Name: Isolatie van mesenchymale stamcellen uit menselijke alveolaire beenvlies en effecten van vitamine D op Osteogenic activiteit van beenvlies-afgeleide cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Leer de isolatie van mesenchymale stamcellen uit alveolair beenvlies en het effect van vitamine D op osteogene differentiatie. Deze methode ondersteunt regeneratieve tandheelkundige therapieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het studie-protocol werd goedgekeurd door de institutionele Review Board voor klinisch onderzoek van Chang Gung Memorial Hospital (IRB99-1828B, 100-3019C 99-3814B, 102-1619C, 101-4728B en 103-4223C). Deze studie werd ondersteund door Chang Gung Memorial Hospital (CMRPG392071, CMRPG3A1141, CMRPG3A1142 en NMRPG3C0151). Dit manuscript werd uitgegeven door Wallace academische bewerken.

Het studie-protocol werd goedgekeurd door de institutionele Review Board van Chang Gung Memorial Hospital. Alle deelnemers verstrekt schriftelijke geïnformeerde toestemming.
1. de weefsels voorbereiding
<ol><li>Oogst de periosteal weefsels van patiënten tijdens tandheelkundige chirurgie (Figuur 1). Na de reflectie van de klep onder plaatselijke verdoving, een stuk van beenvlies weefsel van de alveolaire bot met behulp van een scheidingsteken voor periosteal31te nemen.</li>
	<li>Na de oogst, slaan de periosteal weefsels plakjes van ongeveer 5 mm × 2 mm in de Dulbecco fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) met 300 U/mL penicilline en 300 mg/mL streptomycine. Overdracht van de weefsels naar het laboratorium binnen de 24u.</li>
	<li>De fragmenten van de alveolaire periosteal weefsel met scalpels totdat goed gehakt en handhaven van de monsters in de passage 0 medium (bestaande uit 300 U/mL penicilline en 300 mg/mL streptomycine, α-MEM en 5% foetale runderserum [FBS]) gekweekt in een incubator bij 37 ° C met gehakt bevochtigde lucht (5% koolstofdioxide). In de incubator, een waterbassin om vochtigheid te bereiden.</li>
	<li>Wijzig het medium na 3 dagen en tweemaal per week daarna.</li>
	<li>Wanneer de cellen gekomen subconfluence (80%), laat de Adherente cellen met 200 µL van 0,25% trypsine in de incubator (37 ° C) gedurende 3 minuten en gebruik vervolgens 4.5 mL van medium tot beëindiging van de reactie.</li>
	<li>Plaat van de cellen opnieuw in verse passage 1 medium (α-MEM, 10% FBS, 100 eenheden/mL penicilline, en 100 μg/mL streptomycine). Plaat is 5 × 103 cellen (zoals geteld door een hemocytometer).</li>
	<li>Elke volgende passage uitvoeren nadat de cellen 80% samenvloeiing31 bereiken. Opmerking: In het begin kan het medium oranje rood. Na ongeveer drie dagen, moet de middellange kleur veranderen in een gelige tint. De verdubbeling tijd van de cellen is ongeveer 30-40 h, 7 dagen nodig voor 3 – 5 generaties.</li>
	<li>Cultuur de geïsoleerde PDC's in α-MEM aangevuld met 10% FBS, 100 U/mL penicilline, en 100 mg/mL streptomycine in een incubator (37 ° C, 5% CO2).</li>
	<li>Celgroei dagelijks observeren en het groeimedium tweemaal per week vervangen. Derde tot vijfde-generatie cellen gebruiken voor alle verdere experimenten.</li>
</ol>2. Stroom Cytometry
<ol><li>Oogst 1 × 106 cellen via de spijsvertering van de trypsine:<ol>
<li>Voeg 200 µL van 0,25% trypsine. Na 3 min kunt 4.5 mL kweekmedium dat FBS beëindigen van de reactie van trypsine en verzamelen door middel van centrifugeren (1500 rpm, 5 min, 22 ° C).</li>
		<li>Wassen van de cel pellets driemaal met 1 x DPBS. Resuspendeer de cellen in 200 µL 1 x permeabilization buffer. Telt de cellen met een hemocytometer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bestuderen van de geuite oppervlakte markers uitgedrukt voor de PDC's via stroom cytometry (fluorescentie-geactiveerde cel Sorteren)32. Gebruiken van monoclonal antilichamen (MAb) tegen CD19 (fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)), CD34 (FITC), CD44 (Phycoerythrin [PE]), CD45 (FITC), CD73 (PE), CD90 (allophycocyanin [APC]), CD146 (PE), STRO-1 (Alex) en HLA-DR (FITC)32.<ol>
<li>Voeg de antilichamen aan de monsters en de cultuur in het donker bij 4 ° C gedurende 30 minuten.</li>
		<li>Spoel de cellen met 1 x DPBS driemaal.</li>
		<li>De cellen met behulp van 2% formaldehyde bevestigen en doorgaan met stroom cytometry analyse32.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. cel bijlage en levensvatbaarheid met Osteogenic, Adipogenic, en Chondrogenic differentiatie
Differentiatie in de cellen te induceren osteogenic, adipogenic, en chondrogenic lineages door het kweken van de periosteal cellen in alle drie passages over zes-Wells-platen met specifieke differentiatie media.
