Name: Profilering van DNA replicatie Timing met behulp van de zebravis als een modelsysteem In Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Leer DNA-replicatietiming in kaart brengen tijdens de embryonale ontwikkeling van zebravis. Deze methode onthult hoe chromatineveranderingen de initiatie van DNA-replicatie beïnvloeden in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health door verleent 5P20GM103636-02 (inclusief Stroom Cytometry core ondersteuning) en 1R01GM121703, evenals awards van de Oklahoma-centrum voor volwassen stamcel Onderzoek.

Alle dieren waren behandeld in strikte overeenstemming met protocollen die zijn goedgekeurd door de Oklahoma medische onderzoek Stichting institutionele Animal Care en gebruik Comité.
1. het opzetten van volwassen zebrafish voor de fokkerij
<ol><li>Gebruik een grote cohort van volwassen mannelijke en vrouwelijke zebrafish van een single strain voor de fokkerij. Er zijn kleine verschillen in de genetische samenstelling van zebravis van zelfs een single strain, gebruik van een grote cohort om resultaten zijn representatief voor de genetische variabiliteit van de bevolking en niet beperkt tot een kleine ondergroep van de bevolking.</li>
	<li>De nacht voordat embryo's worden verzameld, plaats tientallen fokken volwassenen in het fokken van tanks, gebruik maken van ongeveer gelijke nummers van mannetjes en vrouwtjes. Afhankelijk van het experiment, gebruikt u een van de volgende strategieën voor de fok.<ol>
<li>Fokken van strategie 1: plaats een paar mannelijke en vrouwelijke zebrafish in individuele fokken tanks, de mannetjes gescheiden van de vrouwtjes met een divider. Als deze benadering wordt gebruikt, setup veel verschillende fokken tanks en bundelen van de embryo's uit elk om ervoor te zorgen dat de biologische variabiliteit is representatief voor de bevolking.</li>
		<li>Fokken van strategie 2: combineren van tientallen mannelijke en vrouwelijke zebrafish in een grote fokken tank. Pas deze strategie toe, zolang er een voldoende groot aantal embryo's, het is redelijk te veronderstellen zij kwam uit een verscheidenheid van oprichters en zijn daarom genetisch representatief zijn voor de bevolking.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. getimede verparingen - inzameling, sortering en huisvesting zebrafish embryo's voor experimenten
<ol><li>Uitvoeren van getimede verparingen, begint zodra het licht cycli in de ochtend. Gooi embryo's 's nachts gegenereerd.</li>
	<li>Toestaan vis te kweken in ondiep water (3-5 cm) gedurende een periode van 10 minuten, met een valse bodem voor embryo's door kan ontsnappen.</li>
	<li>Na 10 min, verzamelen van embryo's door door een zeef gieten en in een 10-cm plaat met een fles van wassen spoelen. Zwembad alle embryo's verzameld op het zelfde tijdstip, markeren ze met moment van collectie en plaats onmiddellijk in een incubator bij 28,5 ° C.</li>
	<li>Honderden van embryo's kunnen worden verwacht van een enkele paring pair in een dag. Meerderjarigen tot broeden in 10 min cycli totdat het aantal embryo's verkregen minder dan twintig is.</li>
	<li>Ongeveer 1-1,5 h na het verzamelen, sorteren embryo's te verwijderen dode en onbevruchte embryo's. Als u wilt sorteren van embryo's, verwijder uit incubator en observeren onder een Microscoop ontleden.<ol>
<li>Tellen van embryo's en plaatsen bij een dichtheid van 100 embryo's per 10 cm plaat.</li>
		<li>Voeg verse E3 medium (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4) en embryo's terug te keren naar de 28,5 ° C incubator.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Dechorionate, deyolk, en op te lossen zebrafish embryo 's
Opmerking: Deze sectie van het protocol is ontworpen voor embryo's vóór 48u post bevruchting (hpf). Er is geen behoefte om te verwijderen van de chorions van embryo's in latere stadia van ontwikkeling (na 48 hpf), zoals ze vaak natuurlijk afvallen. Er is geen behoefte aan deyolk of het verwijderen van de chorions van vis oudere post de 5 dagen bevruchting (dpf).
<ol><li>Wanneer embryo's gewenste developmental leeftijd hebben bereikt, controleert u of fasen van ontwikkeling morfologisch onder een lichte Microscoop volgens "Stadia van embryonale ontwikkeling van de zebravis"17.</li>
	<li>Tot 1500 geënsceneerde embryo's overbrengen in een conische buis 15 mL en meerdere malen wassen met E3.<ol>
<li>Voeg 1 mL E3 en 20 µL van Pronase-oplossing (30 mg/mL) voor elke 100 embryo's en zachtjes wervelen. Maximaal 1500 embryo's kunnen worden dechorionated in een enkele buis met 15 mL E3.</li>
		<li>Buis op zijn kant leggen en embryo's in een gelijkmatige laag om ervoor te zorgen maximale oppervlakte volumeverhouding te regelen. Zachtjes doorroeren buis elke 2-3 min tot alle chorions gedaald off van de embryo's. De totale dechorionation tijd zal variëren afhankelijk van de Pronase-activiteit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bovendrijvende vloeistof verwijderen en voorzichtig spoelen embryo's 3 keer met 10 mL van E3. Plaats de embryo's op het ijs voor de rest van deze sectie van het protocol.</li>
