Optimalisatie van een Multiplex RNA gebaseerde expressie-Assay met behulp van borst kanker archiefmateriaal

Deze methode is succesvol geoptimaliseerd om borstkankerpatiënten in bekende en niet-bekende therapeutische groepen te classificeren. De hoge gevoeligheid van deze test identificeert heterogene monsters die verder kunnen worden bestudeerd met behulp van laser microdissectie. Het belangrijkste voordeel van de RNA-gebaseerde multiplex-test is de reproduceerbaarheid van resultaten met behulp van met hematoxylinen en eosine gekleurd, formaline-gefixeerd, paraffine-ingesloten archiefmateriaal, waardoor hoge resolutie-uitvoer en biomarkervalidatie mogelijk is.

Bereid het weefsel zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de dissectie te beginnen, stel de dia-limieten in en kalibreer de trapbeweging van de microscoop. Scan nu de gekleurde membraanslides met behulp van het 4X objectief.

Selecteer en omcirkel de doelgebieden voor microdissectie op de membraanslide. Houd de totale oppervlakte bij. Er is minimaal 42 vierkante millimeter nodig voor adequate downstream RNA-analyse.

Begin vervolgens met het lasersnijden op de gedefinieerde parameters. Gebruik vervolgens het cap-lift-mechanisme om het gedissekteerde gedeelte op te halen en plaats het gedeelte op de diffusercap van een gelabelde buis die aan een mechanisch aanhangsel is bevestigd. Als het gedissekteerde gedeelte niet op de cap wordt opgehaald, herhaal dan de dissectie van het doelgebied.

Accuraatheid van microdissectie is een cruciale stap en men moet altijd ervoor zorgen dat het microdissected gebied dat op de cap aanwezig is, samenvalt met het gemarkeerde, gescande beeld. Verzamel zoveel weefselsecties als gewenst, elk in een aparte buis, en ga vervolgens door met het lyseren van de weefselmonsters. Voor de lysis, breng 2,4 microliter homogenisatieoplossing aan per vierkante millimeter weefseloppervlak in elk monster, en vervolgens wervel de monsters gedurende 10 seconden op de maximale snelheid.

Spin vervolgens de monsters vijf seconden bij 2.500 g. Breng de monsters vervolgens over naar 1,5-milliliterbuizen indien nodig, en plaats ze in een schuddende verwarmingsblok op 65 graden Celsius. Schud ze 600 tpm gedurende 12 tot 18 uur.

Centrifugeer vervolgens de lysaten bij 21.000 g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verzamel voorzichtig de heldere supernatant in een nieuwe gelabelde buis. Vermijd het overbrengen van weefselfragmenten.

De supernatanten kunnen worden bewaard bij min 80 graden Celsius. Nadat alle reagentia voor de hybridisatie-gebaseerde test zijn voorbereid, laad tot 90 wells van een magnetische scheidings-96-well plate met 25 microliter weefselhomogenaat. Laad 25 microliters controlemonsters in drie aangewezen wells en laad een 25-microliter homogenisatieoplossing in drie wells als blanco's.

Vervolgens sluit de magnetische scheidingsplaat met een doorzichtige plastic drukverbinding en plaats de plaat in een incubator van 54 graden Celsius gedurende 18 tot 22 uur met schudden. De volgende dag, monteer en vergrendel de plaat op een handmatige magnetische plaatwasher, verwijder vervolgens de drukverbinding en wacht een minuut tot de magnetische korrels zijn bezonken. Voer nu een wasstap uit.

Laat de plaat leeg lopen over een gootsteen en gebruik een tissue om het voorzichtig droog te deppen, laad vervolgens alle wells met 100 microliter 1X wasbuffer en wacht 15 seconden. Herhaal dit proces drie keer om de wasstap te voltooien. Na het verwijderen van de laatste was, laad de wells opnieuw met 50 microliter van de voorversterkerreagens, sluit vervolgens de plaat af met een aluminium plaatverbinding en schud de plaat gedurende één minuut bij 800 tpm bij kamertemperatuur.

Schud vervolgens de plaat gedurende een uur bij 50 graden Celsius. Wanneer dit voltooid is, voer een andere wasstap uit. Laad vervolgens de wells opnieuw met 50 microliter van de versterkerreagens, sluit de plaat af met een aluminium plaatverbinding en herhaal de schudende incubatie van één minuut bij kamertemperatuur gevolgd door een uur bij 50 graden Celsius, gevolgd door een andere wasstap.

Vortex nu de labelprobe gedurende 10 seconden op maximale snelheid en voeg vervolgens 50 microliter labelprobe toe aan elke well. Verzegeld de plaat opnieuw en herhaal de schudende incubatie zoals eerder, gevolgd door een andere wasstap. Laad vervolgens de wells met 50 microliter vers gemengd Streptavidin-fycoerytrine, voer vervolgens een schudende incubatie uit bij kamertemperatuur bij 600 tpm, gevolgd door een wasstap met Streptavidin-wasbuffer.

Na het voltooien van de wasstap, laad elke well met 100 microliter Streptavidin-wasbuffer en sluit de plaat af met een aluminium plaatverbinding, schud de plaat gedurende drie minuten bij kamertemperatuur bij 800 tpm. Tijdens de laatste incubatiestap, start de magnetische korrelanalyse en zorg ervoor dat het instrument is gekalibreerd en dat validatieprotocollen zijn uitgevoerd. Voeg in de software een nieuwe analyse toe door Selecteer Batch maken te selecteren met behulp van een bestaand protocol vanuit het tabblad Batches.

Vervolgens, in de plaatlay-out, wijs de wells aan als onbekend of blanco en geef een label voor elk in het Steekproefpaneel. Verwijder nu de aluminiumverbinding van de reactieplaat, haal het plaatladingsbakje uit en laad de plaat in de analyzer. Klik vervolgens op Intrekken en vervolgens op Batch uitvoeren om de analyzer te starten.

Na het lezen, haalt u de plaat uit en reinigt u de magnetische korrelanalyse zoals aanbevolen door de fabrikant. Ga voor analyse naar het tabblad Batchresultaten. Selecteer het betreffende analysebestand en gebruik de optie om het te exporteren als een csv-bestand, en maak vervolgens gemiddelden en ruwe scores met behulp van spreadsheetsoftware.

Zorg ervoor dat controles de verwachte signalen vertonen. Normaliseer de ruwe gegevens van het monster en analyseer de gegevensverdeling met behulp van een datascienceplatform of met behulp van gedefinieerde algoritmen om een hoofdcomponentenanalyse uit te voeren. De prestaties van de multiplex-parelreader en de test zijn cruciaal en het uitvoeren van seriële verdunningen van goed geannoteerd controlemonsters voordat waardevolle patiëntmonsters worden gebruikt, garandeert correcte resultaten.

Voor attributen, select