<ol><li>Cultuur voor osteogenic differentiatie, de cellen in α-MEM bij een dichtheid van 5000 cellen per putje op zes-well cultuur platen.<ol>
<li>Cultuur op het bereiken van 80% samenvloeiing, de cellen in de media met α-MEM, 5% FBS, β-glycerophosphate (10 mM), 10−7 M dexamethason (0.1 mM), en 5 mL van ascorbinezuur (100 uM). De negatieve controle in media bestaande uit α-MEM en 5% cultuur FBS.</li>
		<li>Wijzig de media tweemaal per week.</li>
		<li>Na 4 weken, beoordelen van het potentieel van de cellen om te onderscheiden in een osteogenic afstamming door kleuring van de cellen met behulp van een von Kossa assay, die de aanwezigheid van kalkhoudend deposito's in een cultuur33onderscheidt.<ol>
<li>Voeg toe 10% formaline voor bevestiging. Binnen 30 min, voeg 5% zilvernitraat en behandelen onder ultraviolet (UV) licht gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
			<li>Toevoegen van 5% Na2zo4 vier keer, waardoor 3 min. voor elke reactie. Tot slot wassen de cellen tweemaal met gedestilleerd water. Opmerking: Von Kossa kleuring is een neerslag reactie waar zilver-ionen en fosfaat reageren in aanwezigheid van zuur materiaal; Deze kleuring techniek is niet specifiek voor calcium. In deze studie, wanneer de onderzochte cellen werden behandeld met zilvernitraat, oplossing, calcium — die wordt verminderd door de sterke UV-licht — werd vervangen door silver, die werd zichtbaar als behuizing van metallic zilver.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultuur voor differentiatie van de adipogenic, de cellen bij een dichtheid van 5000 cellen per putje op zes-well cultuur platen met α-MEM.<ol>
<li>Cultuur op het bereiken van 80% samenvloeiing, de cellen in de media met α-MEM 5% FBS, 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (100 mg/mL), 1% penicilline, 10−6 M dexamethason (1 mM), insuline (5 mg/mL) en indomethacin (60 mM).</li>
		<li>De negatieve controle in media bestaande uit α-MEM en 5% cultuur FBS.</li>
		<li>Na 6-9 weken, gebruik olie O van de rode vlek van de cellen te markeren lipide druppels, waardoor het bepalen van de aanwezigheid van adipogenic differentiatie33:<ol>
<li>Voeg toe 10% formaline voor bevestiging. Binnen 30 min, vlek de cellen met 0,5% olie rood O bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten en daarna wassen de cellen drie keer met 60% isopropanol gedurende 3 minuten elke keer; tot slot wassen de cellen met gedestilleerd water. Opmerking: Olie red O een lysochrome (vetoplosbare) diazo kleurstof gebruikt is voor de kleuring van neutrale lipiden, voornamelijk lipoproteïne, triacylglycerol en cholesterol esters. De kleurstof lost op in de lipide druppels in de cel, de lipide druppels rode draaien.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voor de differentiatie van de chondrocyten, cultuur cellen op zes-well cultuur platen met elk putje met 5000 cellen.<ol>
<li>Het toevoegen van een differentiatie middellange met α-MEM, 5% FBS, 10−7 M dexamethason (0.1 mM), natrium pyruvaat (100 µg/mL), insuline-transferrine-selenium-A (1 × ITS), transformerende groeifactor-β (10 ng/mL) en 5 mL van ascorbinezuur (100 µM).</li>
		<li>De negatieve controle in media bestaande uit α-MEM en 5% cultuur FBS.</li>
		<li>Gebruik Alcian blauw kleuring nadruk wordt gelegd op de zure polysacchariden, zoals glycosaminoglycanen of bepaalde soorten mucopolysacchariden, in het kraakbeen van de cellen om te bepalen van de aanwezigheid van chondrocyten differentiatie33na 4-5 weken.<ol>
<li>Voeg toe 10% formaline voor bevestiging. Binnen 30 min, voeg van 3% azijnzuur en laat 2 min voor de reactie. Daarna wassen met gedestilleerd water drie keer, 1% Alcian blauwe 8GX 30 min ge¨ uncubeerd toevoegen en daarna wassen met gedestilleerd water. Ten slotte voeg 3% azijnzuur en wassen gedurende 3 minuten, en daarna wassen met gedestilleerd water tot finish. Opmerking: De onderdelen van de cel dat specifiek door deze kleurstof worden blauw aan blauw-groene vlekken na kleuring en heten "alcianophilic."</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. effecten van 25-Dihydroxyvitamin D3 (1,25-(OH)2D3) op Osteogenesis
<ol><li>De P3 aan P5 PDC's opgesplitst in zes groepen en cultuur op 6-Wells-platen met verschillende kweekmedia:</li>
	<li>negatieve groep (α-MEM en 5% FBS);</li>
	<li>Vitamine C groep (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glycerophosphate en 10−7 M dexamethason + 100 uM vitamine C);</li>
	<li>en 10−7 M 1,25-(OH)2D groep3 (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glycerophosphate, en 10−7 M dexamethason + 10−7 M 1,25-(OH)2D3).</li>
