Profilering van DNA replicatie Timing met behulp van de zebravis als een modelsysteem In Vivo
30 april 2018
Zebravis onlangs gewend waren als een modelsysteem in vivo DNA replicatie timing tijdens ontwikkeling bestuderen. Hier is gedetailleerde de protocollen voor het gebruik van embryo's de zebravis profiel replicatie timing. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast om te bestuderen van replicatie timing mutanten, individuele celtypes, ziekte modellen en andere soorten.
Het algemene doel van deze procedure is om hele genoom DNA replicatie timing kaarten te genereren van zebravis embryo's in verschillende ontwikkelingsstadia. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de vakgebieden celcyclus en chromatine biologie, zoals hoe veranderingen in chromatine die plaatsvinden tijdens embryonale ontwikkeling de initiatie van DNA replicatiefokken kunnen beïnvloeden. Het grote voordeel van deze techniek is dat het replicatieveranderingen in kaart brengt die in vivo plaatsvinden in gedefinieerde stadia van embryonale ontwikkeling.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in hoe DNA replicatie verandert tijdens de ontwikkeling van de zebravis, kan deze ook worden toegepast op andere systemen of modelorganismen, zoals tunicaten, kikkers en vliegen. Over het algemeen kunnen mensen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat het enige oefening vereist om enkele cel suspensies te genereren uit zebravis embryo's. Plaats de avond voordat de embryo's worden verzameld tientallen volwassenen in broedtanks, met ongeveer gelijke aantallen mannetjes en vrouwtjes.
Afhankelijk van het experiment, gebruik een van de volgende broedstrategieën. Voor de eerste broedstrategie, plaats een paar mannetjes en vrouwtjes zebravis in individuele broedtanks, en gebruik een verdeler om de mannetjes van de vrouwtjes te scheiden. Als deze aanpak wordt gebruikt, zet dan veel verschillende broedtanks op en pool de embryo's van elk om ervoor te zorgen dat de biologische variabiliteit representatief is voor de populatie.
Voor broedstrategie nummer twee, combineer tientallen mannetjes en vrouwtjes zebravis in een grote broedtank. Gebruik deze strategie zolang er een voldoende groot aantal embryo's is. Het is redelijk om aan te nemen dat ze van een verscheidenheid aan oprichters komen en daarom genetisch representatief zijn voor de populatie.
Om getimede paringen uit te voeren, begin zodra de lichtcycli 's ochtends beginnen. Laat de vissen broeden in ondiep water gedurende een periode van 10 minuten, met een valse bodem voor embryo's om door te ontsnappen. Na 10 minuten, verzamel embryo's door ze door een zeef te gieten en gebruik een wasfles om ze in een 10-centimeter plaat te spoelen.
Pool alle embryo's die op hetzelfde tijdstip worden verzameld, markeer ze met het tijdstip van verzameling en plaats ze onmiddellijk in een incubator op 28,5 graden Celsius. Om ervoor te zorgen dat synchrone ontwikkelende embryo's worden verzameld, is het van cruciaal belang dat batches van embryo's elke 10 minuten worden verzameld. Dit is vooral belangrijk bij de vroegste stadia van embryonale ontwikkeling.
Honderden embryo's kunnen worden verwacht van een enkele paringspaar in een dag. Laat volwassenen broeden in cycli van 10 minuten totdat het aantal verkregen embryo's minder dan 20 is. Ongeveer een tot 1,5 uur na verzameling, om embryo's te sorteren, verwijder ze uit de incubator, observeer ze onder een disserpeermicroscoop en sorteer ze om dode en onbevruchte eieren te verwijderen.
Tel de embryo's, en plaats ze met een dichtheid van 100 embryo's per 10-centimeter plaat. Voeg vers E3 medium toe, en plaats de embryo's terug in de 28,5 graden Celsius incubator. Wanneer de embryo's het gewenste ontwikkelingsstadium bereiken, verifieer het stadium morfologisch onder een lichtmicroscoop volgens de Stadia van Embryonale Ontwikkeling van de Zebravis.
