Microfluidic Chips voor In Situ Crystal röntgendiffractie en In Situ Dynamische lichtverstrooiing voor seriële kristallografie
24 april 2018
Dit protocol beschrijft in detail hoe te fabriceren en te exploiteren van microfluidic apparaten voor röntgendiffractie gegevensverzameling bij kamertemperatuur. Bovendien, het beschrijft hoe eiwitten kristallisatie controleren door Dynamische lichtverstrooiing en hoe om te verwerken en analyseren diffractie gegevens verkregen.
Het algemene doel van deze procedure is om een microfluïdisch apparaat te fabriceren en te bedienen voor het verzamelen van röntgendiffractiegegevens van eiwitkristallisatie bij kamertemperatuur. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat kristallisatie binnen de chip de mechanische verstoring van de eiwitkristallen minimaliseert. Deze röntgentransparante chips zijn eenvoudig te produceren, kunnen direct op goniometers van de meeste synchrotronstralenlijnen worden gemonteerd en maken efficiënt gebruik van beschikbare kristallen bij het verzamelen van röntgendiffractiegegevens.
Plaats eerst een mastervorm van het ontwerp van de röntgenchip in een 10 centimeter grote Petrischaal bekleed met aluminiumfolie. Meng ongeveer 30 gram totaal PDMS-basis en verhardingsmiddel in een verhouding van 10 tot 1 en giet de PDMS op de master tot een hoogte van vier millimeter. Ontgast de PDMS gedurende vijf minuten in een vacuümexsiccator en blaas lucht om resterende luchtbellen op het oppervlak van de PDMS te verwijderen.
Verhard de PDMS in een oven gedurende een uur bij 70 graden Celsius. Schil vervolgens voorzichtig de verharde PDMS-vorm van de master. Gebruik een scalpel om het overtollige PDMS weg te snijden.
Voor de fabricage van de röntgenchip, zorg ervoor dat de werkruimte zo is ingericht dat er gemakkelijk toegang is tot alle benodigde apparatuur en componenten tijdens het gieten van het epoxy-vorm. Om de chipfabricage te beginnen, verdun de voorlopers van een tweede-component epoxyhars met ethanol tot een uiteindelijke ethanolmassaconcentratie van 40% per gewicht. Meng epoxyhars en ethanol samen met behulp van een vortexmixer.
Ontgast de PDMS-vorm gedurende 30 minuten in een vacuümexsiccator om ervoor te zorgen dat de PDMS later kleine luchtbellen uit de epoxyhars kan absorberen. Snijd een stuk van 70 millimeter bij 70 millimeter van 7,5 micron dik polyimidefolie en wikkel de folie rond een glazen schuif van 75 millimeter bij 50 millimeter. Plak de randen van de folie op de achterkant van de schuif om een platte, stijve polyimide-oppervlakte te vormen.
Behandel de polyimidefolie met een schuif achterin met zuurstofplasma gedurende 20 seconden. Bewaar vervolgens de folie gedurende vijf minuten in een 1%volume-oplossing van APTS of GPTS bij 20 graden Celsius. Tijdens silanisatie, meng de epoxyharsvoorloperoplossingen grondig met een kleine spatel.
Breng de ontgaste PDMS-vorm van de vacuümexsiccator naar een vlak oppervlak. Droog de gesilaniseerde polyimidefolie met geperste lucht of stikstofgas. Breng snel een druppel van het harsmengsel aan op elke microstructuur op de mal.
Leg de polyimidefolie met een schuif achterin met de zijde naar beneden op het epoxyhars en druk stevig op de schuif. Bedek de samenstelling met een plastic folie en een metalen plaat. Plaats gewichten op de metalen plaat om een druk van maximaal 1,4 newton per vierkante centimeter op de samenstelling uit te oefenen.
Na 15 minuten scheidt u voorzichtig de glazen schuif van de epoxy-gepaterde polyimidefolie en veegt u de polyimidefolie droog. Plaats de plastic folie, de metalen plaat en de gewichten weer terug. Laat het epoxy gedurende een uur bij kamertemperatuur uitharden.
Verwijder vervolgens de gewichten, de metalen plaat en de plastic folie. Schil voorzichtig de gepaterde polyimidefolie van de PDMS-mal. Behandel de gepaterde folie gedurende 20 seconden met plasma en silaniseer de gepaterde folie met APTS of GPTS, zoals eerder beschreven.
Silaniseer een ongerepte polyimidefolie met de andere silaniseringsoplossing onder dezelfde omstandigheden. Droog beide vellen met geperste lucht. Breng vervolgens een druppel gedeïoniseerd water aan op een schone, droge, platte ondergrond.
Snijd individuele chipstructuren op polyimidefolie en plaats de gepaterde polyimidefolie met de epoxyzijde naar boven op de druppel water en maak de folie voorzichtig glad totdat deze volledig plat is. Plaats de tweede polyimidefolie op de gepaterde folie met de gesilaniseerde zijde naar beneden. Schuim voorzichtig met de hand de tweede folie van hoek tot tegenoverliggende hoek om luchtbellen te verdrijven en de polyimidevellen aan elkaar te hechten.
