Name: Driedimensionale inflammatoire menselijk weefsel equivalenten van tandvlees (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Leer hoe je driedimensionale inflammatoire weefselmodellen van tandvlees bouwt met menselijke cellen in vitro. Deze methode ondersteunt onderzoek naar wondgenezing en weefselregeneratie bij parodontale aandoeningen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Japan Society voor de promotie van wetenschap (JSPS) Grant-in-Aid voor wetenschappelijkonderzoek (26861689 en 17 K 11813). De auteurs bedank Mr. Nathaniel Green voor proeflezen.

Dit protocol is ontworpen om menselijke gingival weefsel equivalenten, modellen gingival wond en gingivitis modellen maken. Menselijke huid epidermale keratinocyten (HaCaT) werden vriendelijk geleverd door Professor Norbert E. Fusenig van Deutsches Krebsforschungszentrum (Heidelberg, Duitsland)7. Menselijke gingival fibroblasten (HGFs) werden geïsoleerd uit gingival weefsels volgens de eerder gepubliceerde protocollen8. Geïnformeerde toestemming vooraf was verkregen, en de studie goedgekeurd volgens de richtsnoeren van de Commissie voor ethiek, de Nippon tandheelkundige University School leven tandheelkunde in Tokyo (Authorization Number: NDU-T2012-35). Protocol stappen 1-3 moeten worden uitgevoerd in een cel cultuur kap.
1. bereiding van 3D menselijk weefsel equivalenten van tandvlees (GTE) (figuur 1A)
<ol><li>Mix collageen type-A gel met 10% geconcentreerde MEM-alpha en 10% wederopbouw buffer (2.2 g van NaHCO3 en 4,47 g HEPES in 100 mL 0,05 N NaOH) in een buis 15 mL steriele door pipetteren. Bewaar deze oplossing gemengde collageen op ijs totdat gebruikt.</li>
	<li>24-well cultuur inserts (porie grootte 3.0 µm) in een 24-well plaat plaatsen.</li>
	<li>
Verwijder HGFs uit het oppervlak van de cultuur met behulp van 0,25% trypsine-EDTA-oplossing. Opschorten van de cellen in 10 mL gestolde voedingsbodem A (MEM-alpha + 20% FBS + 1% GlutaMAX). Cellen tellen door een Bürker-Türk cel teller.
	<ol>
<li>Uitpakken van de gewenste hoeveelheid cellen (1-5 x105 cellen/mL), en vervolgens gedurende 4 min op 190 x g centrifugeren.</li>
		<li>Opschorten van de cellen in de gemengde collageen-oplossing. Houd het mengsel op het ijs tot de volgende stap.</li>
	</ol>
</li>
	<li>0,5 mL van het mengsel van de cel-collageen (0.5-2.5 x 105 cellen/well) in de cultuur invoegen toevoegen zonder produceren bubbels. Incubeer het mengsel gedurende 10-30 min. in een bevochtigde sfeer met 5% CO2 bij 37 ° C te coaguleren van het mengsel in een gel. Opmerking: Voeg het collageen-mengsel in het midden van de cultuur invoegen om ongelijke vorming van collageen gel.</li>
	<li>Voeg 1 mL gestolde voedingsbodem in de put en in de insert 0,5 mL. Incubeer de cultuur plaat voor 24u of overnachting in een bevochtigde sfeer met 5% CO2 bij 37 ° C.</li>
	<li>HaCaT cellen verwijderen uit het oppervlak van de cultuur met behulp van 0,25% trypsine-EDTA-oplossing. Opschorten van de cellen in 10 mL van medium B (DMEM + 10% FBS + 1% GlutaMAX) en de cellen tellen. Extract het benodigde aantal cellen (1-5 x 105 cellen/mL) met een precisiepipet centrifuge voor 4 min op 190 x g. schorten de cellen in middelgrote B.</li>
	<li>Verwijder het medium van de cultuur inserts, waarin het mengsel HGF-collageen door aspiratie. Voeg 0,5 mL celsuspensie HaCaT (0.5-2.5 x 105 cellen/well) op de bovenkant van het mengsel HGF-collageen. Incubeer de culturen voor 24 h of 's nachts. Opmerking: Op dit punt van tijd, het medium in de cultuur Nou moet middellange A, terwijl het medium in de cultuur invoegen middellange B. moet</li>
	<li>Vervang het kweekmedium met KSR medium (co kweekmedium) (MEM-alpha + 15% KnockOut Serum vervanging + 1% GlutaMAX) + 5% FBS. Voeg 1 mL gestolde voedingsbodem in de cultuur goed en in de cultuur-insert 0,5 mL. Incubeer de culturen voor 24-48 h.</li>
	<li>Het kweekmedium vervangen door KSR medium + 1% FBS. Voeg 1 mL in de cultuur goed en 0,5 mL in de cultuur invoegen. Incubeer de culturen voor 24 h of 's nachts.</li>
	<li>Vervang het kweekmedium in de cultuur goed met 0,7-1 mL KSR medium. Verwijder het medium volledig uit het invoegen van de cultuur (het oppervlak cultuur mag worden blootgesteld aan lucht). Incubeer de culturen voor 1-2 weken. Het wijzigen van het medium in de cultuur goed twee keer per week. Opmerking: Laat niet de middellange niveau boven het oppervlak van de cultuur (de bovenste laag opgebouwd van keratinocyten). Altijd de cultuur oppervlak droog te houden.</li>
</ol>2. voorbereiding van de gewonde GTE (figuur 1B)
<ol><li>Een 1-3 mm diameter weefsel perforatie voor te bereiden. Steriliseren het met een autoclaaf bij 121 ° C gedurende 20 minuten.</li>
	<li>Duw de weefsel perforatie loodrecht in GTE over 300 µm diepe en punch een gat in het weefsel te simuleren van een wond.</li>
	<li>Bij deze stap gebruikt u de gewonde GTE voor het onderzoeken van de wond genezing en weefsels regeneratie. U kunt ook vast GTE 10% formaline neutrale Bufferoplossing met histologische analyses uit te voeren.</li>
</ol>3. voorbereiding van de inflammatoire GTE (iGTE) (figuur 1B)
<ol><li>Cultiveren THP-1 cellen volgens de vorige verslag-9.</li>
	<li>Mix collageen type-A gel met 10% geconcentreerd RPMI 1640, 10% wederopbouw buffer (2.2 g van NaHCO3 en 4,47 g HEPES in 100 mL 0,05 N NaOH) en 10 ng/mL PMA. Bewaar deze gemengde collageen oplossing op ijs tot gebruik.</li>
	<li>Tellen 1-2 x 106 THP-1 cellen en centrifuge voor 4 min op 190 x g. schorten de cellen in 1 mL van de oplossing van de gemengde collageen. Houd het mengsel op het ijs tot de volgende stap.</li>
	<li>Voeg 10-30 µL THP-1-collageen mengsel in de gewonde gebied van GTE. Vervang het kweekmedium aan 0.7-1 mL KSR opslagmedium met 10 ng/mL PMA.</li>