	<li>Voeg 2 mL van het medium aan een incubator (37 ° C) in elk putje en wijzig het medium tweemaal per week.</li>
</ol>5. omgekeerde transcriptie/kwantitatieve Real-Time polymerasekettingreactie
<ol><li>Na 7 d osteoblast differentiatie, de totale RNA op ijs te isoleren met behulp van een commerciële reagens (Zie Tabel van materialen):<ol>
<li>Voeg 1 mL reagens isolatie aan elk putje. Voeg 200 µL van bromochloropropane en laat gedurende 10 minuten voor het genereren van gelaagde RNA en vervolgens Centrifugeer bij 10.000 rpm gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C.</li>
		<li>Na het centrifugeren, voeg toe 500 µL van 2-propanol aan 500 µL van het supernatant met RNA. Neerslaan van het RNA op het ijs en laat 15 min. voor de reactie.</li>
		<li>Na de ingreep, centrifugeer bij 12.000 rpm gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C, waarna het RNA gelegen aan de onderkant van de buis is. Vervolgens de bovendrijvende vloeistof verwijderen met behulp van 1 mL van 75% alcohol voor wassen en centrifugeer bij 7500 rpm voor 8 min in 4 ° C.</li>
		<li>Verwijder het supernatant en gebruik van een vacuüm concentrator te produceren van RNA vanaf de onderkant van de vloeistof. Herstellen met water.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Omgekeerde transcriberen het RNA (1 μg) met behulp van aviaire myeloblastosis virus reverse-transcriptase. Instellen van de polymerase-kettingreactie (PCR) om uit te voeren bij 25 ° C gedurende 10 minuten, gevolgd door 50 ° C voor 60 min en vervolgens 85 ° C gedurende 5 minuten, voordat eindelijk handhaven bij 4 ° C.</li>
	<li>Synthetiseren eerste fronten cDNA (cDNA). Uitvoeren van kwantitatieve PCR (qPCR) met 5 μL van 1:10 verdund cDNA. Kwantitatieve RT-PCR (qRT-PCR) voeren gebruikend inleidingen voor ALP, BSP, OCN, CBFA1 en collageen-1. Opmerking: DNA om besmetting te voorkomen door de signalen, de voorwaartse en omgekeerde sequenties van elke primer werden ontworpen op verschillende exons.</li>
	<li>Uitvoeren van qPCR met behulp van een commerciële PCR Master Mix (Zie Tabel van materialen) volgens instructies van de fabrikant. Instellen van de thermische cycler bij 50 ° C voor 2 min gevolgd door 95 ° C gedurende 10 minuten en vervolgens 40 cycli elk bij 95 ° C gedurende 15 s gevolgd door 60 ° C gedurende 60 s. Opmerking: Het SYBR-protocol vereist ook een smelt kromme fase, die wordt uitgevoerd bij 95 ° C gedurende 15 s, 60 ° C gedurende 60 s, waarna 95 ° C gedurende 15 s.</li>
	<li>Normaliseren van de cyclus-drempelwaarden voor ALP, BSP, CBFA1, collageen-1 en OCN met die van het huishouden gen GAPDH. 34
</li>
	<li>Primerparen staan in de Tabel van materialen.</li>
</ol>6. Alkalische fosfatase activiteit
<ol><li>Beoordelen van de ALP enzymactiviteit van de cellen met behulp van de eerder beschreven techniek35, die p- nitrofenyl fosfaat wordt omgezet in p- nitrofenol; p- nitrofenyl fosfaat is een fosfatase substraat dat kleur omslaat naar geel wanneer gedefosforyleerd door ALP, zoals bepaald bij een golflengte van 405 nm. Normaliseren van de totaal p- nitrofenol gevormd op basis van de totale proteïne, zoals bepaald door de analyse van Bradford.</li>
	<li>Vergelijk de ALP-activiteiten van het besturingselement (α-MEM, 5% FBS), vitamine C (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glycerophosphate, 10−7 M dexamethason + 100 uM vitamine C), 1,25-(OH)2D3 (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glycerophosphate, en 10−7 M Dexamethason + 10−8 M-1,25-(OH)-2D3), en vitamine C + 1,25-(OH)-2D3 (α-MEM, 5% FBS, 10 mM β-glycerophosphate, 10−7 M dexamethason + 100 uM vitamine C +1,25-(OH)2D3) groepen na 1, 2, 3 en 4 week van de cultuur.</li>
	<li>Een eiwit extractie procedure uitvoeren op ijs:<ol>
<li>Schrapen van de cellen van de 6-Wells-platen en voeg 50 µL van lysis buffer. Plaats vervolgens de cellen op het ijs voor 30 min te vernietigen de cellen en vrij van het eiwit.</li>
		<li>Na 30 min, centrifugeer bij 13000 rpm bij 4 ° C gedurende 15 minuten. Na het centrifugeren, pak het supernatant voor opslag en gebruik.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een onlangs ontwikkelde therapeutische modaliteit, namelijk weefsel engineering inhoudt MSCs, heeft tal van voordelen. MSCs, die in verschillende weefseltypes (HLA) aanwezig zijn, zijn Multipotente cellen die in een scala aan functionele mesodermal weefsel cellen37 onderscheiden kunnen en andere cellen zoals botcellen.
Het beenvlies fungeert als een niche voor voorlopercellen en als een rijke therapieën voorziening voor het bot omhult het38. In o...