	<li>Verwijderen van E3 en wassen van embryo's met vers bereide ijskoude deyolking buffer (0,5 x Ginzburg vis Ringer's oplossing, zonder calcium: 55 mM NaCl, 1,8 mM KCl, 1.25 mM NaHCO3).<ol>
<li>Voeg 1 mL ijskoud deyolking buffer voor maximaal 500 embryo's.</li>
		<li>Met behulp van een P1000, zachtjes Pipetteer embryo's op en neer 5 - 10 keer te verstoren dooier zak.</li>
		<li>1 mL overbrengen in een 1,5 mL microfuge buis en centrifugeer bij 4 ° C en 500 x g gedurende 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bezinken en wassen pellet met 1 mL ijskoud 1 x PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing, pH 7,0) te verwijderen van Ringer's oplossing verwijderen. Centrifugeer bij 4 ° C en 500 x g gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Zorgvuldig verwijderen van supernatant en resuspendeer de cellen in 1 mL 1 x PBS. Plaats de buis op ijs.</li>
	<li>Voeg 3 mL ijskoud ethanol (EtOH) tot een conische buis 15 mL. Vortex buis van EtOH zachtjes op laag instelling.<ol>
<li>Met behulp van een P1000, langzaam (1 druppel per seconde) druppelen zebrafish embryo celsuspensie in EtOH terwijl vortexing zachtjes.</li>
		<li>Voeg een totaal van 1 mL van de celsuspensie embryo, voor de oplossing van een definitieve vastlegging van 75% EtOH.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na 1 mL van cel is schorsing toegevoegd, voorzichtig swirl buis te mengen en plaats bij-20 ° C gedurende ten minste 1 uur. Het is aanbevolen om het plaatsen van de buizen aan hun kant te zorgen voor maximale oppervlakte volumeverhouding en verminderen van het aantal embryo's en cellen die plakken aan elkaar. Opgeslagen embryo cellen bij-20 ° C gedurende 2-3 weken.</li>
</ol>4. vlekken van DNA en FACS embryo's sorteren
Opmerking: Deze sectie van het protocol is ontworpen voor embryo's in 1 dpf.
<ol><li>EtOH-vaste embryo cellen verwijderen van-20 ° C en centrifugeer bij 4 ° C 1500 x g gedurende 5 min.<ol>
<li>Plaats de buis op ijs en zorgvuldig verwijderen supernatant. Met behulp van een P1000, zachtjes resuspendeer de cellen in 1 mL vers bereide koude PBS-BSA (1 x PBS, 1% bovien serumalbumine).</li>
		<li>Centrifugeer cellen bij 4 ° C en 1500 x g gedurende 5 minuten en plaats op ijs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwijderen supernatant en resuspendeer cellen in propidium jodide (PI) kleurstofoplossing (50 µg Mo/mL PI, 100 µg/mL RNase A, PBS, pH 7,0), met behulp van 200 µL voor elke 1000 embryo's.<ol>
<li>Toestaan dat cellen te broeden in PI oplossing voor 30 min op ijs, voorzichtig mengen elke 5 min.</li>
		<li>Plaats een 40 µm nylon cel zeef op een 50 mL conische buis op ijs. Zachtjes Pipetteer cellen meng en filtreer door de Maas. Opmerking: Als er meerdere buizen van embryo's uit de dezelfde timepoint werden verzameld in sectie 3 van het protocol, combineren deze embryo's op dit punt zodat ze samen worden gesorteerd.</li>
		<li>Met behulp van de flat binnen einde van de zuiger van een injectiespuit, zachtjes verstoren alle resterende bosjes van cellen op de Maas.</li>
		<li>Spoel de cellen via het filter met 500 µL van koude PBS-BSA voor elke 1000 embryo's.</li>
		<li>Plaatst u een 40-µm net boven een 15 mL conische buis op ijs en filtreer de celsuspensie uit de conische buis van 50 mL een tweede keer in de buis 15 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Met behulp van een gewenste cel Sorteren instrument, stel de excitatie van de laser op 561-nm en emissie detectie tot 610/20 te detecteren propidium jodide.<ol>
<li>Mix 15 mL tube gekleurde cellen kort door vortexing en plaats in het instrument bij 4 ° C.</li>
		<li>De stem van de cellen op een langzame stroming, ideaal 1,0 mL/min, het verkrijgen van een schone celcyclus profiel en vermijden mengen G1 of G2/M cellen met de S fase bevolking uitvoeren.</li>
		<li>Eerst, poort voor FSC-A x SSC-een (forward scatter gebied door kant scatter gebied) te verwijderen van puin (figuur 1A). Opmerking: Cellen van de embryo's kunnen worden verschillende maten, afhankelijk van het stadium en cel type. Filter met neutrale dichtheid (ND) wellicht worden geschakeld tussen 1.0 en 1.5 afhankelijk van de grootte van cellen aanwezig. Poort een groot gebied voor het verzamelen van de meeste cellen en het verwijderen van puin.</li>
		<li>Tweede, poort voor SSC-gebied (WS-A) door PI-gebied (PI-A), verwijderen van puin en cel paren (figuur 1B).</li>
		<li>Ten derde poort voor SSC-A door SSC-W (breedte) te verwijderen van alle resterende cel paren (Figuur 1 c).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Weergeven van de gated populaties in een histogram met celaantal (graaf) op de y-as en propidium jodide-gebied (PI-A) op de x-as. Voor 24 hpf embryo's moeten hierdoor een stereotiepe celcyclus profiel zoals in Figuur 1 d.<ol>
