De rol van fysieke krachten in vroege Chick embryonale morfogenese sonderen

Het algemene doel van dit experimentele protocol is om de rol van mechanische krachten in de vroege hersenontwikkeling van embryo's te bestuderen door middel van ex ovo-experimenten. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de ontwikkelingsbiologie en biomechanica, zoals de rollen van mechanische signalen in morfogenese, dat is de generatie van biologische vorm. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de karakterisering van de rol van mechanische krachten in morfogenese op weefsel- en organismeniveau mogelijk maakt.

Om deze procedure te beginnen, gebruik delicate doekjes met 70% ethanol om de bevruchte, speciaal vrijgehouden White Leghorn-kippeneieren schoon te maken. Schik vervolgens de eieren in een longitudinale oriëntatie op een houder. Daarna, stel de eierincubator in op een doeltemperatuur van 37,5 graden Celsius en houd de luchtvochtigheid tussen 48 en 55%. De luchtvochtigheid wordt geregeld door een geschikte hoeveelheid water aan de incubator toe te voegen.

Incubeer de eieren ongeveer 40 tot 44 uur tot HH11 tot 13. Laat daarna de eieren ongeveer 15 tot 30 minuten afkoelen op kamertemperatuur voordat u ze schoonmaakt met 70% ethanol. In deze stap, breek de eieren vanaf de onderkant, trek voorzichtig de schaal uit elkaar en deponeer de inhoud voorzichtig in een 150 bij 15 millimeter petrischaal.

Om ervoor te zorgen dat de embryozijde boven ligt, houd de eieren in dezelfde oriëntatie als waarin ze zijn geïncubeerd terwijl je ze breekt. Verwijder het dunne albumine met behulp van een wegwerp Pasteur-pipet. Scheid het dikke albumine van de dooier met behulp van de stompe pincetten.

Zorg ervoor dat het dikke albumine is verwijderd door licht te schrapen over de bovenkant van de dooier. Plaats vervolgens met behulp van pincetten met een fijne punt een filterpapierring over het embryo en centreer het, waarbij de lange as van de ring overeenkomt met de lange as van het embryo. Snijd vervolgens het dooier rond de filterpapierring af met schaar.

Trek vervolgens de ring en het embryo in een schuine richting naar de plaats waar het dooier eerst is doorgesneden. Spoel vervolgens het embryo in twee opeenvolgende 100-millimeter schalen met PBS op kamertemperatuur. Plaats vervolgens een filterpapierring in een 35-millimeter petrischaal.

Plaats het embryo met de rugzijde naar boven op het andere filterpapier in de 35-millimeter petrischaal. Plaats daarna een roestvrijstalen ring op de filterpapiersandwich. Zorg ervoor dat het embryo niet wordt beschadigd.

Voeg nu drie milliliter van de eerder bereide CCM toe aan elke petrischaal. Verwijder het vitelline membraan van elk embryo door licht over de bovenkant van het embryo te schrapen met de getrokken capillaire naald. Schil vervolgens het vitelline membraan af, beginnend vanaf het voorste uiteinde en voortgaande naar de notochord.

Plaats vervolgens acht 35-millimeter petrischalen in één 150-millimeter schaal gevuld met met water verzadigde doekjes om de luchtvochtigheid te behouden. Plaats vervolgens de 150-millimeter petrischaal in een afsluitbare plastic zak en vul de zak met een gasmengsel bestaande uit 95% zuurstof en 5% CO2. Sluit de zak af en plaats deze in een incubatiekast op 37,5 graden Celsius.

Verwijder nu het embryo uit de incubatiekast en gebruik een OCT-systeem om ze te beeldhouwen en om de torsiehoek van de neurale buis te bepalen. Breng de embryo's over naar een lichtmicroscoop en visualiseer bij 10X vergroting. Gebruik een 200-microliter pipette om incrementeel 0,2 milliliter medium uit de petrischaal te verwijderen.

Neem na elke ronde van mediumverwijdering helderveldbeelden om het effect van de medium-luchtinterface op het embryo te observeren. Blijf medium verwijderen totdat de oppervlaktespanning over het embryo torsie induceert. Beeld het embryo opnieuw af met behulp van het OCT-systeem om een ​​definitieve torsiehoek vast te stellen voor vergelijking met controle-embryo's.

Om de richting van de hartlus te veranderen, gebruik een paar pincetten om het filterpapier om te draaien, zodat het embryo met de buikzijde naar boven komt te liggen. Gebruik vervolgens de getrokken capillaire buis om een ​​snede in het splanchnopleuremembraan te snijden en om een ​​mechanische kracht uit te oefenen om het hart van de rechterkant naar de linkerkant te duwen. Gebruik de vloeistofvlakopspanning om het hart aan de linkerkant te houden.

Incubeer vervolgens het embryo nog eens 20 uur om de verandering in chiraliteit van de torsie te zien. Hier is een geoogst embryo met VM verwijderd bij HH11. Hetzelfde embryo geïncubeerd gedurende 27 uur na VM-verwijdering toont verminderde torsie.

Hier is hetzelfde embryo dat hersentorsie onderging bij toepassing van vloeistofvlakopspanning, en hier is het controle-embryo met normale hersentorsie in een vergelijkbaar stadium. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om voorzichtig te zijn om het embryo niet te beschadigen. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals eindige elementenanalyse worden uitgevoerd om computationeel te modelleren hoe fysische krachten de morfologie kunnen beïnvloeden.

Daarom heeft deze hier ontwikkelde techniek de weg geëffend voor toekomstige studies over de mechanica van morfogenese in kippenembryo's. Na het bekijken van deze video, zou u moeten begrijpen hoe kippenembryo's te oogsten voor in vitro-kweek, microchirurgisch de vitelline membraan te verwijderen, de kracht van de vitelline membraan te herhalen en de embryonale morfologie te monitoren door middel van OCT en helderveldbeeldvorming.