Hoewel talrijke relevante technieken zijn ontwikkeld in de afgelopen jaren, bone wederopbouw blijft beperkt door meerdere beperkingen, en het schatten van dat de omvang van de noodzakelijke wederopbouw is vaak niet onmogelijk. Harde-weefsel augmentatie is vereist om zowel esthetische als functionele doelen naast een gunstige succestarief voor lange termijn te bereiken. Methoden gebruikte voor dergelijke procedures omvatten Autogeen en allogene bottransplantaat, xenografting en alloplastic bottransplantaat. Onder de verschillende soorten bottransplantatie, autogene bottransplantaten worden beschouwd als de meest effectieve. Donor site morbiditeit, gecompromitteerde vasculariteit en beperkte weefsel beschikbaarheid1 zijn echter belangrijke nadelen voor Autogeen bottransplantaat geweest. Daarnaast zijn allogene bottransplantaten en xenografts geassocieerd met de overdracht van de ziekte. Op dit moment worden synthetische bottransplantaten veel gebruikt deze problemen op te lossen. Echter, met hun gebrek aan osteogenic mogelijkheden, klinische resultaten hebben sterk uiteen. Materialen zoals cellulose zijn en gekoppeld volume schommelingen, infectie, een gebrek aan kracht.
De vergroting van het bot met behulp van weefselengineering heeft veel belangstelling gegenereerd. Bij deze techniek, zijn mesenchymale stamcellen (MSCs) in eerste instantie gebruikt om osteoblast differentiatie, die vervolgens op de site van botverlies om bot reparatie worden getransplanteerd. Deze procedure wordt momenteel toegepast in celtherapie. Het bereiken van botreconstructie door het extraheren van een beperkte hoeveelheid weefsel is eenvoudiger en minder invasieve vergeleken met andere methoden.
De potentiële rol van MSCs als een hulpmiddel voor cel-gebaseerde therapieën gericht op tandheelkundige regeneratie is een opkomende belangstelling diverse onderzoeksgroepen. Studies hebben bevestigd dat MSCs kunnen worden onderscheiden van de volgende soorten weefsel: beenmerg, obesitas, synoviale membraan, pericyte, trabecular bot, menselijke navelstreng en tandheelkundige weefsels2,3. Gemeenschappelijke bronnen van MSCs omvatten het beenmerg, vetweefsel en tandheelkundige weefsels. Vergeleken met MSCs afgeleid van vetweefsel en het beenmerg, zijn de voordelen van tandheelkundige stamcellen gemakkelijke toegankelijkheid en minder morbiditeit na de oogst. Vergeleken met embryonale stamcellen, MSCs afgeleid van tandheelkundige weefsel nonimmunogenic verschijnen en niet zijn gekoppeld aan complexe ethische bezwaren3.
In 2006, de International Society for cellulaire therapie aanbevolen met behulp van de volgende normen te identificeren MSCs: ten eerste MSCs moet kunnen koppelen aan kunststof. Ten tweede, MSCs moet voor de oppervlakte antigenen, CD105, CD73 en CD90 positief en negatief voor de markeringen voor de B-cellen naast de hematopoietische antigenen CD45 en de CD344, monocyten en macrofagen. Als laatste criterium moet MSCs bekwaam om te onderscheiden in de volgende drie soorten cellen onder standaardvoorwaarden van in vitro differentiatie: botcellen, adipocytes en chondrocyten4. Tot op heden zijn zes soorten menselijke tandheelkundige stamcellen geïsoleerd en gekenmerkt. Het eerste type werd geïsoleerd uit menselijke pulp weefsel en postnatale tandmerg stamcellen5genoemd. Vervolgens drie aanvullende soorten tandheelkundige MSCs zijn geïsoleerd en gekenmerkt: stamcellen uit geëxpandeerd melkgebit6, de parodontale ligament7en de apicale Papil8. Meer recentelijk, tandheelkundige follikel afkomstige9, gingival weefsel afkomstige10en tandheelkundige bud stam cells(DBSCs)11periapical cyste MSCs (hPCy-MSCs)12 ook geconstateerd.
Nikolai was de eerste om te definiëren MSCs13. MSCs vertonen een potentiële hoge proliferatie en kunnen worden gemanipuleerd zodat u kunt onderscheiden voordat wordt getransplanteerd, die doen vermoeden dat zij ideale kandidaten voor regeneratieve procedures10 zijn.
Hoewel de meeste studies hebben het beenmerg gebruikt als een bron van stamcellen, beenvlies-afgeleide cellen (PDC's) zijn ook onlangs14gebruikt. Het beenvlies is meer bereikbaar dan het beenmerg is. Daarom in deze techniek gebruiken we alveolaire beenvlies elimineren de noodzaak voor extra incisies tijdens de operatie en het verminderen van postoperatieve morbiditeit bij patiënten. Het beenvlies is het bindweefsel die de buitenste bekleding van lange beenderen vormt en bestaat uit twee afzonderlijke lagen: de buitenste vezelige laag bestaat uit fibroblasten, collageen en elastische vezels15en de innerlijke cel-rijke cambium laag in rechtstreeks contact met het oppervlak van bot. De cambium-laag bevat een gemengde celpopulatie, voornamelijk fibroblasten16, botcellen17, pericytes18en een kritische subpopulatie geïdentificeerd als MSCs19,20,21. De meeste studies hebben gemeld dat PDC's vergelijkbaar zijn, zo niet superieur, aan het beenmerg-afgeleide cellen van de stam (bMSCs) in bone genezing en regeneratie22,23,24. Het beenvlies is gemakkelijk bereikbaar en uitstekende regeneratieve effectiviteit vertoont. Enkele studies hebben echter gericht op het beenvlies25,26,27.
Met betrekking tot bot reparatie houdt de huidige klinische praktijk de transplantatie van periosteal voorlopercellen versterkt binnen ondersteunende steigers. Recente studies hebben gericht op het verwerven van stamcellen gebreken regio en voorlopercellen voor weefsels regeneratie20in dienst. Tandartsen is ook anticiperen op toekomstige toepassing van parodontale bot regeneratie in parodontale behandelingen en implantaten. Met betrekking tot de donor-site, kan het beenvlies gemakkelijk worden geoogst door algemene tandheelkundige chirurgen. Dit steekt gunstig tegen beenmerg stromale cellen, zoals het beenvlies bereikbaar tijdens routinematige mondelinge chirurgie. Dus, het doel van deze studie is om een protocol voor het oogsten van PDC's en om te beoordelen van de morfologie, bijlage, levensvatbaarheid en proliferatie van cellen van de stam van het menselijke beenvlies.
Vitamine D metabolieten van invloed zijn op de in vivo bot-mineraal dynamisch evenwicht. Één studie gemeld dat de 24R,25-(OH)-2D3 actieve vorm van vitamine D essentieel voor de osteoblastic differentiatie van menselijke MSCs (hMSCs)28 is. Bot homeostase en reparatie worden geregeld door een netwerk van vitamine D3 metabolieten, van welke 1,25-(OH)2D3 (calcitriol) de meest biologisch actieve en betrokken bij de regulering van de gezondheid van het been is. Vitamine D3 is essentieel voor verkalking29. In een studie met behulp van 2-d-oude Kunming witte muizen, de embryoid lichamen in de muizen aangegeven dat vitamine C en vitamine D supplementen effectief bevorderd de differentiatie van ESC-afgeleide botcellen30. Onder zijn andere biologische activiteit stimuleert 1,25-(OH)2D3 de in vitro differentiatie van hMSCs naar botcellen, die kunnen worden gecontroleerd op basis van de toename in alkalisch fosfatase (ALP) enzymactiviteit of OCN gen expressie.
Enkele studies hebben ontdekt een dosis-respons relatie van gecombineerde behandelingen met vitamine C en 1,25-(OH)2D3 in menselijke PDC's met een bijzondere focus op bot weefselengineering. Daarom in deze studie onderzoeken we de optimale concentratie voor afzonderlijke of gecombineerde behandeling van 1,25-(OH)2D3 en vitamine C voor inducerende osteogenic differentiatie van menselijke PDC's. Het doel van dit protocol is te bepalen of een celpopulatie geïsoleerd van de tandheelkundige alveolaire beenvlies cellen met een MSC fenotype en of deze cellen kunnen worden in cultuur (in vitro) uitgebreid en gedifferentieerd bevat tot het gewenste weefsel . Daarnaast evalueren we het vermogen van PDC's te differentiëren in osteocytes, chondrocyten en adipocytes. Het tweede deel van de studie evalueert de effecten van vitamine C en 10−10, 10−910−8en 10−7 M 1,25-(OH)2D3 op de osteogenic activiteit van PDC's. Het primaire doel van deze studie is om te beoordelen van de functies van vitamine C en 1,25-(OH)2D3 tijdens de osteoblastic differentiatie van PDC's door ALP activiteit, en pro-osteogenic genen, zoals ALP, collageen-1, OCN, BSP en CBFA1. Bovendien, bepaalt deze studie de osteo-inductief optimale voorwaarden voor menselijke PDC's op basis van deze bevindingen.