	<li>Incubeer het mengsel in een bevochtigde sfeer met 5% CO2 bij 37 ° C gedurende 72 uur.</li>
	<li>Gebruik van het model voor het onderzoeken van tandvleesontsteking of parodontitis (bijvoorbeeld het toevoegen van potentiële anti-inflammatoire geneeskunde aan iGTE om te zien de gevolgen ervan voor de cytokine versie10). U kunt ook weglaten 72 h PMA-behandeling, voeg 2 µg/mL LPS in de cultuur, en Incubeer het weefsel in een bevochtigde sfeer met 5% CO2 bij 37 ° C gedurende 48 h11,12.</li>
</ol>4. fixatie en hele Mount immunokleuring van GTE en iGTE culturen
<ol><li>
Fixatie van de culturen.
	<ol>
<li>Verwijder het kweekmedium uit de plaat 24-well. Wassen van de weefsels 2 keer met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
		<li>Voeg 1 mL van de neutrale bufferoplossing 10% formaline de invoegen en 1 mL ook aan de cultuur. Laat de plaat 24-well in een koelkast bij 4 ° C's nachts.</li>
		<li>De volgende dag 10% formaline neutrale bufferoplossing te verwijderen.</li>
		<li>Voor hele mount immunokleuring, de weefsels 3 - 4 keer met PBS na fixatie te wassen.</li>
		<li>Voor de haematoxyline en eosine (H & E) kleuring en regelmatige immunokleuring, gaat u verder met uitdroging, paraffine insluiten en segmenteren. Opmerking: Voor de hele berg immunokleuring, deze stap kan worden weggelaten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hele mount immunokleuring Opmerking: Dit protocol werd gewijzigd van in verwijzing 13.<ol>
<li>Wassen van de weefsels 3 x in PBS 0,5 – 1% Triton, 10-30 min. telkens.</li>
		<li>Incubeer de weefsels tweemaal voor 30 min in de blokkeerbuffer (PBS 1% Triton + 10% BSA), bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Wassen van de weefsels 2 × in de blokkeerbuffer, 5 – 10 min telkens.</li>
		<li>50 µL van primair antilichaam oplossing op de vereiste verdunning/concentratie aan de inserts toevoegen. Gebruik een dun plastic cling-film wilt laten teruglopen van de inserts Voorkom uitdrogen van het weefsel.</li>
		<li>Het weefsel Incubeer gedurende 1 tot 2 dagen bij 4 ° C.</li>
		<li>Wassen de weefsels 3 keer, 1% gedurende 30 min. in PBS Triton + 10% BSA. Wassen weer 3 keer, gedurende 5 min. in PBS 1% Triton.</li>
		<li>Voeg 50 µL van secundair antilichaam in blokkeerbuffer (PBS 1% Triton + 10% BSA) en 5 µL van Hoechst 33342 oplossing (NucBlue Live cel vlek) voor elke toevoeging. Gebruik een dun plastic cling-film wilt laten teruglopen van de inserts Voorkom uitdrogen van het weefsel.</li>
		<li>Incubeer gedurende 1 tot 2 dagen bij 4 ° C. Wikkel de 24-well-plaat in een natte papieren handdoek, en zet het dan in een plastic verpakking moet worden gebruikt tijdens de incubatie.</li>
		<li>Wassen van de weefsels 3 keer, voor 10 min in PBS 1% triton</li>
		<li>Gebruik een scherpe naald te snijden het membraan van het donormateriaal cultuur te verkrijgen van het weefsel. Plaats het membraan in een dia verschijnt. Opmerking: Het weefsel moet worden op het membraan.</li>
		<li>Voeg 2-3 druppels van fluorescentie mount medium. Betrekking hebben op het weefsel met een cover glas en bewaren bij 4 ° C in het donker tot analyse.</li>
		<li>Weefsels met een confocale laser scanning microscopie (LSM) bekijken.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Cekici, A., Kantarci, A., Hasturk, H., Van Dyke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+and+immune+pathways+in+the+pathogenesis+of+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Periodontology+2000%22%5BJournal%5D)">Inflammatory and immune pathways in the pathogenesis of periodontal disease.</a> Periodontology 2000. 64 (1), 57-80 (2014).</li>
<li>Hasturk, H., Kantarci, A., Van Dyke, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+Inflammatory+Diseases+and+Systemic+Inflammation%3A+Role+of+the+Macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Oral Inflammatory Diseases and Systemic Inflammation: Role of the Macrophage.</a> Frontiers in Immunology. 3, 118(2012).</li>
<li>Koh, T. J., DiPietro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+wound+healing%3A+The+role+of+the+macrophage%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+reviews+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Inflammation and wound healing: The role of the macrophage.</a> Expert reviews in molecular medicine. 13, e23(2011).</li>
<li>Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+and+fibroblasts+during+inflammation+and+tissue+repair+in+models+of+organ+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Regeneration%22%5BJournal%5D)">Macrophages and fibroblasts during inflammation and tissue repair in models of organ regeneration.</a> Regeneration. 4 (2), 39-53 (2017).</li>
<li>Struillou, X., Boutigny, H., Soueidan, A., Layrolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Animal+Models+in+Periodontology%3A+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22The+Open+Dentistry+Journal%22%5BJournal%5D)">Experimental Animal Models in Periodontology: A Review.</a> The Open Dentistry Journal. 4, 37-47 (2010).</li>
<li>Han, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+Periodontal+Bacteria+and+Human+Oral+Epithelial+Cells%3A+Fusobacterium+nucleatum+Adheres+to+and+Invades+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Interactions between Periodontal Bacteria and Human Oral Epithelial Cells: Fusobacterium nucleatum Adheres to and Invades Epithelial Cells.</a> Infection and Immunity. 68 (6), 3140-3146 (2000).</li>
<li>Boukamp, P., Petrussevska, R. T., Breitkreutz, D., Hornung, J., Markham, A., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+keratinization+in+a+spontaneously+immortalized+aneuploid+human+keratinocyte+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line.</a> J Cell Biol. 106 (3), 761-771 (1988).</li>