<li>Wilt sorteren de S fase bevolking, stelt u de poort vanaf de rechterkant van de G1 piek aan de linkerzijde van de G2 piek, met inbegrip van slechts een minimale hoeveelheid van de G1 en G2 populaties. Voor 24 hpf embryo's, zal dit meestal ongeveer 10-15% van de gated bevolking omvatten (Zie Figuur 1 d).</li>
		<li>Wilt sorteren de G1 bevolking, stelt u de poort aan de linkerkant van de piek van de G1, niet door te geven van de top van de piek. De breedte van de G1 poort zo smal mogelijk aanpassen (Zie Figuur 1 d).</li>
		<li>Een back-poort de G1 en S fase populaties om goede eerste gating (figuur 1E).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sorteren van de G1 en S fase populaties in 15 mL conische buisjes met 3 mL PBS-BSA. Het doel moet zijn om te verkrijgen tussen de 500.000 en 1 miljoen of meer gesorteerde cellen per fractie (G1 en S-fase).</li>
	<li>Nadat het sorteren is voltooid, centrifuge buizen op 1500 x g en 4 ° C gedurende 10 minuten. Opmerking: De pellet kleincellige moeilijk zal zijn om te zien en het is belangrijk om niet te verstoren het, dus gebruik bij voorkeur een swingende emmer rotor over een vaste hoek rotor.</li>
	<li>Zorgvuldig verwijderen van supernatant en resuspendeer de pellet met 1 mL 1 x PBS. Cellen overbrengen in een 1,5 mL microfuge buis en centrifugeer bij 6.000 x g en 4 ° C gedurende 5 min.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig alle vloeistof uit buis en het bevriezen van droge pellet bij-20 ° C. Bewaar de pellet bij-20 ° C gedurende 2-3 weken.</li>
</ol>5. DNA isolatie, RNase behandeling en zuivering van DNA
<ol><li>Verwijder cel pellet van-20 ° C en plaats op het ijs.<ol>
<li>Voeg 400 µL van SDS buffer (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,5% SDS) pellet en resuspendeer.</li>
		<li>Proteïnase K toevoegen om een eindconcentratie van 0,2 mg/mL en meng door vortexing kort.</li>
		<li>Incubeer monsters bij 56 ° C gedurende 2 uur, vortex elke 15 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voer na 2U, fenol-chloroform extractie door 400 µL van fenol-chloroform (fenol: Chloroform: Isoamylalcohol 25:24:1, verzadigd met 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA) toe te voegen.<ol>
<li>Vortex voor 20 s en centrifuge monster bij 16.000 x g gedurende 5 min om de fasen te scheiden.</li>
		<li>Verwijder voorzichtig de bovenste waterfase (400 µL) en overdracht aan een 1,5 mL-buis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uitvoeren EtOH neerslag door 40 µL van 3M Natriumacetaat (pH 5.2), 2 µL van glycogeen, en 1 mL EtOH toe te voegen.<ol>
<li>Vortex meng en plaats bij-20 ° C's nachts te precipiteren DNA. Monster kan ook worden neergeslagen bij-80 ° C of op droog ijs gedurende 1 uur.</li>
		<li>Centrifuge monster bij 4 ° C en 16.000 x g gedurende 30 minuten aan pellet DNA.</li>
		<li>Discard supernatant en wassen pellet met 1 mL 70% EtOH. Centrifugeer bij 4 ° C en 16.000 x g gedurende 5 minuten.</li>
		<li>Gooi supernatant en aan pellet bij kamertemperatuur gedurende 2-3 minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Los van de pellet in 96 ÂµL van gesteriliseerde met autoclaaf water, en voeg 4 µL van RNase A (2 mg/mL).<ol>
<li>Meng goed door vortexing en Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fenol-chloroform extractie door toevoeging van 100 µL van fenol-chloroform en volgende procedure in stappen 5.2.1 - 5.2.2 uitvoeren</li>
	<li>Uitvoeren EtOH neerslag toevoegen 10 µL van 3M Natriumacetaat, 1 µL glycogeen en 250 µL van EtOH en na de procedure in stappen 5.3.1 - 5.3.5.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 60 µL van TE buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA (pH8.0)) en DNA-concentratie met behulp van een kwantitatieve fluorescentie gebaseerde methode te bepalen. Winkel DNA bij-20 ° C. Opmerking: Het is belangrijk te kwantificeren van DNA met behulp van DNA-bindende fluorescentie gebaseerde kleurstoffen of anderszins betrouwbaarder dan UV spectrometer gebaseerde methoden.</li>
</ol>6. bereiding van DNA bibliotheken en de volgende generatie sequencing
Opmerking: Een G1 kopie nummer referentiemonster voor elk biologische bron is vereist voor elke sequencing run (d.w.z. WT, mutant, transgene, cellijn, etc). Vergelijk alle S fase monsters uit dezelfde biologische bron in de dezelfde volgorde uitvoeren op de dezelfde G1-objectverwijzing. Voer ten minste twee biologische replicatieonderzoeken van elk monster te zorgen voor samenhang tussen de monsters.
<ol><li>Verdunnen 1 µg van DNA tot een eindvolume van 50 µL en transfer naar een gespecialiseerde buis voor ultrasoonapparaat.</li>
	<li>Schuintrekken genomic DNA voor een doel van 250-300 bp in een gerichte ultrasonicator, volgens de specificaties en het protocol van de fabrikant.</li>
	<li>Controleer of de kwaliteit en grootte van sheared genomic DNA met behulp van een geautomatiseerde elektroforese machine, volgens de specificaties en het protocol van de fabrikant. Zorgen er is een grote piek van ~ 250-300 bp voor de sheared genomic DNA.</li>
	<li>Bereiden sequencing bibliotheken met behulp van een DNA kit voor de voorbereiding van de bibliotheek met multiplex oligos voor het rangschikken op Illumina platform, volgens protocol van de fabrikant.</li>
