Bepalen als DNA gekleurd met een Cyanine kleurstof kan worden verteerd met enzymen van de beperking

Het algemene doel van dit experiment is om fluorescent gelabelde DNA-moleculen te verteren met methylatie- en niet-methylatiegevoelige restrictie-enzymen en de verteringssnelheid van het experiment te bepalen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van chemie of biologie, zoals genomica. Het voordeel van deze methode is dat een wetenschapper vooraf gekleurd DNA kan verteren met een enzym om te bepalen of het DNA volledig is na het voltooien van een ander experiment.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Drew Thompson, een bachelorstudent uit mijn laboratorium. Om een 0,7% agarosegel te maken, weeg 1,4 gram agarose met hoge geltemperatuur af in een Erlenmeyerkolf. Voeg dan 200 milliliter 1x TAE-buffer toe en plaats een omgekeerde beker op de kolf.

Verwarm de oplossing op een hotplate totdat er bubbels beginnen te vormen op de bodem van de kolf en naar boven drijven. Verwijder de oplossing van de hotplate en laat het afkoelen totdat de kolf met een blote hand kan worden aangeraakt. Giet vervolgens de gel in een gelvorm van 24,5 centimeter bij 21,8 centimeter met een gelkam om putjes te maken.

Gebruik een pipettentip om de bubbels bij de kam of op het oppervlak van de gel te verwijderen en laat de gel minimaal 15 minuten stollen. Om lambda-DNA bij zes verschillende concentraties kleurstoffen te kleuren, begint u met 1x TE om 300 microliter 100 nanogram per microliter lambda-DNA te bereiden. Bewaar de oplossing bij vier graden Celsius.

Tijdens het bereiden van een monster voor elk van de volgende kleurstofconcentraties voor elke band die wordt verwacht in een restrictiedigest, kleurt u 75 tot 100 nanogram ongemethyleerd lambda-DNA. Bewaar de monsters een nacht bij vier graden Celsius. De volgende dag, om te bepalen of een restrictie-enzym het gekleurde DNA kan verteren, voegt u 20 eenheden restrictie-enzym toe, drie microliters van de geschikte buffer met de hoogste snijdende efficiëntie en gedistilleerd, geautoclaveerd en gefilterd water voor een reactie van 30 microliter.

Plaats de reacties in een waterbad bij de optimale enzymatische activiteit en incubeer ze gedurende twee tot vier uur. Stop vervolgens de reacties door twee microliter 0,5 molaire EDTA pH 8,0 toe te voegen. Verwijder de zijkanten van de eerder bereide gelvorm en plaats de gel in de gelelektroforesebox.

Giet 2,5 liter 1x TAE-buffer in de box. Verwijder vervolgens voorzichtig de gelkam uit de gel zodat de putjes toegankelijk zijn. Pipet de restrictie-enzymreacties op een plastic film en voeg voor elke reactieoplossing één microliter 6x ladingsdye toe per vijf tot zes microliter DNA-oplossing.

Pipet vervolgens de reacties in de putjes. Meng één microliter van een kilobaseladder, negen microliters 1x TE en twee microliters 6x ladingsdye. Laad vervolgens de oplossing in de putjes die de andere oplossingen flankeren.

Bedek de gelbox met een donkerblauw of zwart papier of stof en sluit de gelbox aan op een stroomvoorziening. Stel de voeding in op 30 volt en laat deze de hele nacht lopen. Zet de lichten uit terwijl de gel loopt om fotosplitsing van het gelabelde DNA te voorkomen.

De volgende ochtend brengt u de gel in de lade over naar een container met 45 microliter etidiumbromide en één liter 1x TAE-buffer. Bewaar de container bij kamertemperatuur in het donker of bedek hem met folie om blootstelling aan licht te voorkomen. Laat de gel minimaal 45 minuten bij kamertemperatuur staan.

Om de gel te beeldvormen, plaatst u de gel op een blauwlichttransilluminator, die maximale lichtuitvoer tussen 400 en 500 nanometer uitzendt. Maak foto's met een camera die aan het station is bevestigd. Bepaal de verteringssnelheid voor het experiment volgens het tekstprotocol.

De enzymefficiëntie wordt bepaald door het totale aantal verwachte banden te delen door het aantal zichtbare banden. Bovendien is een controle vereist om de geschatte grootte van de banden te bepalen, om te weten waar de native DNA-moleculen verwacht worden in vergelijking met het gekleurde DNA. De mobiliteit van de banden in rijen drie en vier is afgenomen, waardoor de banden dichter bij de putjes zijn verschoven.

In deze rijen heeft de hoeveelheid kleurstof geen merkbaar effect op de mobiliteit, dus de banden komen overeen met de controle. Rijen vijf en zes tonen meer banden dan de controle, wat indicatief is voor gedeeltelijke vertering, wat suggereert dat de kleurstoffen de splitsing op herkenningsplaatsen hebben beïnvloed. In dit experiment worden alle verwachte banden gezien voor alle kleurstofconcentraties, dus de dobbelstenen hebben de vertering van DNA niet verstoord.

Om te zien hoe de mobiliteit verschoof naarmate de concentratie van de YOYO-1-kleurstof toenam, werden gekleurde asterisken naast elke band ingevoegd. Bijvoorbeeld, de 3,5 kilobasebanden hebben rode asterisken naast hen in elke YOYO-1-concentratie. De onverwachte banden in rijen vijf en zes hebben geen asterisk naast de banden.

Wanneer u deze procedure probeert, is het belangrijk om de gel te bedekken met een donker stuk papier en het uitvoeren van de gel in een donkere kamer te voltooien. Zorg er ook voor dat u donkere buizen gebruikt voor uw reacties. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe fluorescent gekleurde DNA-moleculen te verteren met restrictie-enzymen en de verteringssnelheid van de reactie te bepalen.

Vergeet niet dat het werken met etidiumbromide uiterst gevaarlijk kan zijn, dus moeten voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van handschoenen en veiligheidsbrillen worden genomen tijdens het uitvoeren van de procedure. Zorg er ook voor dat u geschikte veiligheidsbrillen draagt wanneer u een transilluminator gebruikt.