<li>Xiao, L., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen-rich+water+achieves+cytoprotection+from+oxidative+stress+injury+in+human+gingival+fibroblasts+in+culture+or+3D-tissue+equivalents%2C+and+wound-healing+promotion%2C+together+with+ROS-scavenging+and+relief+from+glutathione+diminishment%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Cell%22%5BJournal%5D)">Hydrogen-rich water achieves cytoprotection from oxidative stress injury in human gingival fibroblasts in culture or 3D-tissue equivalents, and wound-healing promotion, together with ROS-scavenging and relief from glutathione diminishment.</a> Hum Cell. 30 (2), 72-87 (2017).</li>
<li>Tsuchiya, S., Yamabe, M., Yamaguchi, Y., Kobayashi, Y., Konno, T., Tada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li>
<li>Ara, T., Kurata, K., Hirai, K., Uchihashi, T., Uematsu, T., Imamura, Y., Furusawa, K., Kurihara, S., Wang, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gingival+fibroblasts+are+critical+in+sustaining+inflammation+in+periodontal+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Periodontal+Res%22%5BJournal%5D)">Human gingival fibroblasts are critical in sustaining inflammation in periodontal disease.</a> J Periodontal Res. 44 (1), 21-27 (2009).</li>
<li>Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+THP-1+differentiation+is+required+for+the+detection+of+responses+to+weak+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Res%22%5BJournal%5D)">Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli.</a> Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).</li>
<li>Sharif, O., Bolshakov, V. N., Raines, S., Newham, P., Perkins, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+the+LPS+induced+NF-kappaB+response+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of the LPS induced NF-kappaB response in macrophages.</a> BMC Immunol. 8, 1(2007).</li>
<li>Abcam. Whole mount fluorescent immunohistochemistry. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/whole_mount_fluorescent_ihc.pdf">http://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/whole_mount_fluorescent_ihc.pdf</a> (2017).</li>
<li>Shetty, S., Gokul, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinization+and+its+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Oman+Med+J%22%5BJournal%5D)">Keratinization and its disorders.</a> Oman Med J. 27 (5), 348-357 (2012).</li>
<li>Klinge, B., Matsson, L., Attström, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+of+initial+gingivitis+in+humans.+A+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Histopathology of initial gingivitis in humans. A pilot study.</a> J Clin Periodontol. 10 (4), 364-369 (1983).</li>
<li>Nagarakanti, S., Ramya, S., Babu, P., Arun, K. V., Sudarsan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+E-cadherin+and+cytokeratin+19+and+net+proliferative+rate+of+gingival+keratinocytes+in+oral+epithelium+in+periodontal+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of E-cadherin and cytokeratin 19 and net proliferative rate of gingival keratinocytes in oral epithelium in periodontal health and disease.</a> J Periodontol. 78 (11), 2197-2202 (2007).</li>
<li>Goodpaster, T., Legesse-Miller, A., Hameed, M. R., Aisner, S. C., Randolph-Habecker, J., Coller, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunohistochemical+method+for+identifying+fibroblasts+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> J Histochem Cytochem. 56 (4), 347-358 (2008).</li>
<li>Langeland, K., Rodrigues, H., Dowden, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodontal+disease%2C+bacteria%2C+and+pulpal+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Surg+Oral+Med+Oral+Pathol%22%5BJournal%5D)">Periodontal disease, bacteria, and pulpal histopathology.</a> Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 37 (2), 257-270 (1974).</li>
<li>Holness, C. L., Simmons, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+CD68%2C+a+human+macrophage+marker+related+to+lysosomal+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins.</a> Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).</li>
<li>Mor-Vaknin, N., Punturieri, A., Sitwala, K., Markovitz, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vimentin+is+secreted+by+activated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Vimentin is secreted by activated macrophages.</a> Nat Cell Biol. 5 (1), 59-63 (2003).</li>
<li>Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+squalane-dissolved+on+adipogenesis-accompanied+oxidative+stress+and+macrophage+in+a+preadipocyte-monocyte+co-culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of squalane-dissolved on adipogenesis-accompanied oxidative stress and macrophage in a preadipocyte-monocyte co-culture system.</a> Biomaterials. 31 (23), 5976-5985 (2010).</li>
<li>Xiao, L., Aoshima, H., Saitoh, Y., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+hydroxylated+fullerene+localizes+at+the+cytoskeleton+and+inhibits+oxidative+stress+in+adipocytes+and+a+subcutaneous+adipose-tissue+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Highly hydroxylated fullerene localizes at the cytoskeleton and inhibits oxidative stress in adipocytes and a subcutaneous adipose-tissue equivalent.</a> Free Radic Biol Med. 51 (7), 1376-1389 (2011).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dit protocol is gebaseerd op de methoden van het creëren van gingival weefsel equivalenten en onderhuids vetweefsel equivalenten beschreven door vorige verslagen8,-21,22. Hoewel dit een eenvoudige en gemakkelijke methode is, vereist enkele stappen speciale aandacht. Het mengsel van collageen moet bijvoorbeeld op ijs worden bewaard tot gebruik om te voorkomen dat de formatie van de gel in de oplossing. Bij het toevoegen van het m...

