Aanpassing van hybridisatie inname van chromatine-geassocieerde eiwitten voor Proteomics op zoogdiercellen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen in ons begrip van genoomregulatie, zoals hoe ziektegeassocieerde sequentievarianten in niet-coderende regio's de genexpressie en regulering beïnvloeden door eiwitbinding te veranderen, en het kan helpen bij het identificeren van die eiwitten. Het grote voordeel van deze techniek is dat het geen enkele vorm van genetische manipulatie van cellen of weefsels vereist, noch antilichamen, en geen voorafgaande kennis van DNA-bindende eiwitten die mogelijk op dat locus met DNA interageren. Het demonstreren van deze procedure zal worden gedaan door Danu Perumalla, een technicus uit mijn laboratorium.

Na het ontwerpen van oligonucleotiden volgens het tekstprotocol, plateer 2 tot 5 keer 10 tot de 5e lymfoblastoïde cellen, of andere cellijnen, in een T25 flacon met 6 milliliters RPMI 1640 medium, aangevuld met 1%Pen Strep, 2 ml of meer L-glutamine, en 5%FBS. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide. Gebruik een hemocytometer of een geautomatiseerde celteller om de celdichtheid te meten.

Voordat de cellen 1 keer 10 tot de 6 cellen per milliliter bereiken, centrifugeer ze 100 keer G gedurende vijf minuten en breng ze over naar een T75 flacon met 25 milliliters van het eerder in deze video bereide RPMI 1640 medium. Laat de cellen groeien tot ze een celdichtheid van 1 keer 10 tot de 6 cellen per milliliter bereiken, breng vervolgens de cellen over naar een T150 flacon in 38 milliliters van hetzelfde medium en laat ze nog twee dagen groeien. Spin vervolgens de cellen 100 keer G gedurende vijf minuten en resuspendeer ze in 10 milliliters RPMI 1640 medium.

Giet vervolgens de suspensie in een 1850 vierkante centimeter roller fles met 500 milliliters medium en incubeer de cellen onder dezelfde omstandigheden als eerder, maar met constante rotatie. Zodra het gewenste aantal cellen is bereikt, centrifugeer de cultuur 100 keer G gedurende vijf minuten en resuspendeer de cellen in 36 milliliters RPMI 1640 medium. Breng vervolgens de celsuspensie over naar een 50 milliliter conische buis en verwijder kleine aliquots voor celtelling en DNA-extractie.

Om de cellen te cross-linken, voeg 1 milliliter 37% formaldehyde toe om een ​​eindconcentratie van 1% te bereiken. Vervolgens incubeer de cellen bij 10 tot 30 RPM op kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Quench de cross-linking reactie door 2 milliliter van een 2,5 molaire glycine oplossing toe te voegen voor een eindconcentratie van 125 millimolar. Vervolgens incubeer de cellen met rotatie gedurende vijf minuten.

Na het pelleten van de cellen door centrifugatie, was de cellen twee keer met ijskoud 1X PBS. Ga door met lysis en sheering van de cellen, of resuspendeer het pellet in 5 milliliters cel lysis buffer, en bevriest de suspensie druppel voor druppel in vloeibaar stikstof. Bewaar vervolgens de monsters bij min 80 graden Celsius.

Om lysis en sheering uit te voeren, resuspendeer het pellet in 20 milliliters cel lysis buffer. Centrifugeer vervolgens de cellen bij 400 keer G, in 4 graden Celsius gedurende vijf minuten. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de cellen in 6 milliliters nucleaire lysis buffer met proteaseremmers.

In voorbereiding op sonificatie, verdeel het monster gelijkmatig in zes tot acht Microfuge buisjes. Plaats de monsters op ijs of een koude rek en gebruik een sonicator met een microtip om ze te sonificeren bij 65% amplitude met vijf 20-seconde constante bursts, waarbij de suspensie tussen de pulsen minimaal 40 seconden mag afkoelen. Centrifugeer de cellen bij 12.000 keer G, en 4 graden Celsius gedurende 10 minuten, breng vervolgens het supernatant over naar een nieuwe buis en gooi de pellets weg.

Na het schatten van de totale opbrengst met behulp van fluorometrie, bevries de monsters snel. Na de bereiding van hybridisatie en wasbuffers volgens het tekstprotocol, gebruik 1.200 microliters van 1X hybridisatie buffer om 600 microliters kralen drie keer te wassen. Gebruik vervolgens 1.200 microliters van 2X hybridisatie buffer om de kralen te resuspenderen.

In 1,5 milliliter microcentrifuge buisjes, voeg 600 microliters monster, 120 microliters gewassen kralen opgehangen in 2X hybridisatie buffer, en 480 microliters van 2X hybridisatie buffer toe. Incubeer de buisjes bij 31 graden Celsius en 30 tot 60 RPM gedurende 10 minuten. Plaats vervolgens de buisjes op een magneet totdat de kralen geïmmobiliseerd zijn en breng de monsters over naar nieuwe buisjes voordat de kralen worden weggegooid.

Resuspendeer de capture oligonucleotiden tot een werkoplossing van 10 picomolen per microliter en voeg 4 microliters van deze oplossing toe aan elke buis. Incubeer de buisjes bij 42 graden Celsius en 30 tot 60 RPM gedurende 40 minuten. Tijdens de incubatie, zet de benodigde kralen opzij, was de kralen drie keer zoals eerder, maar gebruik deze keer 1X hybridisatie buffer om ze te resuspenderen.

Voeg de gewassen kralen toe aan de buisjes en incubeer de monsters bij 30 tot 60 RPM bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Plaats de buisjes op de magneet en verwijder het supernatant zodra de kralen geïmmobiliseerd zijn. Na het wassen van de kralen, eluteer het monster door 40 microliters moleculair grad water toe te voegen en incubeer de buisjes bij 94 graden Celsius gedurende vijf minuten.

Plaats de buisjes op de magneet en wacht een paar minuten totdat de oplossing helder wordt, breng vervolgens het supernatant over naar een nieuwe buis en gooi de kralen weg. Bewaar het monster bij min 80 graden Celsius, of ga door met de proteomische analyse volgens het tekstprotocol. Om de opbrengst van de capture te evalueren, gebruik moleculair grad water om een ​​aliquot van het eluaat te verdunnen, één tot tien.

Na het extraheren van het DNA van een eerder in de video genomen aliquot, gebruik het DNA-monster en moleculair grad water om een standaardcurve voor te bereiden, met vijf seriële één tot tien verdun