Om de toegangspoorten te beginnen fabriceren, snijdt u uit een verharde, vier millimeter dikke PDMS-plaat een blok van voldoende grootte om alle poorten in de polyimide röntgenchip te bedekken zonder het kristallisatiecompartiment te bedekken. Behandel, silaniseer en droog de polyimidechip en de PDMS-blok. Druk het behandelde blok op de chip boven de poorten.
Bedek de chip met een plastic folie, een schone glazen schuif en een metalen plaat. Oefen gedurende een uur 1,4 newton per vierkante centimeter druk uit. Gebruik vervolgens een 0,75 millimeter biopsiepons om inlaat- en uitlaatgaten te ponsen waar gemarkeerd in het chipontwerp.
Verzegeld de achterkant van de chip met polyimide film elektrische isolatietape. Verdun vervolgens een 9%gewichtsoplossing van transparant fluoropolymeercoatingmateriaal tot 0,45%gewicht met een gefluoreerd oplosmiddel. Verbind een 27-gauge, 5/8-inch naald met de spuit.
Pass de polytetrafluorethyleenbuis over het uiteinde van de naald. Laad de fluoropolymeeroplossing in een ene-milliliter Luer lock-spuit. Verbind het andere uiteinde van de buis met de röntgenchipuitlaat.
Injecteer de fluoropolymeeroplossing in de chip totdat alle kanalen zijn gevuld en verwijder overtollige fluoropolymeeroplossing door een spuit gevuld met lucht te gebruiken. Plaats de gevulde chip met de platte kant naar beneden op een hotplate bij 190 graden Celsius. Verwarm de chip gedurende vijf minuten om het oplosmiddel te verdampen, waardoor de kanalen worden bedekt met het fluoropolymeer.
Voor de kristallisatieprocedure, filter de gekozen eiwit-oplossing met een 0,2-micronfilter. Centrifugeer de oplossing gedurende 15 minuten bij 16.100 keer g en 20 graden Celsius en herstel het supernatant voor de kristallisatie-experimenten. Om de kristallisatieprocedure te beginnen, combineer gelijke volumes van een eiwit-oplossing en zijn precipitant.
Zuig ongeveer
Overzicht
Dit protocol beschrijft de fabricage en het gebruik van microfluïdische apparaten voor de verzameling van röntgen diffractiegegevens bij kamertemperatuur. Daarnaast wordt er gedetailleerd ingegaan op het monitoren van proteïnekristallisatie met behulp van dynamische lichtverstrooiing en de daaropvolgende verwerking en analyse van de diffractiegegevens.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Microfluidica
- Proteïnekristallisatie
- Röntgen diffractie
Achtergrond
- Microfluïdische apparaten minimaliseren mechanische verstoringen van proteïnekristallen.
- Röntgenstraal-transparante chips kunnen eenvoudig worden geproduceerd en worden gemonteerd op synchrotron-beamlines.
- Efficiënt gebruik van beschikbare kristallen verbetert de gegevensverzameling.
- Dynamische lichtverstrooiing wordt gebruikt om kristallisatieprocessen te monitoren.
Doel van de studie
- Om een microfluïdisch apparaat te vervaardigen voor proteïnekristallisatie.
- Om rögendiffractiegegevens bij kamertemperatuur te verzamelen.
- Om de diffractiegegevens te analyseren voor structurele inzichten.
Gebruikte methoden
- Fabricage van PDMS- en epoxymallen voor microfluïdische apparaten.
- Silanisatie van polyimidefolies om de hechting te verbeteren.
- Injectie van kristallisatie-oplossingen in de microfluïdische chip.
- Monitoring van de kristallisatie onder een microscoop.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle vervaardiging van microfluïdische apparaten voor eiwitkristallisatie.
- Effectieve monitoring van kristallisatie met behulp van dynamische lichtverstrooiing.
- Verzameling van hoogwaardige röntgendiffractiegegevens.
- Demonstratie van minimale mechanische verstoring van de kristallen.
Conclusies
- Microfluïdische apparaten zijn voordelig voor eiwitkristallisatieonderzoeken.
- Het protocol biedt een betrouwbare methode voor de verzameling van röntgen diffractiegegevens.
- Dynamische lichtverstrooiing is een waardevol instrument voor het monitoren van kristallisatie.