	<li>Controleer of kwaliteit van bibliotheek prep met behulp van geautomatiseerde elektroforese machine, volgens protocol van de fabrikant. Zorgen er is een grote piek van ~ 400-450 bp, en er zijn minimale pieken voor inleidingsdimeer (80-85 bp) en adapter Dimeren (~ 120 bp).</li>
	<li>Kwantificeren van bibliotheken die een DNA kit voor de kwantificering van de bibliotheek gebruiken voor de volgende generatie DNA sequencing, volgens protocol van de fabrikant.</li>
	<li>Verdunde 15 µL van bibliotheek tot een concentratie van 5 nM en combineren multiplexed bibliotheken nodig om gewenste unieke toewijzing lezen tellingen per monster. Opmerking: Het aantal unieke toewijzing leest per monster bepalend zijn voor de resolutie. Gebruik zo weinig als 5 miljoen toegewezen leest te beoordelen van replicatie timing voor de zebravis genoom. Het is raadzaam om te beginnen met 10-20 miljoen leest.</li>
	<li>Uitvoeren gekoppeld-einde 100 bp hele genoom DNA sequentiebepaling van monsters op een volgende generatieplatform voor sequencing, volgens de instructies van de fabrikant.</li>
</ol>7. analyse van de gegevens rangschikken
Opmerking: De instructies in dit gedeelte zijn bedoeld als leidraad voor analyse. Gebruik extra methoden voor sequencing uitlijning, filteren, verwerken, enz. Dit gedeelte van het protocol zal bezighouden met de geprefereerde methode voor de analyse in dit werk. Als extra methoden worden gebruikt, past u de parameters en functies aan die doeleinden. De onderstaande commando's worden ingevoerd in de Ubutnu of Mac terminal, met de juiste pakketten geïnstalleerd.
<ol><li>Verkrijgen van de meest recente versies van het genoom van de zebravis (danRer10, vanaf wanneer dit protocol werd geschreven) vanuit UCSC genome browser met behulp van de volgende opdrachten: wget ftp://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/danRer10/bigZips/danRer10.fa.gz-O danRer10.fa.gz<ol>
<li>Decomprimeer het bestand fa.gz met de volgende opdracht: gunzip danRer10.fa.gz</li>
		<li>Sequencing gegevens uitlijnen op genoom BWA-mem met behulp van de volgende opdrachten gebruiken: BWA mem -t 8 danRer10.fa read_1.fastq read_2.fastq > output.sam</li>
	</ol>
</li>
	<li>.Sam bestand converteren naar .bam bestand samtools met de volgende opdracht: samtools bekijken -bS input.sam > output.bam<ol>
<li>Sorteren de bestanden van de gebonden sequencing samtools met de volgende opdracht: samtools sorteren output.bam > output_sorted.bam</li>
		<li>Index van het .bam bestand samtools met de volgende opdracht: samtools index output.bam</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mark PCR wordt gedupliceerd met Picard met behulp van de volgende opdrachten: Java-Xmx2g-jar picard.jar MarkDuplicates \ INPUT=input.BAM OUTPUT=output.BAM REMOVE_DUPLICATES = false METRICS_FILE=output_metrics.txt</li>
	<li>Genereren van tekstbestanden (.txt) van leesbewerkingen voor elk chromosoom met het volgende commando: voor ik in {1,25}; CHROM doen = "chr" $i; ECHO $CHROM; samtools bekijken input.bam $CHROM | Cut -f 2,4,5,7,8,9 > readsChr$ {i} .txt; gedaan Opmerking: De kolommen in de resulterende txt-bestand zijn vlag, locatie, mapQ, paar chr, paar locatie en de grootte van het fragment, respectievelijk.</li>
	<li>.Txt-bestanden lezen in Matlab (of elke andere soortgelijke software) met behulp van de functie textscan.<ol>
<li>Toewijzing van lage kwaliteit leest uitfilteren door het instellen van een mapQ drempel van 30.</li>
		<li>Verwijder leest met vlaggen voor niet-primaire uitlijning, PCR duplicaten of paar toewijzing aan een ander chromosoom.</li>
		<li>Elke leest met hun paar boven de drempel van een afstand van 2000 bp uitfilteren.</li>
		<li>Evalueren van statistieken van de resulterende leest om te bepalen aantal lees statistieken, dekking, invoegen grootte en kwaliteit (Figuur 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lees dekking in 100 bp vaste windows voor elk monster bepalen door het tellen van het aantal leest in intervallen van 100 bp over de lengte van elk chromosoom.<ol>
<li>Bereken dat de mediaan lezen tellen voor alle vensters.</li>
		<li>Regio's van de hoge dekking uitfilteren door het verwijderen van windows groter is dan 5 standaardafwijkingen van de mediaan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Regio's voor analyse in de G1 referentiemonsters definiëren door het vinden van de segmenten langs elk chromosoom met 200 leest met behulp van schuiframen.<ol>
<li>Lees diepte in elk monster S fase bepalen door het tellen van het aantal S fase leest in de Vensters van de graaf van de 200-lezen gedefinieerd voor de begeleidende G1 verwijzing.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De ruwe gegevens die met de csaps functie in de software, met een interpolatie-factor (p) van 10-16glad.</li>
	<li>Normaliseren afgevlakte gegevens naar z-score met een gemiddelde van 0 en een standaarddeviatie van 1.</li>
</ol>