Als de embryo's 48 hpf of jonger zijn, breng tot 1500 gestageerde embryo's over naar een 15-milliliter conische buis en gebruik E3 om ze meerdere keren te wassen. Voeg voor elke 100 embryo's een milliliter E3 en 20 microliter Pronase oplossing toe en schudden voorzichtig. Tot 1500 embryo's kunnen in een enkele buis met 15 milliliter E3 worden gedechorioneerd. Leg de buis op zijn zij en rangschik embryo's in een gelijkmatige laag om een maximale oppervlakte-volume verhouding te garanderen.
Schud de buis zachtjes om de twee tot drie minuten totdat alle chorions van de embryo's zijn gevallen. De totale dechorionatietijd zal variëren afhankelijk van de Pronase activiteit. Verwijder het supernatant, en spoel de embryo's voorzichtig drie keer met 10 milliliter E3.
Nadat de embryo's op ijs zijn geplaatst en de resterende E3 is verwijderd, gebruik een milliliter vers bereide, ijskoude deyolking buffer voor elke 500 embryo's om het monster te wassen. Gebruik vervolgens een P1000 om de embryo's voorzichtig vijf tot tien keer op en neer te pipetten om de dooierzak te verstoren. Breng vervolgens een milliliter over naar een 1,5-milliliter microfugebuis en centrifugeer het monster bij vier graden Celsius en 500 keer zwaartekracht gedurende vijf minuten.
De monsters moeten net krachtig genoeg worden gepipetteerd om een enkele cel suspensie te creëren zonder de cellen te lyseren. Deze stap zal enige oefening vergen. Verwijder het supernatant en gebruik een milliliter ijskoud 1x PBS om de pellet te wassen om de Ringer's oplossing te verwijderen.
Centrifugeer vervolgens het monster opnieuw. Verwijder voorzichtig het supernatant en suspendeer de cellen in een milliliter 1x PBS. Plaats vervolgens de buis op ijs.
Voeg drie milliliter ijskoud ethanol toe aan een 15-milliliter conische buis en schudden voorzichtig de buis van EtOH op een lage instelling. Gebruik een P1000 om langzaam zebravis embryocel suspensie in de EtOH te druppelen terwijl doorgaan met schudden. Voeg een totaal van een milliliter van de embryocel suspensie toe, voor een uiteindelijke fixatie oplossing van 75%EtOH.
Nadat een milliliter celsuspensie is toegevoegd, schudden voorzichtig de buis om te mengen en plaats deze op zijn zij op min 20 graden Celsius gedurende ten minste een uur, of bewaar de suspensie in de vriezer gedurende twee tot drie weken. Om embryonaal DNA te kleuren, centrifugeer na het verwijderen van EtOH-gefixeerde embryocellen van min 20 graden Celsius de buis bij 1500 keer zwaartekracht en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Plaats de buis op ijs en verwijder voorzichtig het supernatant.
Vervolgens, gebruik een P1000 om cellen voorzichtig te suspenderen in een m
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor het genereren van hele genoom DNA-replicatie timing kaarten van zebravis embryo's in verschillende ontwikkelingsstadia. De methode biedt inzicht in chromatine veranderingen tijdens embryonale ontwikkeling en hun impact op het initiatie van DNA-replicatie.
Belangrijke studie componenten
Wetenschapsgebied
- Celcyclus
- Chromatine biologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Zebravissen dienen als een in vivo model voor het bestuderen van DNA-replicatie timing.
- De techniek kaart replicatieveranderingen op bij gedefinieerde embryonale stadia.
- De verkregen inzichten kunnen worden toegepast op andere modelorganismen.
- Er bestaan uitdagingen bij het genereren van single-cell suspensies uit embryo's.
Doel van het onderzoek
- Om DNA-replicatie timing te profileren tijdens de ontwikkeling van zebravissen.
- Om te begrijpen hoe chromatine veranderingen het initiatie van DNA-replicatie beïnvloeden.
- Om een protocol te bieden dat aanpasbaar is voor het bestuderen van verschillende mutanten en ziektemodellen.
Gebruikte methoden
- Verzameling van zebravis embryo's in verschillende ontwikkelingsstadia.
- Generatie van hele genoom DNA-replicatie timing kaarten.