Veelgestelde Vragen
Industriële Relevantie voor Directie
Deze microfluïdische benadering maakt seriële kristallografie bij kamertemperatuur mogelijk met minimale mechanische verstoring van fragiele proteïnekristallen, wat vroege targetvalidatie ondersteunt door het behoud van native conformationele toestanden. Door de integratie van in situ dynamische lichtverstrooiing voor nucleatiemonitoring en goniometer-gebaseerde data-acquisitie met vaste targets, verbetert deze methode het voorspellend vertrouwen in structurele assays en vermindert het uitval door kristalschade. Het ontwerp met een lage röntgenachtergrond en de compatibiliteit met standaard synchrotron-beamlines verhogen de doorvoer en reproduceerbaarheid in fragment-screening en lead-optimalisatiecampagnes.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt structurele analyse van therapeutische targets mogelijk met behulp van kristallen in natuurlijke toestand die in situ zijn gekweekt en geanalyseerd, waardoor artefacten door cryopreservatie of handmatige manipulatie worden verminderd.
- Operationele waarde: Ondersteunt een uiterst efficiënt gebruik van kristallen, waarbij vrijwel elk gekweekt kristal bijdraagt aan de diffractiegegevens, wat de opbrengst van de assay verbetert en het verbruik van reagentia vermindert.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Vergemakkelijkt de standaardisatie van assays via de vorming van nanoliterdruppels met capillaire kleppen, waardoor consistente monstervolumes worden gegarandeerd voor reproduceerbare screening van nucleatie en groei.
- Operationele waarde: Elimineert de noodzaak van pompen of gespecialiseerde vloeistofactuatie, wat een handmatige, goedkope opstelling in omgevingen buiten de cleanroom mogelijk maakt voor schaalbare implementatie van assays.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een ziekterellevant systeem voor het monitoren van eiwit-eiwitinteracties of ligand-geïnduceerde conformationele veranderingen via in situ DLS en diffractie, wat bijdraagt aan mechanische risicoreductie.
- Operationele waarde: Maakt een naadloze overgang mogelijk van kristallisatie naar datacollectie op dezelfde chip, waardoor stappen voor monstertransport worden geminimaliseerd en de integriteit van het target behouden blijft voor verdere preklinische evaluatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in de workflow voor ontdekking, van hit-bevestiging tot lead-identificatie, waarbij structurele gegevens uit kristallografie bij kamertemperatuur worden gebruikt voor SAR- en bindingsmodusanalyse.
- Discovery Biology: Ondersteunt het testen van hypothesen door snelle structurele validatie van hits of fragmenten mogelijk te maken met behulp van kristallen die zijn gegroeid onder bijna-fysiologische omstandigheden.
- Screening: Zorgt voor assay-gereedheid via gestandaardiseerde, reproduceerbare nanoliter-compartimentering en in situ monitoring via DLS, waardoor alleen goed gevormde kristallen doorgaan naar diffractie.
- Analytics: Genereert kwantitatieve metrieken voor het verval van diffractie-intensiteit en R-factor trends over tijd, waardoor teams stralingsschade en datakwaliteit over seriële datasets kunnen beoordelen.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinische continuïteit door structurele inzichten te bieden in target-flexibiliteit en ligandbinding, wat bijdraagt aan affiniteitsrijping en specificiteitsoptimalisatie.
- Enterprise hergebruik: Vormt een herbruikbare platformcapaciteit, aangezien het chipontwerp kan worden aangepast aan verschillende compartimentgroottes of -aantallen zonder de kernstappen van de fabricage opnieuw te formuleren.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit door kristalperturbatie en stralingsgeïnduceerde artefacten te minimaliseren, waardoor het vertrouwen in structurele interpretaties van target-ligand interacties toeneemt.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid door batchfabricage vanuit één enkele PDMS-master, waarbij alle stappen buiten cleanrooms in ~3 uur kunnen worden uitgevoerd.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door snelle, schadebewuste structurele karakterisering mogelijk te maken, wat het biologische risico in een late stadium van lead-optimalisatie vermindert.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering door betrouwbare structurele read-outs die het verder ontwikkelen of stopzetten van verbindingen informeren op basis van bewijs van target-engagement.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in microfluidisch ontwerp, proteïnekristallisatie en synchrotron-gebaseerde röntgendataverzameling.
- Afhankelijk van toegang tot beamlines uitgerust met goniometers en softwaretools voor het verwerken van seriële kristallografische datasets (bijv. CrystFEL, phenix.refine).
- Noodzaak van standaardisatie tussen teams van structurele biologie, microfluidica en data-analyse-eenheden voor een consistente chipvoorbereiding en diffractiemonitoring.
- Aanpassing aan verschillende modelsystemen kan wijzigingen in de oppervlaktechemie of kanaaldimensies vereisen om rekening te houden met variërende eiwitviscositeiten of kristallisatiekinetiek.
- Praktische beperkingen omvatten de accumulatie van stralingsschade in kristalarrays met een hoge dichtheid en de noodzaak van zorgvuldige isolatie van compartimenten om cross-talk tijdens de dataverzameling te voorkomen.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Title
0:38
Polydimethylsiloxane (PDMS) Mold Fabrication and In Situ X-ray Chip Fabrication
4:59
Fluid Delivery Access Ports and Surface Treatment
6:51
Protein Preparation and Crystallization
8:51
Results: Crystallization and In Situ X-ray Diffraction of Protein Crystals
10:41
Conclusion
