Isolatie van mesenchymale stamcellen uit menselijke alveolaire beenvlies en effecten van vitamine D op Osteogenic activiteit van beenvlies-afgeleide cellen

Het algemene doel van dit onderzoek is om de osteo-inducerende effecten van Vitamine D op gekweekte mesenchymatische stamcellen te onderzoeken die zijn geoogst uit het alveolare periost van het tandvlees. Het gebruik van mesenchymatische stamcellen is de afgelopen tien jaar een grote vooruitgang geweest in de tandheelkunde. Ze zijn met succes geïsoleerd en gekweekt uit veel delen van tandweefsel.

Het doel is echter om mesenchymatische stamcellen uit het alveolare periost te isoleren en te kweken en het osteo-inducerende potentieel van een Vitamine D-verbinding te onderzoeken. Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn in deze materie het moeilijk vinden vanwege het nieuwe idee van botvorming in mesenchymatische stamcellen afkomstig van het alveolare periost. De demonstratie van de procedure door het laboratoriumpersoneel zal worden uitgevoerd door Miss Hsin-Wen Chi.

Zij is een onderzoeksassistent uit mijn laboratorium. Om te beginnen, oogst de periostale weefsels van patiënten tijdens tandheelkundige operaties met behulp van een periostale scheider. Verzamel plakjes van ongeveer twee bij vijf millimeter.

Bewaar de weefselschijfjes in DPBS met antibiotica. In het lab, gebruik een scalpel om de fragmenten van het alveolare periostale weefsel binnen 24 uur na de oogst grondig te hakken. Vervolgens, kweek het weefsel op 35 millimeter petrischalen in het geschikte kweekmedium.

Gebruik een bevochtigde 37 graden Celsius incubator met 5% koolstofdioxidegas. Drie dagen later, gooi de verzamelde periostale weefsels weg en ververs het medium. Wanneer de cellen zijn geprolifereerd tot ongeveer 80% confluentie, los de gekweekte cellen los door trypsine toe te voegen.

En incubeer de kweek gedurende drie minuten. Hierna, voeg 0,8 milliliter medium toe om de loslating te beëindigen. Na het verzamelen en tellen, verdeel 5.000 cellen in één milliliter per schaal.

Markeer de beplaatste cellen als passage één in dit stadium. Kweek deze cellen en scheid ze opnieuw nadat ze tot 80% confluentie zijn geprolifereerd. Het medium met passage één is aanvankelijk oranje/rood van kleur.

Wanneer het medium drie dagen later begint te verkleuren, ververs het. Wanneer de cellen van passage één 80% confluentie bereiken, creëer de tweede tot vijfde generatie cellen door dezelfde procedures te herhalen die zijn gebruikt om de nulgeneratie tot de eerste generatie voor te bereiden. Ververs het medium twee keer per week.

Vier weken later, beoordeel het potentieel van de cellen om zich te differentiëren in een osteogene lijn door de morfologie van de cellen onder een microscoop te observeren. Stem de cellen met behulp van een von Kossa-test. Deze test onderscheidt de aanwezigheid van verkalkte afzettingen in uw kweek.

Was de cellen met PBS en fixeer ze gedurende 30 minuten in één milliliter 10% Formaline. Verwijder daarna de Formaline en was vervolgens de cellen en behandel ze met 5% zilvernitraat. Stel de cellen één uur lang bloot aan UV-licht.

Vervolgens verwijdert u het zilvernitraat en behandel de cellen met twee milliliter 5% natriumsulfaat vier keer gedurende drie minuten per keer. Vervang de oplossing tussen de behandelingen. Was tenslotte de cellen twee keer met gedistilleerd water.

20 van de 34 periostale weefselmonsters leverden met succes beenmerg-afgeleide stamcelkolonies op. Er werden geen factoren met betrekking tot de donoren gevonden die de kweeksucces aanzienlijk beïnvloedden. Aanvankelijk vormden PDC's kolonies en sferische clusters met een mix van ronde en spindelvormige cellen.

Na de eerste passage waren de cellen homogeen fibroblast-achtig met een spindelvorm. Aan het einde van de osteogene differentiatie, gaf de von Kossa-test de mogelijke aanwezigheid van calciumafzettingen en osteogene differentiatie aan. Deze resultaten geven sterk aan dat onder periostale celpopulaties, voorlopercellen het potentieel hebben om zich te differentiëren in osteogene cellen.

De osteogene voorlopercellen werden ook behandeld met Calcitriol en onderzocht met behulp van RTPCR om de expressieniveaus van alkalische fosfatase te beoordelen, wat een sterke indicator is voor vroege osteogene differentiatie van cellen. Zowel de behandeling met vitamine C als Calcitriol, een actief metaboliet van vitamine D, verhoogden de expressie van alkalische fosfatase. Ook verhoogden de expressieniveaus van collageen één mRNA als reactie op dezelfde behandelingen.

De expressie van bot-sialoproteïne-mRNA werd gevonden om te toenemen voor de cellen die werden behandeld met een hogere concentratie Calcitriol. Echter, CBFA één en ostocalcium-mRNA-expressie reageerden niet op de behandelingen. Na het bekijken van deze video, zou het publiek een goed begrip moeten hebben van de mineralisatie en het kweekprotocol van menselijk alveolare periost.

Eenmaal onder de knie, kan deze zoektocht in vier tot vijf weken worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van dit experiment is het belangrijk om een zorgvuldige en steriele techniek te gebruiken om besmetting van cellen te voorkomen.