<ol><li>Rhind, N., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3721284/">DNA replication timing.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132(2013).</li>
<li>Pope, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topologically+associating+domains+are+stable+units+of+replication-timing+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topologically associating domains are stable units of replication-timing regulation.</a> Nature. 515 (7527), 402-405 (2014).</li>
<li>Rivera-Mulia, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+replication+timing+and+gene+expression+during+lineage+specification+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells.</a> Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).</li>
<li>Hiratani, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+reorganization+of+replication+domains+during+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation.</a> PLoS Biol. 6 (10), e245(2008).</li>
<li>Hiratani, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+dynamics+of+replication+timing+revealed+by+in+vitro+models+of+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-wide dynamics of replication timing revealed by in vitro models of mouse embryogenesis.</a> Genome Res. 20 (2), 155-169 (2010).</li>
<li>Koren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+relationship+of+DNA+replication+timing+to+different+forms+of+human+mutation+and+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation.</a> Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).</li>
<li>Ryba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+developmental+control+of+replication-timing+domains+in+pediatric+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia.</a> Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).</li>
<li>Sima, J., Gilbert, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+correlations%3A+replication+timing+and+mutational+landscapes+during+cancer+and+genome+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution.</a> Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).</li>
<li>Veldman, M. B., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+developmental+model+organism+for+pediatric+research%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a developmental model organism for pediatric research.</a> Pediatr Res. 64 (5), 470-476 (2008).</li>
<li>Link, B. A., Megason, S. G. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007%2F978-1-59745-285-4_13">Zebrafish as a Model for Development.</a> Sourcebook of Models for Biomedical Research. , 103-112 (2008).</li>
<li>Siefert, J. C., Clowdus, E. A., Sansam, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+control+in+the+early+embryonic+development+of+aquatic+animal+species%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+C+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Cell cycle control in the early embryonic development of aquatic animal species.</a> Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 8-15 (2015).</li>
<li>Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+vertebrate+for+investigating+chemical+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity.</a> Toxicol Sci. 86 (1), 6-19 (2005).</li>
<li>Dooley, K., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+system+for+the+study+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model system for the study of human disease.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).</li>
<li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooked%21+Modeling+human+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> J Clin Invest. 122 (7), 2337-2343 (2012).</li>
<li>Siefert, J. C., Georgescu, C., Wren, J. D., Koren, A., Sansam, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+timing+during+development+anticipates+transcriptional+programs+and+parallels+enhancer+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">DNA replication timing during development anticipates transcriptional programs and parallels enhancer activation.</a> Genome Res. 27 (8), 1406-1416 (2017).</li>
<li>Koren, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+variation+in+human+DNA+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic variation in human DNA replication timing.</a> Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8589427">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Zebravis vormen een nieuwe en unieke in-vivo modelsysteem te bestuderen van DNA replicatie timing. Wanneer getimede verparingen zijn uitgevoerd als beschreven in deze experimentele protocol, duizenden embryo's kunnen worden verzameld in een enkele dag voor experimenten. Deze embryo's ontwikkelen synchroon door precies getimed en duidelijk gekenmerkt stadia van ontwikkeling. Zebrafish kan worden gemakkelijk en nauwkeurig enscenering morfologie met een stereomicroscoop, zoals zebrafish embryo's extern te ontwikkel...