<table><tbody><tr><td>0.25% trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>2-fosfo-L-ascorbinezuurtrisodiumzout</td><td>Sigma</td><td>49752</td><td></td></tr><tr><td>35-mm kweekschalen</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>6&nbsp; welp plate</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Alkaline fosfatase</td><td>ABI</td><td>Hs01029144_m1</td><td></td></tr><tr><td>Alkaline Fosfatase Activiteit Colorimetrische Assay Kit</td><td>BioVision</td><td>K412-500</td><td></td></tr><tr><td>aviaire myeloblastose virus reverse transcriptase</td><td>Roche</td><td>10109118001</td><td></td></tr><tr><td>CD146</td><td>BD</td><td>561013</td><td></td></tr><tr><td>CD19</td><td>BD</td><td>560994</td><td></td></tr><tr><td>CD34</td><td>BD</td><td>560942</td><td></td></tr><tr><td>CD44</td><td>BD</td><td>561858</td><td></td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD</td><td>561088</td><td></td></tr><tr><td>CD73</td><td>BD</td><td>561014</td><td></td></tr><tr><td>CD90</td><td>BD</td><td>561974</td><td></td></tr><tr><td>Cell banker1</td><td>ZEAOAQ</td><td>11888</td><td></td></tr><tr><td>core binding factor alpha-1</td><td>ABI</td><td>Hs00231692_m1</td><td></td></tr><tr><td>dexamethason</td><td>Sigma</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>ABI</td><td>Hs99999905_m1</td><td></td></tr><tr><td>HLA-DR</td><td>BD</td><td>562008</td><td></td></tr><tr><td>indomethacine</td><td>Sigma</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>insulin</td><td>sigma</td><td>91077C</td><td></td></tr><tr><td>insulin&ndash;transferrin&ndash;selenium-A</td><td>Sigma</td><td>I1884</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Fast 96 welp reactieplaat (0.1ml)</td><td>Life</td><td>4346907</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp optische kleeffolie</td><td>Life</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium 1X Alpha Modificatie</td><td>HyClone</td><td>SH30265.02</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Permeabilisatie buffer</td><td>eBioscience</td><td>00-8333-56</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>STRO-1</td><td>BioLegend</td><td>340103</td><td></td></tr><tr><td>SYBER Green PCR Master Mix</td><td>AppliedBiosystems</td><td>4309155</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Master Mix</td><td>Life</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>transformatie-groeifactor-&beta;</td><td>Sigma</td><td>T7039&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trizol reagens (voor RNA-isolatie)</td><td>Life</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glycerofosfaat</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>collageen-1</td><td>Invitrogen</td><td>forward primer 5' CCTCAAGGGCTCCAACGAG-3 reverse primer 5'-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3'</td><td></td></tr><tr><td>OCN</td><td>Invitrogen</td><td>forward primer 5'-GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG-3' reverse primer 5'-GTCAGCCAACTCGTCACAGT-3'</td><td></td></tr><tr><td>BSP</td><td>Invitrogen</td><td>forward primer 5' AAAGTGAGAACGGGGAACCT-3' reverse primer 5'-GATGCAAAGCCAGAATGGAT-3'</td><td></td></tr><tr><td>Commerciële ALP-primers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Commerciële CBFA1-primers</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie van mesenchymale stamcellen uit menselijke alveolaire beenvlies en effecten van vitamine d op osteogenic activiteit van beenvlies-afgeleide cellen