Parodontale ziekten zijn de belangrijkste oorzaak van tandverlies bij volwassenen. Gingivitis en Parodontitis zijn de meest voorkomende parodontale ziekten. Beide aanwezig biofilm-gemedieerde acute of chronische ontstekingsreactie in het tandvlees. Gingivitis wordt gekenmerkt door een acute ontsteking, overwegende dat parodontitis meestal als chronische ontsteking presenteert. Op het niveau van de histologische activeren bacteriële onderdelen de activering van immune cellen, zoals macrofagen, lymfocyten en plasmacellen mestcellen1,2. Deze immune cellen, met name in macrofagen, interactie met lokale cellen (inclusief gingival epitheliale cellen, fibroblasten, endotheliale cellen en botcellen) wat resulteert in de inflammatoire letsels in parodontale weefsel3,4. Experimentele modellen van parodontale ziekten zijn vastgesteld in verschillende soorten dieren, zoals ratten, hamsters, konijnen, fretten, hoektanden en primaten. Echter verschilt de fysiopathologie van diermodellen van die van de mens, waardoor het moeilijk is om te analyseren van cellulaire en moleculaire mechanismen en evalueren van nieuwe geneesmiddelen voor parodontale ziekten5. Co teelt van Parodontale bacteriën en enkelgelaagde menselijke mondelinge epitheliale cellen is gebruikt om het mechanisme van parodontale infecties6onderzoeken. Niettemin ontbreken enkelgelaagde culturen van mondelinge cellen de driedimensionale (3D) cellulaire architectuur van intact weefsel; Daarom, zij kunnen niet na te bootsen de situatie in vitro .
3D inflammatoire menselijk weefsel equivalenten van tandvlees (iGTE) zijn hier gevestigd parodontale ziekten in vitrote vertegenwoordigen. Deze 3D-model van parodontale ziekten is gevestigd in een tussenpositie tussen enkelgelaagde cel-culturen en dierlijke modellen. Drie soorten menselijke cellen, met inbegrip van HaCaT keratinocyten, gingival fibroblasten en THP-1 macrofagen, zijn samen op collageen gel worden gekweekt, en gestimuleerd door inflammatoire initiatiefnemers te bouwen iGTE. IGTE simuleert nauw de in vivo voorwaarden van celdifferentiatie, interactie van cel-cel en macrofaag activering in het tandvlees. Dit model heeft vele mogelijke toepassingen voor drug screening en testen van nieuwe farmacologische benaderingen in parodontale ziekten, alsmede voor het analyseren van cellulaire en moleculaire mechanismen in de wondgenezing, ontsteking en weefselregeneratie.

