Meten van endoreduplicatie door Stroom Cytometry van geïsoleerde Knol protoplasten

Het algemene doel van dit experiment is om niveaus van endoreduplicatie in aardappelknollen te evalueren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de morfologie van aardappelknollen, zoals het ontwikkelingsstadium waarin knollenweefsels endoreduplicatie ondergaan. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het veel duidelijkere resultaten oplevert in vergelijking met typische flowcytometrie preparaten.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Parker Laimbeer. Een afgestudeerde student uit mijn laboratorium. Na het voorbereiden van oplossingen en buffers volgens het tekstprotocol, steriliseer de aardappelknollen oppervlakkig door ze minimaal vijf minuten in 71% ethanol onder te dompelen.

Verwijder de plantmaterialen uit de ethanol en laat ze aan de lucht drogen. Bereid en label steriele 50 milliliter conische buisjes voor elke monster en verdeel 15 milliliter van de gefilterde geplasmolyseerde incubatieoplossing of PIS in elk. Gebruik ofwel een gesteriliseerde scalpel of een kurkboorder om een monster van ongeveer een kubieke centimeter van het te steriliseren weefsel te nemen.

Gebruik de gesteriliseerde scalpel om het weefsel grof in stukken van ongeveer drie kubieke millimeter te snijden. Breng het weefsel over in een conisch buisje met PIS. Bewaar het weefsel vervolgens een nacht bij vier graden Celsius.

Om aardappel protoplasten te genereren, begin door een geschikte hoeveelheid enzymoplossing of ES te bereiden en te filteren met 0,71 molair mannitool, drie millimolair calciumchloride, één millimolair monokaliumfosfaat. Één millimolair magnesiumchloride, 4% Onozuka R-10 cellulase, 0,8% Macerozyme R-10, 1% hemi cellulase en 10 millimolair MES-buffer, pH 5,8. Gebruik een serologische pipette om de PIS van de monsters in de buisjes weg te zuigen.

Voeg 10 milliliter van de ES toe aan elk monster en draai de buisjes twee tot drie keer om. Bewaar de monsters vervolgens een nacht bij 29% Celsius en 180 RPM. Op dag drie, om de protoplasten te oogsten en te wassen, haal de monsters uit de shaker en laat ze ongeveer 10 minuten bezinken.

Gebruik een serologische pipette om zoveel mogelijk van de ES-oplossing weg te zuigen, zorg ervoor dat je het gedigesteerde weefsel vermijdt. Gebruik vervolgens een micropipet en houd het buisje schuin terwijl je de resterende ES-oplossing verwijdert, nogmaals zorg ervoor dat je het gedigesteerde weefsel vermijdt. Het is van cruciaal belang om zoveel mogelijk van de protoplast wasoplossing te verwijderen om schade aan de kernen te voorkomen.

Houd het buisje schuin vast om de oplossing te verwijderen terwijl de protoplasten blijven. Voeg 15 milliliter van PWS toe aan elk monster. Draai het buisje voorzichtig twee tot drie keer om.

Laat de protoplasten 10 minuten bezinken. Gebruik vervolgens een serologische pipette om de PWS te verwijderen. Gebruik een micropipet om eventueel resterend vocht weg te zuigen.

Terwijl je de monsters op ijs houdt, voeg je 1,5 milliliter ijskoud FCB toe aan elk buisje. Schud of vortex kortjes elke monster om geaggregeerde weefsels te breken. Het is belangrijk om de klonten van knollenweefsel te breken zodat de FCB volledig door de cellen kan trekken en de kernen kan vrijgeven.

Als er een controle wordt toegevoegd, begin dan bij deze stap door een klein blad met een scheermes fijn te hakken in 1,5 milliliter ijskoud FCB. Controlemonsters moeten dezelfde ploiditeit hebben als de experimentele monsters, bij voorkeur van hetzelfde genotype. Plaats een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje met de punt afgesneden en 106 micrometer metaalmaas gesmolten aan de bodem in een twee milliliter microcentrifugebuisje.

Laat vervolgens een milliliter van de FCB weefsel suspensie door het filter lopen. Voeg 250 microliter van de RNA-oplossing toe aan elk monster. Draai de buisjes om en bewaar ze 30 minuten op kamertemperatuur.

Voeg 125 microliter van de eerder bereide propidiumjodide of PI-oplossing toe aan elk monster. Draai de buisjes om en bewaar ze 30 minuten op ijs. Gebruik de monsters zo snel mogelijk en binnen twee uur om degradatie te voorkomen.

Maak twee puntdiagrammen met een logaritmische schaal van voorwaartse verspreiding versus zijwaartse verspreiding en PI versus zijwaartse verspreiding. Maak ook een histogram met PI op de x-as. Logaritmische schaal is vereist om ervoor te zorgen dat alle gebeurtenissen binnen de schaal vallen, omdat kernen sterk kunnen verschillen in fluorescentie.

Laad een buisje met een bekend controlemonster, zoals in vitro bladweefsel van een monster genotype. Pas de spanning aan zodat alle gebeurtenissen binnen de schaal vallen. Noteer het kanaal van de 2C piek in het controlemonster.

De 2C pieken van de experimentele monsters moeten op dezelfde locatie vallen. Laad een experimenteel knollenmonster en zorg er opnieuw voor dat alle gebeurtenissen binnen de schaal vallen. Als aanpassingen nodig zijn, herhaal de spanningsaanpassing van het controlemonster om het kanaal van 2C pieken te identificeren.

Gate de protoplast kernen handmatig met behulp van het zijwaartse verspreiding versus PI-diagram. Zet vervolgens het PI-histogram zo in dat alleen de gegate protoplast kernen regio wordt weergegeven. Verzamel het gewenste aantal gebeurtenissen van elk monster.

Vaak gebruiken onderzoekers 10.000 gegate gebeurtenissen voor flowcytometrie. Echter, 2000 gebeurtenissen worden hier gebruikt voor knollen protoplast monsters om meer monsters en monsters met lage concentraties te kunnen verwerken. Het genereren van protoplasten is noodzakelijk om herhaalbare flowcytometrie resultaten van aardappelknollen te bereiken.

De algemene morfologie hiervan wordt hier getoond. De scheiding tussen merg en perimedullaire parenchym is geïllustreerd met zwarte lijnen. De vasculaire ring, die parenchym scheidt van de cortex, wordt aangegeven met een zwarte pijl.

Geïsoleerde protoplasten moeten sfeervormig en sym