Voor cellen te verdelen met succes, moeten ze eerst nauwkeurig en getrouw repliceren hun gehele genoom. Genoom dubbel treedt op in een reproduceerbare patroon, bekend als de DNA replicatie timing programma1. DNA replicatie timing is gecorreleerd met de organisatie van de chromatine, epigenetische merken en gene expression2,3. Veranderingen in de timing van de replicatie optreden in de gehele ontwikkeling, en zijn aanzienlijk aan transcriptionele gerelateerde programma's en aanpassingen aan de chromatine merken en organisatie4,5. Bovendien, replicatie timing is gecorreleerd met vogelgriepvirus frequenties en veranderingen in de timing zijn waargenomen bij verschillende soorten kanker6,7,8. Ondanks deze opmerkingen, de mechanismen en de determinanten van replicatie timing vestiging en verordening zijn nog grotendeels onbekend, en de rol die het speelt bij ontwikkeling en ziekte is onbepaald. Bovendien, tot onlangs de genoom-brede replicatie had timing van de veranderingen die zich in de gehele gewervelde ontwikkeling voordoen alleen onderzocht in cel cultuur modellen.
Zebravis, Danio rerio, zijn zeer geschikt voor het studeren replicatie timing in vivo tijdens de ontwikkeling, zoals een enkele paring paar kan opleveren van honderden embryo's die ontwikkelen snel met veel gelijkenissen met zoogdieren ontwikkeling9, 10. Verder zijn er in de gehele ontwikkeling van de zebravis, wijzigingen in de celcyclus, chromatine organisatie en transcriptionele's die relaties met DNA replicatie timing11delen. Zebravis zijn ook een uitstekende genetische model, zoals ze zijn bijzonder vatbaar voor manipulatie door Transgenese, mutagenese en gerichte mutaties en genetische schermen hebben vele genen nodig zijn voor de ontwikkeling van de gewervelde12geïdentificeerd. Zebrafish kan daarom worden gebruikt om genen die betrokken zijn bij replicatie timing totstandbrenging en het beheer te identificeren en te observeren van de gevolgen van de deregulering van de replicatie timing op gewervelde ontwikkeling. Transgene lijnen kunnen ook worden gebruikt ter beoordeling van de timing van de replicatie van afzonderlijke celtypes geïsoleerd op verschillende ontwikkelings timepoints of bij ziekte. Nog belangrijker is, zijn er verschillende zebrafish modellen van ziekten bij de mens die kan worden gebruikt voor het onderzoeken van de rol van replicatie timing in ziekte vorming en progressie9,13,14.
Onlangs, waren de eerste replicatie timing profielen gegenereerd op basis van zebravis, tot vaststelling van het als een modelsysteem om te studeren van replicatie in vivo15timing. Om dit te bereiken, werden cellen verzameld uit zebrafish embryo's in meerdere stadia van ontwikkeling en in een celtype van volwassen zebrafish geïsoleerd. Cellen werden vervolgens gesorteerd FACS (fluorescentie-geactiveerde cel Sorteren) op basis van DNA-inhoud te isoleren van de G1 en S fase populaties. Kopiëren met behulp van de G1 voorbeeld als een numeriek besturingselement kopiëren, aantal variaties in de S-fase populaties werden bepaald en gebruikt voor het afleiden van de replicatie van de relatieve timing16. Veranderingen in de timing van de replicatie kunnen vervolgens direct worden vergeleken tussen verschillende ontwikkelings monsters en celtypes en dit werd gebruikt om te bepalen van de veranderingen in de timing van de replicatie die in vivo in gewervelde ontwikkeling optreden. Deze methode biedt diverse voordelen ten opzichte van andere genomische methoden, vooral dat het niet nodig labelen met thymidine analogen of immunoprecipitation van DNA4,6.
Hier is de protocollen profiel genoom-brede DNA replicatie timing op gedetailleerde hoge resolutie in zebrafish. Deze protocollen zijn gebruikt om de relaties met de genomische en epigenetische functies in het genoom van de zebravis, evenals profilering van veranderingen in deze relaties die zich in de gehele ontwikkeling voordoen bepalen. Deze protocollen zijn ook gemakkelijk aangepast om te bestuderen van de veranderingen in de timing van de replicatie in gemuteerde stammen van zebravis en ziekte modellen. Bovendien bevatten deze methoden een stichting die kan worden uitgebreid om te bestuderen replicatie timing in specifieke celtypen, door de eerste sortering uit de individuele celtypes van de zebravis. De zebravis kan dienen als een uitstekende in-vivo modelsysteem te bestuderen van replicatie timing en uiteindelijk het onthullen van de biologische functies van deze belangrijke epigenetische trek.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>EMD Millipore</td><td>MMX00701</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>10165921001</td><td>protease oplossing</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (EtOH)</td><td>KOPTEC</td><td>V1016</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide (PI)</td><td>Invitrogen</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP153-500</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9844</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-24950</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform</td><td>Sigma</td><td>P3803-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Sodium acetate</td><td>J.T.Baker</td><td>3470</td><td></td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Ambion</td><td>AM9510</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>Thermo Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Quanit-iT</td><td>Invitrogen</td><td>Q33130</td><td>Reagentia voor fluorescentie-gebaseerde DNA-kwantificering</td></tr><tr><td>Covaris AFA microTUBE</td><td>Covaris</td><td>520045</td><td>gespecialiseerde buis voor sonicatie</td></tr><tr><td>Covaris E220 Sonicator</td><td>Covaris</td><td>E220</td><td>gefocuste ultrasoon</td></tr><tr><td>Agilent 4200 Tapestation</td><td>Agilent</td><td>G2991AA</td><td>geautomatiseerde elektroforesemachine</td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td>Reagentia voor geautomatiseerde elektroforesemachine</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina</td><td>NEB</td><td>Cat#E7370L</td><td>DNA-bibliotheekvoorbereidingskit</td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 1)</td><td>NEB</td><td>Cat#E7335S</td><td>multiplex oligo's voor DNA-bibliotheekvoorbereidingskit</td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos Kit for Illumina (Index Primers Set 2)</td><td>NEB</td><td>Cat#E7500S</td><td>aanvullende multiplex oligo's voor DNA-bibliotheekvoorbereidingskit</td></tr><tr><td>NEBNext Library Quant Kit for Illumina</td><td>NEB</td><td>E7630L</td><td>kwantificeringskit voor bibliotheekvoorbereiding</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63882</td><td>magnetische kralen</td></tr><tr><td>Illumina HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td>SY&ndash;401&ndash;2501</td><td>next generation DNA-sequencingplatform</td></tr><tr><td>40 &micro;m Falcon Nylon Cell Strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>VWR Disposable Petri Dish 100 x 25 mm</td><td>VWR</td><td>89107-632</td><td></td></tr><tr><td>6.0 mL Syringe for Nichiryo Model 8100</td><td>VWR</td><td>89078-446</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click Tubes, 1.7 mL, Natural Color</td><td>Denville Scientific</td><td>C2170 (1001002)</td><td>Dnase/Rnase vrij</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Wash Bottles</td><td>VWR</td><td>16650-022</td><td>Low-Density Polyethylene, Wide Mouth</td></tr><tr><td>Strainer</td><td>VWR</td><td>470092-440</td><td>6.9 cm, fijn gaas</td></tr><tr><td>Corssing tank</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td>individuele foktank</td></tr><tr><td>iSpawn</td><td>Techniplast</td><td>N/A</td><td>grote foktank</td></tr><tr><td>FACSAria II</td><td>BD biosciences</td><td>N/A</td><td>celsorteermachine</td></tr><tr><td>Wild M5a steromicroscope</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>N/A</td><td>dissectiemicroscoop</td></tr><tr><td>Qubit 3 Fluorometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q33216</td><td>kwantitatieve fluorescentie-gebaseerde methode voor het bepalen van DNA-concentratie</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td>versie 2017a</td><td></td></tr><tr><td>Matlab Statistics Toolbox</td><td>Mathworks</td><td>versie 11.1</td><td></td></tr><tr><td>Matlab Curve Fitting Toolbox</td><td>Mathworks</td><td>versie 3.5.5</td><td></td></tr></tbody></table>