<table><tbody><tr><td>Collagen type I-A</td><td>Nitta Gelatin Inc</td><td></td><td>Voor het maken van dermis van GTE</td></tr><tr><td>MEM-alpha</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11900073</td><td>Celcultuurmedium</td></tr><tr><td>Cell Culture Insert (voor 24-well plaat), poriegrootte 3,0 &mu;m</td><td>Corning, Inc.</td><td>353096</td><td>Voor weefselcultuur</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Celcultuurreagens</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31600034</td><td>Celcultuurmedium</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td>Celcultuurreagens</td></tr><tr><td>Weefselpons</td><td>Shibata system service co., LTD</td><td>SP-703</td><td>Voor het ponsen van gaten in GTE</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31800022</td><td>Celcultuurmedium</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294</td><td>Voor immunokleuring</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 (NucBlue Live Cell stain)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37605</td><td>Voor het labelen van kernen</td></tr><tr><td>Fluorescentie montagemedium</td><td>Dako</td><td></td><td>Voor het monteren van monsters na immunokleuring</td></tr><tr><td>Anti-Cytokeratin 8+18 antilichaam [5D3]</td><td>abcam</td><td>ab17139</td><td>Voor het identificeren van epitheel</td></tr><tr><td>Scanende elektronenmicroscoop</td><td>Hitachi, Ltd.</td><td>HITACHI S-4000</td><td>Voor het observeren van de oppervlaktetopografie en samenstelling van monsters</td></tr><tr><td>Confocale laserscanningmicroscopie</td><td>LSM 700; Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd.</td><td>LSM 700</td><td>Voor het observeren van de immunofluorescentiekleuring van monsters</td></tr><tr><td>Anti-Cytokeratin 19 antilichaam</td><td>abcam</td><td>ab52625</td><td>Voor het identificeren van epitheel</td></tr><tr><td>Anti-vimentin antilichaam</td><td>abcam</td><td>ab92547</td><td>Voor het identificeren van fibroblasten en geactiveerde macrofagen</td></tr><tr><td>Anti-TE-7 antilichaam</td><td>Millipore</td><td>CBL271</td><td>Voor het identificeren van fibroblasten in de dermis</td></tr><tr><td>Anti-CD68 antilichaam</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB2700244</td><td>Voor het identificeren van macrofagen</td></tr><tr><td>Human CD14 Antilichaam</td><td>R&amp;D Systems</td><td>MAB3832-SP</td><td>Voor het identificeren van macrofagen</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-geconjugeerd secundair geitenanti-konijn antilichaam</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11012</td><td>Voor immunofluorescentiekleuring</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-geconjugeerd secundair geitenanti-muis antilichaam</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td>Voor immunofluorescentiekleuring</td></tr><tr><td>EVOS FL Celbeeldvormingssysteem</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Voor het observeren van de immunofluorescentiekleuring van het monster</td></tr><tr><td>THP-1 cellen</td><td>Riken BRC cellbank</td><td>RCB1189</td><td>Voor het maken van iGTE</td></tr><tr><td>PMA(Phorbol 12-myristaat 13-acetaat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td>Voor het differentiëren van THP-1 cellen</td></tr></tbody></table>

