld voor het uitvoeren van snelle twee-dimensionale röntgenfoto fluorescentie en x-ray microdiffraction toewijzing van kristallen of poeder monsters met Laue (polychromatische straling) of poeder (monochromatische straling) diffractie. De resulterende kaarten geven informatie over stam, oriëntatie, fase distributie en plastische vervorming.

Synchrotron X-ray Microdiffraction en fluorescentie beeldvorming van minerale en Rock monsters

Dit artikel beschrijft het fabricageprotocol van microfluïdische chips ontwikkeld voor on-chip eiwitkristallisatie met de dialysemethode en in situ röntgendiffractie-experimenten. Het microfabricatieproces maakt het mogelijk om een semipermeabel geregenereerd cellulosedialysemembraan te integreren met elke moleculaire gewichtsafsnijd, tussen twee lagen van de chip.

Kristallisatie van eiwitten op chip door microdialyse voor in Situ röntgendiffractiestudies

Een veelzijdig microfluïdisch apparaat wordt beschreven dat de kristallisatie van een enzym mogelijk maakt met behulp van de contradiffusiemethode, de introductie van een substraat in de kristallen door weken en de 3D-structuurbepaling van het enzym: substraatcomplex door een seriële analyse van kristallen in de chip bij kamertemperatuur.

Kristallisatie en structurele bepaling van een enzym: substraatcomplex door seriële kristallografie in een veelzijdige microfluïdische chip

Het hier gepresenteerde protocol beschrijft het gebruik van Spotiton, een nieuw robotsysteem, om twee interessante monsters af te leveren op een zelfafvoerend nanodraadrooster dat zich minimaal 90 ms mengt voorafgaand aan vitrificatie in vloeibaar cryogeen.

Cryo-Elektron Microscopische Rastervoorbereiding voor tijd-opgeloste studies met behulp van een nieuw robotsysteem, Spotiton

De signaal-ruisverhouding van gegevens is een van de belangrijkste overwegingen bij het uitvoeren van röntgendiffractiemetingen vanaf microkristallen. De VMXm beamline biedt een geluidsarme omgeving en microbeam voor dergelijke experimenten. Hier beschrijven we monstervoorbereidingsmethoden voor het monteren en koelen van microkristallen voor VMXm en andere microfocus macromoleculaire kristallografiebundellijnen.

Een monstervoorbereidingspijplijn voor microkristallen op de VMXm Beamline

Hier beschrijven we de procedures die in ons laboratorium zijn ontwikkeld voor het bereiden van poeders van kleine molecuulkristallen voor microkristalelektronendiffractie (MicroED) -experimenten.

Microkristal elektronendiffractie van kleine moleculen

Hier beschrijven we hoe we de geautomatiseerde macromoleculaire kristallografiepijplijnen kunnen gebruiken voor eiwit-naar-structuur, snelle ligand-eiwitcomplexanalyse en grootschalige fragmentscreening op basis van de CrystalDirect-technologie in het HTX-laboratorium in EMBL Grenoble.

De geautomatiseerde kristallografiepijpleidingen in de EMBL HTX-faciliteit in Grenoble

Deze bijdrage beschrijft hoe eiwitkristallisatie op kristal-op-kristalapparaten kan worden ingesteld en hoe geautomatiseerde seriële gegevensverzameling bij kamertemperatuur kan worden uitgevoerd met behulp van het on-chip kristallisatieplatform.

On-chip kristallisatie en grootschalige seriële diffractie bij kamertemperatuur

Hier worden protocollen beschreven om virusassemblages voor te bereiden die geschikt zijn voor vloeistof-EM- en cryo-EM-analyse op nanoschaal met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie.

Geavanceerde beeldvorming met hoge resolutie van virusassemblages in vloeistof en ijs

Leer microfluidische chips fabriceren voor eiwitkristallisatie en röntgendiffractie bij kamertemperatuur. Deze methode minimaliseert mechanische verstoring van kristallen en maakt efficiënte dataverzameling mogelijk.

Microfluidic Chips voor In Situ Crystal röntgendiffractie en In Situ Dynamische lichtverstrooiing voor seriële kristallografie

Meer video's verkennen