profilering van dna replicatie timing met behulp van de zebravis als een modelsysteem in vivo

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replicatie timing is een belangrijke cellulaire kenmerk, vertonen belangrijke relaties waarbij de structuur van de chromatine, transcriptie en DNA mutatie tarieven. Veranderingen in de timing van de replicatie optreden tijdens de ontwikkeling en in Kreeft, maar de timing van de replicatie rol speelt bij ontwikkeling en ziekte is niet bekend. Zebravis werden onlangs opgericht als een in vivo modelsysteem te bestuderen van de timing van de replicatie. Hier is gedetailleerde de protocollen voor het gebruik van de zebravis om DNA replicatie timing. Na het sorteren van cellen van embryo's en volwassen zebrafish, kunnen high-resolution genoom-brede DNA replicatie timing patronen worden geconstrueerd door het bepalen van de veranderingen in DNA exemplaaraantal door middel van analyse van de volgende generatie sequencing gegevens. De zebravis modelsysteem zorgt voor evaluatie van de timing replicatiewijzigingen die optreden in vivo in de gehele ontwikkeling, en kan ook worden gebruikt voor het beoordelen van wijzigingen in afzonderlijke celtypes, ziekte modellen of mutant lijnen. Deze methoden bestudering, onderzoek naar de mechanismen en de determinanten van replicatie timing vestiging en onderhoud tijdens de ontwikkeling mogelijk maken, de timing van de replicatie rol speelt in de mutaties en tumorigenesis, en de gevolgen van de storing veroorzaakt de timing van de replicatie op ontwikkeling en ziekte.