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymale stamcellen (MSCs) zijn aanwezig in een aantal weefsels en kan worden onderscheiden in vele celtypes, met inbegrip van botcellen. Onder de dental bronnen van MSCs is het beenvlies een gemakkelijk toegankelijke weefsel, dat MSCs bevatten in het cambium laag is geconstateerd. Echter, deze bron is niet nog veel onderzocht.
Vitamine D3 en 1,25-(OH)2D3 hebben aangetoond dat het stimuleren van in vitro differentiatie van MSCs in botcellen. Daarnaast is vitamine C vergemakkelijkt collageen vorming en bot celgroei. Geen enkele studie heeft echter nog onderzocht de effecten van vitamine D3 en vitamine C op MSCs.
Hier presenteren we een methode voor het isoleren van MSCs van menselijke alveolaire beenvlies en onderzoeken van de hypothese dat 1,25-(OH)2D3 een osteo-inductief effect op deze cellen kunnen uitoefenen. Wij onderzoeken de aanwezigheid van MSCs in de menselijke alveolaire beenvlies en evalueren van de hechting van de cel van de stam en proliferatie. Ter beoordeling van het vermogen van vitamine C (als een besturingselement) en verschillende concentraties van 1,25-(OH)2D3 (10−10, 10−910−8en 10−7 M) te wijzigen van belangrijke mRNA biomarkers in geïsoleerde MSCs mRNA uitdrukking van alkalische fosfatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core bindende factor alpha-1 (CBFA1), collageen-1 en osteocalcin (OCN) worden gemeten met behulp van real-time polymerasekettingreactie (RT-PCR).