- Toepassing van de methode op andere soorten zoals tunicaten en kikkers.
- Praktijken in het maken van single-cell suspensies is vereist.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle mapping van DNA-replicatie timing in zebravis embryo's.
- Demonstratie van chromatine veranderingen tijdens embryonale ontwikkeling.
- Inzichten toepasbaar op andere modelorganismen.
- Protocol verfijning voor gebruiksgemak door onderzoekers.
Conclusies
- De methode biedt een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van DNA-replicatie dynamica.
- Bevindingen verhogen het begrip van chromatine biologie in ontwikkeling.
- Mogelijkheid voor bredere toepassingen in verschillende biologische onderzoeksgebieden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding DNA replication timing dynamics provides mechanistic insights into chromatin regulation and genomic stability, which are critical for target validation in oncology and developmental disorder research. The zebrafish in vivo model enables high-resolution, stage-specific replication timing profiling, supporting predictive confidence in early discovery by linking chromatin architecture to replication initiation. This approach facilitates biological de-risking of therapeutic hypotheses by revealing how developmental perturbations affect genome-wide replication patterns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping replication timing changes during embryonic development, clarifying chromatin-replication relationships.
- Operational Value: Provides a reproducible in vivo system for functional target validation, reducing mechanistic ambiguity in early-stage programs.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying replication timing alterations associated with disease models or mutant lines, informing go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, genome-wide replication timing profiles that serve as standardized biomarkers for chromatin state and replication fidelity.
- Operational Value: Delivers normalized, smoothed data outputs suitable for high-throughput screening and cross-condition comparison in assay development.
- Scalability: Enables preparation of single-cell suspensions from staged embryos, supporting scalable sample preparation for downstream sequencing applications.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates evaluation of replication timing changes in disease models or perturbed systems, aligning with translational biomarker discovery in cancer and developmental disorders.
- Operational Value: Ensures continuity from discovery through preclinical validation by providing stage-resolved, in vivo replication timing data applicable to genetic or environmental perturbations.
- Risk Mitigation: Supports risk-adjusted advancement decisions by revealing how replication timing perturbations impact development and disease phenotypes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target hypothesis testing through preclinical validation, offering a reproducible in vivo readout of replication dynamics that informs mechanistic de-risking and assay readiness.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking chromatin changes during development to DNA replication initiation events.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, quantitative replication timing profiles derived from sorted embryonic cells at defined developmental stages.
- Analytics: Provides normalized read counts, smoothed replication timing profiles, and genome-wide correlation metrics that allow quantitative comparison of conditions and replicates.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by enabling assessment of replication timing alterations in disease-relevant systems, such as mutant lines or disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for profiling replication timing across genetic backgrounds, developmental stages, and environmental perturbations, supporting platform-based discovery.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in target validation by reducing uncertainty in chromatin-replication mechanistic links.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible workflows for single-cell preparation and replication timing mapping, improving inter-lab consistency.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of replication timing-associated risks, reducing late-stage attrition in discovery programs.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by identifying compounds or genetic perturbations that alter replication timing profiles in vivo.
Implementation Considerations
- Expertise in zebrafish embryology and developmental staging is required for synchronized embryo collection and morphological verification.
- Instrumentation includes cell sorters capable of propidium iodide detection and next-generation sequencing infrastructure for genome-wide copy number analysis.
- Standardization across teams depends on consistent embryo collection intervals, dechorionation protocols, and single-cell suspension generation techniques.
- Adaptation to mutant lines or disease models requires validation of developmental timing and cellular yield under perturbed conditions.
- Practical limitations include the technical challenge of generating high-quality single-cell suspensions from embryos, which requires practice to avoid lysing cells during dissociation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:01
Setting Up Adult Zebrafish for Breeding
2:01
Timed Matings - Collecting, Sorting, and Housing Zebrafish Embryos for Experiments
3:23
Dechorionate, Deyolk, and Fix Zebrafish Embryos
6:09
Staining DNA and FACS Sorting Embryos
8:00
Results: Genome-wide DNA Replication Timing at High-resolution in Zebrafish
9:28
Conclusion
