Name: Chemische amputatie en regeneratie van de keelholte in de Planarian Schmidtea mediterranea (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Leer een methode voor chemische amputatie van de keelholte in planaria Schmidtea mediterranea met natriumazide. Deze techniek onderzoekt stamcelgedrag en regeneratieprocessen zonder andere organen te beschadigen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zouden graag bedanken Alejandro Sánchez Alvarado, die zich aansluit bij de eerste optimalisatie en de ontwikkeling van deze techniek. Werk in Carolyn Adler van laboratorium wordt ondersteund door Cornell University start-up middelen.

1. voorbereiding
<ol><li>
Bereiding van planaria water 17<ol>
<li>Het handhaven van planarians in een 1 X Montjuïc zout oplossing. Zorg om te bereiden planarian water, individuele voorraadoplossingen van 1 M CaCl2, 1 M MgSO4, 1 M MgCl2, 1 M KCl en 5 M NaCl in ultrazuiver water. Filter-steriliseren met een fles-top filterfor langetermijnopslag van 0,2 µm. Opmerking: Gebruik alleen ultrazuiver gedeïoniseerd water (met een soortelijke weerstand van 18.2 MΩ bij 25 ° C) te bereiden Montjuïc zouten.</li>
		<li>Ter voorbereiding van een voorraad van 1 L van 5 X zoutoplossing, 5 mL van de 1 M CaCl2, 5 mL van de 1 M MgSO4, 0,5 mL van MgCl2, 0,5 mL KCl en 1.6 mL 5 M NaCl oplossingen in 900 mL ultrazuiver water te combineren. Voor deze oplossing, Voeg 0.504 g van NaHCO3 en roer te mengen. Breng de pH op 7.0 met zoutzuur.</li>
		<li>Verdun deze 5 X stockoplossing op een 1 X werken concentratie in ultrazuiver water in een steriele container zoals een grote capaciteit mandfles (Zie de Tabel van de materialen). Gebruik deze 1 X oplossing voor het behoud van ongeslachtelijke planarians. Opmerking: Als alternatief voor zout oplossing van Montjuïc, lokaal gekocht bronwater of ultrazuiver water met een commercieel beschikbare aquarium zout te gebruiken (Zie Tabel van materialen) mengen om een concentratie of0.5 g/L18.</li>
		<li>Handhaven om te voorkomen dat een bacteriële infectie in statische cultuur19, planarians in water met een antibioticum. Een 50 mg/mL stockoplossing van gentamicine sulfaat in ultrazuiver water bereiden en filter-steriliseren. Toevoegen aan containers waarin dieren worden onderhouden, gentamicine sulfaat om een eindconcentratie van 50 µg Mo/mL (1:1000 verdunning).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van lever plakken
	<ol>
<li>Zoals planarians op een dieet van biologische gedijen, gras-gevoerd rundvlees lever, koop verse lever en proces binnen 24 h. de membraanachtig capsule inkapselen van de lever door het peeling uit voorzichtig verwijderen. Snijd de lever in ~ 1 cm blokjes, en gebruik een mes om schraap en alle hepatische aders en slagaders negeren.</li>
		<li>Lever stukken met behulp van een voedsel molen of een keukenmachine maceraat en sturen de taak door een zeef met draad mazen voedsel. Combineer in gebak zakken, en afzien in spuiten of 35-mm petrischalen. Voorafgaand aan het voederen van dieren, centrifugeren zachtjes om luchtbellen te verwijderen.</li>
		<li>Opslaan aliquots van lever bij-80 ° C gedurende maximaal een jaar en de dooi voorafgaand aan het gebruiken. Na het ontdooien, opnieuw bevriezen alle overgebleven lever eenmaal of bewaren bij 4 ° C gedurende maximaal 24 uur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Onderhoud van dieren
	<ol>
<li>Planarians zal groeien en verschrompelen voor verschillende maten, afhankelijk van de frequentie van de voeding. Feed planarians om de andere week (eenmaal elke 14 dagen). Gebruik voor lange termijn bulk culturen, plastic verpakkingen van verschillende grootte (Zie Tabel van materialen).</li>
		<li>Gebruik een metalen spatel of kunststof overdracht Pipetteer om een daling van de erwt-grootte van de lever in een doos om het voederen van dieren. Toestaan dat dieren te eten voor 1-2 h. verwijderen resterende voedsel voor het reinigen van het vak.</li>
		<li>Schoon wormen tweemaal per week als gevoed (eenmaal direct na de voeding en eens twee dagen later), of eenmaal per week, zo niet gevoed. Om te reinigen, afvoer water in een bekerglas van kunststof door zorgvuldig uit het water te gieten met behoud van planarians in het vak. Vak Navegen met een papieren handdoek en herhaal vervolgens aan alle zijden totdat het vak schoon is.</li>
		<li>Vervang water (tot ongeveer ¾ van het vak volume) en gentamicine toevoegen om een eindconcentratie van 50 µg/mL. Dieren in een donkere kast of in een incubator van 20 ° C worden opgeslagen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Selectie van worms
	<ol>