Voor alle kwantitatieve tests, worden de gegevens gepresenteerd als gemiddelde ± standaardafwijking (SD). Alle statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van de Student t-test. In totaal werden 34 monsters verkregen met een gemiddelde deelnemer leeftijd van 48,1 ± 12.3 y. elf van deze monsters werden verkregen van de mannelijke patiënten en 23 van de vrouwelijke patiënten. Achtentwintig monsters werden verkregen van de molaire regio's en zes uit de voorste regio's; 26 wer...

We presenteren een protocol om te onderzoeken het mRNA uitdrukking biomarkers voor beenvlies-afgeleide cellen (PDC's) geïnduceerd door vitamine C (vitamine C) en 1,25-dihydroxy vitamine D [1,25-(OH)2D3]. Daarnaast evalueren we het vermogen van PDC's te differentiëren in osteocytes, chondrocyten en adipocytes.

Isolatie van mesenchymale stamcellen uit menselijke alveolaire beenvlies en effecten van vitamine D op Osteogenic activiteit van beenvlies-afgeleide cellen

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Het algemene doel van dit onderzoek is om de osteo-inducerende effecten van Vitamine D op gekweekte mesenchymatische stamcellen te onderzoeken die zijn geoogst uit het alveolare periost van het tandvlees. Het gebruik van mesenchymatische stamcellen is de afgelopen tien jaar een grote vooruitgang geweest in de tandheelkunde. Ze zijn met succes geïsoleerd en gekweekt uit veel delen van tandweefsel.Het doel is echter om mesenchymatische stamcellen uit het alveolare periost te isoleren en te kweken en het osteo-inducerende potentieel van een Vitamine D-verbinding te onderzoeken. Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn in deze materie het moeilijk vinden vanwege het nieuwe idee van botvorming in mesenchymatische stamcellen afkomstig van het alveolare periost. De demonstratie van de procedure door het laboratoriumpersoneel zal worden uitgevoerd door Miss Hsin-Wen Chi.Zij is een onderzoeksassistent uit mijn laboratorium. Om te beginnen, oogst de periostale weefsels van patiënten tijdens tandheelkundige operaties met behulp van een periostale scheider. Verzamel plakjes van ongeveer twee bij vijf millimeter.Bewaar de weefselschijfjes in DPBS met antibiotica. In het lab, gebruik een scalpel om de fragmenten van het alveolare periostale weefsel binnen 24 uur na de oogst grondig te hakken. Vervolgens, kweek het weefsel op 35 millimeter petrischalen in het geschikte kweekmedium.Gebruik een bevochtigde 37 graden Celsius incubator met 5% koolstofdioxidegas. Drie dagen later, gooi de verzamelde periostale weefsels weg en ververs het medium. Wanneer de cellen zijn geprolifereerd tot ongeveer 80% confluentie, los de gekweekte cellen los door trypsine toe te voegen.En incubeer de kweek gedurende drie minuten. Hierna, voeg 0,8 milliliter medium toe om de loslating te beëindigen. Na het verzamelen en tellen, verdeel 5.000 cellen in één milliliter per schaal.Markeer de beplaatste cellen als passage één in dit stadium. Kweek deze cellen en scheid ze opnieuw nadat ze tot 80% confluentie zijn geprolifereerd. Het medium met passage één is aanvankelijk oranje/rood van kleur.Wanneer het medium drie dagen later begint te verkleuren, ververs het. Wanneer de cellen van passage één 80% confluentie bereiken, creëer de tweede tot vijfde generatie cellen door dezelfde procedures te herhalen die zijn gebruikt om de nulgeneratie tot de eerste generatie voor te bereiden. Ververs het medium twee keer per week.Vier weken later, beoordeel het potentieel van de cellen om zich te differentiëren in een osteogene lijn door de morfologie van de cellen onder een microscoop te observeren. Stem de cellen met behulp van een von Kossa-test. Deze test onderscheidt de aanwezigheid van verkalkte afzettingen in uw kweek.Was de cellen met PBS en fixeer ze gedurende 30 minuten in één milliliter 10% Formaline. Verwijder daarna de Formaline en was vervolgens de cellen en behandel ze met 5% zilvernitraat. Stel de cellen één uur lang bloot aan UV-licht.Vervolgens verwijdert u het zilvernitraat en behandel de cellen met twee milliliter 5% natriumsulfaat vier keer gedurende drie minuten per keer. Vervang de oplossing tussen de behandelingen. Was tenslotte de cellen twee keer met gedistilleerd water.20 van de 34 periostale weefselmonsters leverden met succes beenmerg-afgeleide stamcelkolonies op. Er werden geen factoren met betrekking tot de donoren gevonden die de kweeksucces aanzienlijk beïnvloedden. Aanvankelijk vormden PDC's kolonies en sferische clusters met een mix van ronde en spindelvormige cellen.Na de eerste passage waren de cellen homogeen fibroblast-achtig met een spindelvorm. Aan het einde van de osteogene differentiatie, gaf de von Kossa-test de mogelijke aanwezigheid van calciumafzettingen en osteogene differentiatie aan. Deze resultaten geven sterk aan dat onder periostale celpopulaties, voorlopercellen het potentieel hebben om zich te differentiëren in osteogene cellen.De osteogene voorlopercellen werden ook behandeld met Calcitriol en onderzocht met behulp van RTPCR om de expressieniveaus van alkalische fosfatase te beoordelen, wat een sterke indicator is voor vroege osteogene differentiatie van cellen. Zowel de behandeling met vitamine C als Calcitriol, een actief metaboliet van vitamine D, verhoogden de expressie van alkalische fosfatase. Ook verhoogden de expressieniveaus van collageen één mRNA als reactie op dezelfde behandelingen.De expressie van bot-sialoproteïne-mRNA werd gevonden om te toenemen voor de cellen die werden behandeld met een hogere concentratie Calcitriol. Echter, CBFA één en ostocalcium-mRNA-expressie reageerden niet op de behandelingen. Na het bekijken van deze video, zou het publiek een goed begrip moeten hebben van de mineralisatie en het kweekprotocol van menselijk alveolare periost.Eenmaal onder de knie, kan deze zoektocht in vier tot vijf weken worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van dit experiment is het belangrijk om een zorgvuldige en steriele techniek te gebruiken om besmetting van cellen te voorkomen.

isolation-mesenchymal-stem-cells-from-human-alveolar-periosteum

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Rat MSC's werden geïsoleerd uit dijbeen en dij-en vervolgens verrijkt door magnetische celsortering. Gesorteerde cellen werden bevestigd voor de expressie van de oppervlakte markers door flowcytometrie. Deze cellen werden ook gekweekt in klonale dichtheid aan enkele kolonies vormen en vervolgens deze kolonies werden van elkaar gescheiden door het klonen van cilinders.