driedimensionale inflammatoire menselijk weefsel equivalenten van tandvlees

Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva

Parodontale ziekten (zoals gingivitis en parodontitis) zijn de belangrijkste oorzaken van tandverlies bij volwassenen. Ontsteking in tandvlees is de fundamentele fysiopathologie van parodontale ziekten. Huidige experimentele modellen van parodontale ziekten zijn vastgesteld in verschillende soorten dieren. Echter verschilt de fysiopathologie van diermodellen van die van de mens, waardoor het moeilijk is om te analyseren van cellulaire en moleculaire mechanismen en evalueren van nieuwe geneesmiddelen voor parodontale ziekten. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de wederopbouw van menselijk weefsel van de inflammatoire equivalenten van tandvlees (iGTE) in vitro. Wij bouwen eerst menselijk weefsel equivalenten van tandvlees (GTE) door gebruik te maken van twee soorten menselijke cellen, met inbegrip van menselijke gingival fibroblasten (HGF) en menselijke huid epidermale keratinocyten (HaCaT), drie-dimensionale omstandigheden. We maken een wond-model met behulp van een weefsel perforatie om punch een gat in de GTE. Volgende, menselijke THP-1 monocyten gemengd met collageen gel worden ingespoten in het gat in de GTE. Door adimistration van 10 ng/mL phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA) voor 72 uur, THP-1 cellen onderscheiden in macrofagen naar formulier inflammatoire foci in GTE (iGTE) (IGTE kunnen ook stumilated met 2 µg/mL lipopolysacchariden (LPS) voor 48 h tot ontsteking ). IGTE is de eerste in vitro model van inflammatoire tandvlees met behulp van menselijke cellen met een driedimensionale architectuur. IGTE weerspiegelt belangrijke pathologische veranderingen (immunocytes werkzaamheden, intracellulaire interacties tussen fibryoblasts, epitheliaale cellen, monocyten en macrofagen) in parodontale ziekten. GTE, gewonde GTE en iGTE kunnen worden gebruikt als veelzijdige tools om te studeren wondgenezing, weefselregeneratie, ontsteking, cel-cel interactie en scherm potentiële geneesmiddelen voor parodontale ziekten.

HaCaT cellen weergegeven typische Keratinocyt morfologie onder fase contrast microscopische observatie (figuur 2A). Scanner elektronen microscopische (SEM) beelden bleek dat de HaCaT cel oppervlakken werden gedekt door veel microvilli. Intercellulaire verbindingen tussen HaCaT cellen werden bemiddeld door membraanscheidingsprocessen (figuur 2B). HaCaT cellen uitgedrukt gingival epitheel marker K8/18/EG14, ...

Het doel van het protocol is het bouwen van een inflammatoire menselijke tandvlees model in vitro. Dit weefsel model cultiveert samen drie soorten menselijke cellen, HaCaT keratinocyten, gingival fibroblasten en THP-1 macrofagen, driedimensionale omstandigheden. Dit model kan worden toegepast op het onderzoek naar parodontale ziekten, zoals gingivitis en Parodontitis.

Driedimensionale inflammatoire menselijk weefsel equivalenten van tandvlees

Periodontal diseases (such as gingivitis and periodontitis) are the leading causes of tooth loss in adults. Inflammation in gingiva is the fundamental ...