<li>Selecteer wormen die 5-7 dagen voorafgaande werden gevoed. Opmerking: Het is aanzienlijk moeilijker te amputeren pharynges van wormen die zijn gevoederd onlangs (1-2 dagen voorafgaand aan de amputatie). Fed dieren zijn ook gevoeliger voor natriumazide.</li>
		<li>Selecteer wormen die ongeveer 6 mm lengte zijn. Als u wilt schatten van de omvang van de worm, overbrengen naar een petrischaal met behulp van een precisiepipet kunststof overdracht. Plaats een platte 6 - in-liniaal of 5 x 5 mm-ruitjespapier onder de petrischaal en de worm lengte gemeten terwijl het kruipt. Opmerking: Wormen kleiner is dan 6 mm in lengte zijn moeilijker te amputeren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van natriumazide
	<ol>
<li>Bereid een 100 mM-oplossing door het oplossen van natrium azide poeder in planaria water. Let op: Natriumazide is giftig en voorzichtig moet worden omgegaan. Gooi niet natriumazide in de afvoer. Na gebruik, verzamelen het afzonderlijk voor verwijdering als gevaarlijk afval.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. de farynx amputatie
<ol><li>Plaats wormen in een 35-mm diameter petrischaal. Verwijder voorzichtig alle planarian water van de schotel met behulp van een pipet kunststof overdracht. Opmerking: Een maximum van 20 6-mm wormen kan comfortabel worden ondergebracht in een schotel van deze omvang.</li>
	<li>Zet de schotel onder de Microscoop en vergroting aanpassen zodat meerdere wormen kunnen gelijktijdig worden weergegeven (bijvoorbeeld 10 X vergroting). Planarian water vervangen door 100 mM natrium azide oplossing. Opmerking: Voor een 35-mm petrischaal volstaat ongeveer 5 mL natriumazide. De oplossing moet volledig onderdompelen planarians. Volume van de oplossing voor grotere gerechten aanpassen als dit nodig is.</li>
	<li>De dieren onder de Microscoop en afzien van het verplaatsen van de schotel voor de eerste 3-4 min toezien.</li>
	<li>Observeren van de extrusie van de keelholte door de Microscoop; de farynx zal uitsteken uit het faryngaal zakje en volledig uit te breiden (ongeveer 1 mm in lengte) zoals aangegeven in figuur 1B. Opmerking: Het is belangrijk om te wachten totdat de farynx klaar is met volledig voordat u verder uit te breiden. Zodra de farynx uit het dier blijkt, duurt volledig uittrekbaar ongeveer 1 minuut.</li>
	<li>Gebruik een plastic overdracht Pipetteer om te spuiten dieren rond de schotel. De dieren in de pipet zuigen en onder dwang laat hen in de schotel een paar keer. Als de keelholte volledig uitgeschoven is, zal dit krachtig pipetteren het veroorzaken om los te maken.</li>
	<li>U kunt ook begrijpen de farynx verticaal langs de lengte of horizontaal langs de omtrek met behulp van een paar fijne pincet (Zie Tabel van materialen) zoals aangegeven in Figuur 1 c. Met de keelholte geknepen in de Tang, til het dier naar boven richting de meniscus. Als het dier wordt verhoogd, zal de oppervlaktespanning de farynx om los van het dier te veroorzaken. Opmerking: Deze methode kan worden gebruikt voor het verwijderen van de pharynges van kleinere dieren (1-3 mm in lengte) waar het krachtige wervelende is niet voldoende. Vermijd porren of anders verwonden het kadaver van het dier.</li>
	<li>Met behulp van een pipet overdracht, geamputeerde dieren naar een nieuwe schotel met verse planaria water verplaatsen.</li>
	<li>Eenmaal overgedragen, spoel geamputeerde dieren grondig in planaria water, volledig uit te wisselen het water drie keer. Overbrengen naar een nieuwe schotel met planaria water met 50µg/mL gentamicine. Opmerking: Volledige buffer uitwisseling tijdens deze drie wast is essentieel om verwijdering van natriumazide.</li>
	<li>De volgende dag, wordt water in de schotel vervangen door verse planaria water met 50 µg/mL gentamicine. Herhaal elke andere dag daarna.</li>
</ol>3. beoordeling van de keelholte verwijdering na amputatie
<ol><li>Dieren onder een microscoop (met 10-20 X vergroting) onderzoeken om te bepalen of een donkere vlek na succesvolle verwijdering van de keelholte, verscheen zoals weergegeven in figuur 2A.</li>
	<li>Als alternatief, repareren en bleekmiddel dieren volgens het protocol beschreven door Pearson et al. 20. soak dieren overnachting in 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) of daar fluorescently-geconjugeerde (1 mg/mL verdund 1:500 in 1 X Phosphate Buffered Saline met 0,3% Triton-X). Mount dieren op dia's in 80% glycerol/20% 1 X Phosphate Buffered Saline en afbeelding onder een fluorescente stereomicroscoop (figuur 2B). Opmerking: Alle afbeeldingen in dit manuscript waren gevangen op een fluorescerende stereomicroscoop met een 1.0 X-doelstelling.</li>
</ol>4. beoordeling van de keelholte regeneratie door het meten van de voeding gedrag
<ol><li>
Voorbereiding van de lever
	<ol>