Isolatie en Verrijking van Rat mesenchymale stamcellen (MSC&#39;s) en de scheiding van Single-kolonie Derived MSC&#39;s

De werkwijze beschreven isolatie en karakterisering van menselijke pulpa stamcellen (hDPSCs) door...

Isolatie, karakterisering en vergelijkende differentiatie van humane Dental Pulp stamcellen uit permanente tanden met behulp van twee verschillende methoden

Mesenchymale stamcellen (MSC's) hebben een differentiatiepotentieel naar de osteoblastische lijn wanneer ze worden gestimuleerd met oplosbare factoren of specifieke biomaterialen. Dit werk presenteert een nieuwe optie voor de aflevering van MSC's uit menselijk amnionmembraan (AM-hMSC's) die de boviene botmatrix Nukbone (NKB) gebruikt als een scaffold.

Isolatie van menselijke mesenchymale stamcellen en hun kweek op de poreuze botmatrix

De transcriptionele heterogeniteit binnen humane adipogeen-afgeleide stromale cellen kan op enkelcellig niveau worden gedefinieerd met behulp van celoppervlaktemarkers en osteogene genen. We beschrijven een protocol dat flowcytometrie gebruikt voor de isolatie van celsubpopulaties met verhoogd osteogeen potentieel, die kunnen worden gebruikt om craniofaciale skeletreconstructie te verbeteren.

Isolatie en Verrijking van Human Adipose-afgeleide stromale cellen voor Enhanced Osteogenesis

Dit artikel presenteert een methode die volledige beenmergaanhechting en flowcytometriesortering combineert voor het isoleren, cultiveren, sorteren en identificeren van beenmerg mesenchymale stamcellen uit rattenkaken.

Isolatie en teelt van mandibulaire beenmerg mesenchymale stamcellen bij ratten

Dit artikel biedt een stapsgewijze handleiding voor het opzetten van een primaire cultuur van stamcellen van tandpulp met behulp van de explantatiecultuurmethode en karakterisering van deze cellen op basis van ICSCRT-richtlijnen. De cellen die door dit protocol worden geïsoleerd, kunnen worden beschouwd als mesenchymale stamcellen voor verdere toepassingen.

Primaire cultuur van stamcellen van tandpulpa

Mesenchymale stamcellen uit het beenmerg van de kaak hebben belangrijke functies bij diverse differentiatie, zelfvernieuwing en immuunmodulatie. Ze zijn naar voren gekomen als een cruciaal reservoir van voorlopercellen in gentherapie, weefselmanipulatie en regeneratieve geneeskunde. Hier presenteren we een unieke methode voor het isoleren van mesenchymale stamcellen van kaakbeenmerg bij ratten.

Techniek voor isolatie en kweek van mesenchymale stamcellen van rattenkaakbeenmerg

Deze studie presenteert een unieke stompe dissectieprocedure om de integriteit van Wharton's jelly (WJ) te behouden, wat resulteert in minder beschadigde WJ en een grotere hoeveelheid en levensvatbaarheid van de geoogste mesenchymale stamcellen (MSC's). De methode vertoont een superieure opbrengst en proliferatief vermogen in vergelijking met conventionele methoden voor scherpe dissectie.

Isolatie van van de navelstreng afgeleide mesenchymale stamcellen met hoge opbrengsten en lage schade

Circulerende tumorcellen worden geïsoleerd uit het bloed van patiënten met kanker kan brengen zonder dat cellulaire schade. Isolatie van tumorcellen vindt plaats via een bimoleculaire oppervlak van E-selectine naast antilichamen tegen epitheliale markers. Een nanobuis coating bevordert specifiek kankercellen hechting resulteert in een hoge capture zuiverheden.

Snelle Isolatie van Viable circulerende tumorcellen van de patiënt Blood Samples

Dit protocol beschrijft de ontwikkeling, groei en in vivo beeldvorming van NK cellen uit hESCs en iPSCs.

Ontwikkeling, uitbreiding en<em&gt; In vivo</em&gt; Controle van Human NK cellen uit menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) en en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs)

Leer de isolatie van mesenchymale stamcellen uit alveolair beenvlies en het effect van vitamine D op osteogene differentiatie. Deze methode ondersteunt regeneratieve tandheelkundige therapieën.

Isolatie van mesenchymale stamcellen uit menselijke alveolaire beenvlies en effecten van vitamine D op Osteogenic activiteit van beenvlies-afgeleide cellen (Video) | JoVE Journal

Isolatie van mesenchymale stamcellen uit menselijke alveolaire beenvlies en effecten van vitamine D op Osteogenic activiteit van beenvlies-afgeleide cellen

Meer video's verkennen