Het algemene doel van dit experiment is om een 3D ontstekingsmodel van het tandvleesweefsel te reconstrueren door drie soorten menselijke cellen in vitro te gebruiken. Deze methode kan helpen bij het bestuderen van wondgenezing, weefselregeneratie, ontsteking en het screenen van potentiële medicijnen voor parodontale ziekten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat dit de eerste methode is om een in vitro model van ontstekingsgingiva te bouwen met behulp van menselijke cellen met een driedimensionale architectuur.Voeg in een steriele buis van 15 milliliter collageen type I-A, 10%geconcentreerd MEM-alpha en 10%reconstructiebuffer toe. Laat vervolgens het collageenmengsel op ijs staan tot het de volgende keer wordt gebruikt. Plaats vervolgens de 24-well kweekinserts met een poriegrootte van drie micrometer in een 24-well kweekplaat.Gebruik vervolgens 25%trypsin-EDTA-oplossing om de HGF's los te maken van de kweekfles. Sla de losgemaakte cellen vervolgens op in 10 milliliter kweekmedium. Tel vervolgens het aantal cellen met behulp van een Burker-Turk celteller.Na het isoleren van het gewenste aantal cellen, centrifugeer de cellen gedurende vier minuten bij 190 keer g. Sla het cellenpelletje op met de collageenoplossing en laat de buis op ijs staan. Voeg vervolgens 5 milliliter cel-collageenmengsel toe aan de kweekinsert zonder luchtbellen te produceren.Incubeer vervolgens de kweekinsert met het cel-collageenmengsel gedurende 10 tot 30 minuten bij 37 graden Celsius en 5%koolstofdioxide. Voeg na de incubatie één milliliter kweekmedium toe aan de put en 5 milliliter medium in de insert. Incubeer vervolgens de kweekplaat gedurende een dag bij 37 graden Celsius met 5%koolstofdioxide.Gebruik vervolgens 25%trypsin-EDTA-oplossing om de HaCaT-cellen los te maken van de kweekplaat. Zodra de cellen zijn losgemaakt, voeg 10 milliliter medium B toe aan de cellen. Tel vervolgens het aantal cellen.Na het isoleren van het gewenste aantal cellen, centrifugeer de cellen gedurende vier minuten bij 190 keer g. Los na de centrifugatie het cellenpellet op in medium B. Aas vervolgens het medium van de kweekinsert af. Voeg vervolgens 5 milliliter HaCaT-cellensuspensie toe over het HGF-collageenmengsel.Laat de kweekinsert een dag in de incubator staan. Vervang de volgende dag het kweekmedium. Voeg één milliliter co-cultuur KSR-medium toe, aangevuld met 5%foetaal runder serum, aan de kweekput en 5 milliliter in de kweekinsert.Incubeer vervolgens de kweekplaat gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius. De volgende dag vervangt u het kweekmedium door co-cultuur KSR-medium, aangevuld met 1%foetaal runder serum. Verwijder na 24 uur het gehele kweekmedium uit zowel de kweekinsert als de kweekput.Voeg vervolgens vers 7 tot één milliliter KSR-medium toe aan de kweekput en blijf twee weken lang cultiveren. Vergeet niet om het medium in de kweekput twee keer per week te verversen. Bereid een weefselpons voor met een diameter van één tot drie millimeter en steriliseer de pons in de autoclaaf bij 121 graden Celsius gedurende 20 minuten.Na sterilisatie, duw de weefselpons loodrecht in GTE voor ongeveer 30 micrometer diep om een wond in het weefsel te maken. Meng vervolgens 10 nanogram per milliliter PMA, 10%reconstructiebuffer en 10%geconcentreerd RPMI-medium met collageen type I-A-gel. Laat vervolgens het collageenmengsel op ijs staan tot het de volgende keer wordt gebruikt.Centrifugeer vervolgens de THP-1-cellen gedurende vier minuten bij 190 keer g. Sla het cellenpellet op in één milliliter collageenoplossing en laat op ijs staan. Voeg vervolgens 10 tot 30 microliter van de THP-1 cel-collageenmengsel toe aan het gewonde gebied van de GTE.Vervang vervolgens het kweekmedium door 7 tot één milliliter KSR-medium dat 10 nanogram per milliliter PMA bevat. Incubeer vervolgens het mengsel gedurende 72 uur bij 37 graden Celsius en 5%koolstofdioxide. Om de gereconstrueerde GTE te karakteriseren, worden H en E-kleuring en scanning elektronenmicroscopie uitgevoerd.De beelden tonen GTE die een gingiva-achtige weefselstructuur vertoont met meerdere lagen epitheel en lamina propria. De beelden laten ook zien dat de HGF-cellen in de gereconstrueerde GTE's distincte morfologische kenmerken van fibroblasten vertonen, omgeven door collageenvezels. Vervolgens wordt immunofluorescencekleuring uitgevoerd om de expressie van dermale en epitheliale markers te bestuderen.Dit is om te valideren of GTE en iGTE de moleculaire kenmerken van de echte ontstekingsgingiva van de mens hebben. De beelden tonen aan dat vimentin en TE-7 sterk aanwezig zijn in de lamina propria van GTE. K19, een specifieke marker voor het junctionale epitheel bij parodontitis, hoewel zwak tot uiting komt in het GTE-epitheel, is sterk genoeg in het iGTE-epitheel.Ten slotte, om de ontstekingshaarden in iGTE te genereren, worden PMA-behandelde THP-1 monocyten geïnjecteerd in het gewonde gebied van het weefsel. Na 72 uur na PMA-behandeling zijn de THP-1 cellen gedifferentieerd in macrofaag-achtige cellen. Hele-mount immunokleuring bevestigde dat deze cellen twee belangrijke macrofaagmarkers, CD14 en vimentin, tot expressie brengen en de ontstekingshaarden vormen.Eenmaal beheerst, kan deze techniek in drie tot vier weken worden uitgevoerd als deze goed wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat besmetting moet worden vermeden. Na het volgen van deze procedure kunnen andere methoden, zoals het gebruik van LPS om ontstekingsreacties te stimuleren, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe ontsteking kan worden geïnduceerd door interacties tussen de gastheer en de biofilm.</p

three-dimensional-inflammatory-human-tissue-equivalents-of-gingiva

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Deze studie beschrijft een efficiënte techniek voor het isoleren en verwerken tandvleesweefsels van de muis mondholte om een-celkweek produceren. De resulterende cellen kunnen verder worden gebruikt voor flowcytometrie-analyse en moleculaire studies.