Met behulp van gepubliceerde replicatiegegevens timing, representatieve replicatie timing profielen en kwaliteitscontrole maatregelen dienen15. De eerste stappen van verwerking betrekken de gegevens rangschikken aan het genoom, lees lengte en genoom dekking statistieken te berekenen en het filteren van lage kwaliteit, ongepaarde, en PCR dubbele leest uitlijnen. Lezen statistieken voor een typische zebrafish sequencing steekproef zijn afgebeeld in <strong class="xfi...

Zebravis onlangs gewend waren als een modelsysteem in vivo DNA replicatie timing tijdens ontwikkeling bestuderen. Hier is gedetailleerde de protocollen voor het gebruik van embryo's de zebravis profiel replicatie timing. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast om te bestuderen van replicatie timing mutanten, individuele celtypes, ziekte modellen en andere soorten.

Profilering van DNA replicatie Timing met behulp van de zebravis als een modelsysteem In Vivo

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Het algemene doel van deze procedure is om hele genoom DNA replicatie timing kaarten te genereren van zebravis embryo's in verschillende ontwikkelingsstadia. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de vakgebieden celcyclus en chromatine biologie, zoals hoe veranderingen in chromatine die plaatsvinden tijdens embryonale ontwikkeling de initiatie van DNA replicatiefokken kunnen beïnvloeden. Het grote voordeel van deze techniek is dat het replicatieveranderingen in kaart brengt die in vivo plaatsvinden in gedefinieerde stadia van embryonale ontwikkeling.Hoewel deze methode inzicht kan geven in hoe DNA replicatie verandert tijdens de ontwikkeling van de zebravis, kan deze ook worden toegepast op andere systemen of modelorganismen, zoals tunicaten, kikkers en vliegen. Over het algemeen kunnen mensen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat het enige oefening vereist om enkele cel suspensies te genereren uit zebravis embryo's. Plaats de avond voordat de embryo's worden verzameld tientallen volwassenen in broedtanks, met ongeveer gelijke aantallen mannetjes en vrouwtjes.Afhankelijk van het experiment, gebruik een van de volgende broedstrategieën. Voor

profiling-dna-replication-timing-using-zebrafish-as-an-vivo-model

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Zebravis een krachtig gewervelde model dat is onder-gebruikt voor metabole studies. Hier beschrijven we een snelle manier om de te...

Metabole Profiel Analyse van zebravis embryo&#39;s

Hier presenteren we een systematische aanpak voor het ontwikkelen van fysiologisch relevante, gevoelige en...

In vivo modellering van de Morbid Human Genome behulp Danio rerio

PCR in combinatie met hoge-resolutie smelt analyse (HRMA) wordt aangetoond als een snelle en efficiënte methode om zebravis genotype.

Snelle en efficiënte zebravis Genotyping Met behulp van PCR met een hoge resolutie Melt Analyse

De zebravis is een krachtig modelsysteem voor ontwikkelingsbiologie en onderzoek naar menselijke ziekten vanwege hun genetische overeenkomsten met hogere gewervelde dieren. Dit protocol beschrijft een methodologie om haploïde zebravis-embryo's te creëren die kunnen worden gebruikt voor forward screen-strategieën om recessieve mutaties in genen die essentieel zijn voor vroege embryogenese te identificeren.

Productie van Haploid zebravis embryo&#39;s door<em&gt; In Vitro</em&gt; Bemesting

Eiwitniveaus in cellen en weefsels vaak zijn gereguleerd door het evenwicht van eiwitproductie en klaring. Met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP), kan de klaringskinetiek van eiwitten experimenteel worden gemeten in vivo.

Meten Eiwit Stabiliteit in Living zebravis embryo&#39;s met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP)

Mitose is cruciaal voor elk levend organisme en defecten leiden vaak tot kanker en ontwikkelingsstoornissen. Met behulp van dit beeldvormingsprotocol en zebravissen als modelsysteem, kunnen onderzoekers mitose visualiseren in een levend gewerveld organisme en de veelvoud aan defecten die ontstaan wanneer mitotische processen defect zijn.

Observeren mitotische deling en Dynamiek in een live zebravis embryo

Zebravis als betrouwbare genetische modelorganismen in biomedisch onderzoek, vooral met de komst van gen-bewerken technologieën zijn gebruikt. Wanneer larvale fenotypen verwachting, kan DNA-extractie en genotype identificatie worden uitdagende. Hier beschrijven we een efficiënte genotypering procedure voor zebrafish larven, door de staart knippen, zo spoedig 72 uur na bevruchting.

High-throughput DNA-extractie en de genotypering van 3dpf Zebrafish larven door Fin knippen

Nucleaire oppervlaktespreads zijn een onmisbaar hulpmiddel voor het bestuderen van chromosoomgebeurtenissen tijdens meiose. Hier demonstreren we een methode om meiotische chromosomen voor te bereiden en te visualiseren tijdens profase I van zebravissen spermatocyten.

Bereiding van Meiotic Chromosome Spreads van Zebrafish Spermatocyten

Skeletspierregeneratie wordt aangedreven door weefsel ingezeten spierstamcellen, die bij veel spierziekten zoals spierdystrofie worden aangetast, en dit resulteert in het onvermogen van spieren om te regenereren. Hier beschrijven we een protocol dat het mogelijk maakt om spierregeneratie te onderzoeken in zebravismodellen van spierziekte.

Het onderzoeken van Spierregeneratie in Zebrafish Modellen van Spierziekte

Dit artikel beschrijft een protocol voor de snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van normale en afwijkende cytosinemethylatie in intacte zebravisembryo's.

Snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van normale en afwijkende cytosinemethylatie binnen intacte zebravisembryo's

RASopathieën zijn multisysteem-genetische syndromen die worden veroorzaakt door hyperactivering van de RAS-MAPK-route. Potentieel pathogene varianten die wachten op validatie duiken continu op, terwijl slecht preklinisch bewijs de therapie beperkt. Hier beschrijven we ons in vivo protocol voor het testen en kruisvalideren van RASopathie-geassocieerde ERK-activeringsniveaus en de farmacologische modulatie ervan tijdens de embryogenese door middel van live FRET-beeldvorming in Teen-reporter...

Een efficiënt protocol om ERK-activiteitsmodulatie te beoordelen in vroege zebravismodellen van het Noonan-syndroom via live FRET-microscopie en immunofluorescentie

Leer DNA-replicatietiming in kaart brengen tijdens de embryonale ontwikkeling van zebravis. Deze methode onthult hoe chromatineveranderingen de initiatie van DNA-replicatie beïnvloeden in vivo.

Profilering van DNA replicatie Timing met behulp van de zebravis als een modelsysteem In Vivo

Meer video's verkennen