Isolatie, verwerking en analyse van Muriene Gingival Cells

Methoden om menselijke 3D tumorweefsels maken als testsystemen worden beschreven. Deze technologieën zijn gebaseerd op een van cellen ontdane biologische Gevasculariseerd Steiger (BioVaSc), primaire humane cellen en tumor cellijn, die kan worden gekweekt in statische als onder dynamische omstandigheden in een stroom bioreactor.

Tissue Engineering van een Menselijke 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Tumor Test System

Het doel van dit protocol is om een driedimensionaal huidequivalent van volledige dikte op te bouwen, dat lijkt op natuurlijke huid. Met een speciaal geconstrueerd geautomatiseerd wondapparaat kunnen nauwkeurige en reproduceerbare wonden worden gegenereerd onder behoud van steriliteit.

Genereren van een drie-dimensionale volledige dikte huidequivalent en Automated Verwonden

Dit manuscript beschrijft de productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een tissue engineered 3D-oesofageale construct bereid uit normale primaire menselijke slokdarm fibroblast en squameuze epitheelcellen gezaaid binnen een de-cellularized varkens schavot. De resultaten tonen de vorming van een volwassen gelaagd epitheel gelijk aan de normale menselijke esophagus.

Productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een 3D Tissue-engineered Human Slokdarmkanker Mucosale Model

We hebben een techniek ontwikkeld voor de isolatie, karakterisatie fenotypische en functionele analyse van immuuncellen van muizen gingiva vastgesteld.

Isolatie, karakterisering en functionele onderzoek van het tandvlees Immune Cell Network

Dit manuscript beschrijft een zachte lithografie gebaseerde techniek uniforme arrays van driedimensionale (3D) epitheliale weefsels gedefinieerde geometrische midden van extracellulaire matrix ingenieur. Deze methode is vatbaar voor een grote verscheidenheid aan celtypen en experimentele contexten en zorgt voor high-throughput screening van identieke herhalingen.

Techniek Driedimensionale epitheelweefsels Embedded binnen extracellulaire matrix

Deze studie introduceert een protocol voor het meten van de microcirculatie in menselijke mondelinge mucosa tegen laser spikkel contrast denkbaar. Het toezicht op wondgenezing na vestibuloplasty gecombineerd met een prothese xenogene collageen wordt gepresenteerd op een klinisch geval.

Een nieuwe benadering voor het toezicht op Graft Neovascularization in de menselijke tandvlees

Het doel van dit protocol is om een dynamische co-cultuur van menselijke macrofagen en myofibroblasten in buisvormige elektrospunsteigers uit te voeren om materiaalgestuurde weefselregeneratie te onderzoeken, met behulp van een bioreactor die het ontkoppelen van schuifspanning en cyclische rek mogelijk maakt.

Een multi-cue bioreactor om de inflammatoire en regeneratieve capaciteit van biomaterialen onder flow en stretch te evalueren

Hier wordt een protocol gepresenteerd om gemanipuleerde bindweefsels te genereren voor een parallelle kweek van 48 weefsels in een multi-well plaat met dubbele polen, geschikt voor mechanistische studies, ziektemodellering en screeningstoepassingen. Het protocol is compatibel met fibroblasten van verschillende organen en soorten en wordt hier geïllustreerd met menselijke primaire cardiale fibroblasten.

Fibroblast afgeleide human engineered bindweefsel voor screeningstoepassingen

Hier beschrijven we de constructie van een basis driedimensionaal (3D) intestinale cellijnmodelsysteem en een paraffine-inbeddingsprotocol voor lichtmicroscopische evaluatie van vaste darmequivalenten. Kleuring van geselecteerde eiwitten maakt de analyse van meerdere visuele parameters van een enkel experiment mogelijk voor mogelijk gebruik in preklinische onderzoeken naar geneesmiddelen.

Basis driedimensionaal (3D) darmmodelsysteem met een immuuncomponent

Het huidige protocol schetst de toepassing van organotypische weefselmodellen voor het onderzoeken van gastheer-pathogeen interacties in vitro. Concreet maakt het beschreven modelsysteem gebruik van een meerlagig oraal epitheel dat wordt blootgesteld aan micro-organismen geassocieerd met biofilms (tandplak) in de context van mondgezondheid versus ziekte.

Organotypische weefselmodelsystemen voor het onderzoeken van gastheer-pathogeen interacties in vitro

Leer hoe je driedimensionale inflammatoire weefselmodellen van tandvlees bouwt met menselijke cellen in vitro. Deze methode ondersteunt onderzoek naar wondgenezing en weefselregeneratie bij parodontale aandoeningen.

Driedimensionale inflammatoire menselijk weefsel equivalenten van tandvlees

Meer video's verkennen