<li>Breng vereiste hoeveelheid lever plakken in een microcentrifuge of een conische buis. Kort draaien om luchtbellen te verwijderen. Schatten van de omvang van de lever, en planaria water toevoegen aan 1/5 van het volume, en 2% van het totale volume in rood voedsel kleuren. Bijvoorbeeld naar 1000 µL van lever plakken, voeg 200 µL van planaria water en 24 µL van voedselkleuring.</li>
		<li>Met behulp van een plastic stamper, Pipetteer tip of metalen spatel, meng totdat voedselkleuring is gelijkmatig verdeeld in de lever plakken. Nogmaals kort draaien. Lever plakken kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 24 uur of bevroren in aliquots bij-80 ° C voor langdurige opslag.</li>
		<li>Als het testen van tot 25 dieren, voorbereiden 25 µL van lever plakken per schotel (ongeveer 1 µL van lever plakken per dier).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voederen van dieren
	<ol>
<li>Zeven dagen na amputatie aan chemische, dieren overbrengen in een nieuwe petrischaal. Als 10-15 dieren te testen, gebruik een schotel van 35 mm; meer dan 15 dieren moeten worden beproefd in een petrischaal 60 mm. Dieren houden in het donker, ongestoord, gedurende ongeveer 1 uur voorafgaand aan voeding.</li>
		<li>De breedte van een P200 pipette uiteinde met behulp van schaar, vergroten door te korten ongeveer ½ cm off van het smalle einde. Pipetteer 25 µL van rode lever plakken in de schotel. Opmerking: Trimmen het einde maakt pipetteren de viskeuze lever plakken gemakkelijker. Om te verhinderen dat de lever drijvend op het oppervlak, raak het uiteinde aan de onderkant van de schotel terwijl verstrekking.</li>
		<li>Toestaan dat dieren te voeden gedurende 30 minuten.</li>
		<li>Score van het aantal dieren dat hebben gegeten door de dieren op een witte achtergrond plaatst of onderzoeken ze onder een microscoop met 10-20 X vergroting.</li>
		<li>Na het voeding, lever verwijderen uit de schotel en schoon.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Tanaka, E. M., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+basis+for+animal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">The cellular basis for animal regeneration.</a> Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).</li>
<li>Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Molecular+and+Cellular+Choreography+of+Appendage+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration.</a> Cell. 165, 1598-1608 (2016).</li>
<li>Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroreductase-mediated+cell%2Ftissue+ablation+in+zebrafish%3A+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat. Protoc. 3, 948-954 (2008).</li>
<li>White, D. T., Mumm, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nitroreductase+system+of+inducible+targeted+ablation+facilitates+cell-specific+regenerative+studies+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish.</a> Methods. 62, 232-240 (2013).</li>
<li>Smith-Bolton, R. K., Worley, M. I., Kanda, H., Hariharan, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+growth+in+Drosophila+imaginal+discs+is+regulated+by+Wingless+and+Myc%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Regenerative growth in Drosophila imaginal discs is regulated by Wingless and Myc.</a> Dev. Cell. 16, 797-809 (2009).</li>
<li>Smith-Bolton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Imaginal+Discs+as+a+Model+of+Epithelial+Wound+Repair+and+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Drosophila Imaginal Discs as a Model of Epithelial Wound Repair and Regeneration.</a> Adv. Wound Care. 5, 251-261 (2016).</li>
<li>Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Not+your+father%27s+planarian%3A+a+classic+model+enters+the+era+of+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Not your father's planarian: a classic model enters the era of functional genomics.</a> Nat. Rev. Genet. 3, 210-219 (2002).</li>
<li>Reddien, P. W., Sánchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of planarian regeneration.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 725-757 (2004).</li>
<li>Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonogenic+neoblasts+are+pluripotent+adult+stem+cells+that+underlie+planarian+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration.</a> Science. 332, 811-816 (2011).</li>
<li>Scimone, M. L., Kravarik, K. M., Lapan, S. W., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neoblast+specialization+in+regeneration+of+the+planarian+Schmidtea+mediterranea%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Neoblast specialization in regeneration of the planarian Schmidtea mediterranea.</a> Stem Cell Reports. 3, 339-352 (2014).</li>
<li>van Wolfswinkel, J. C., Wagner, D. E., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+reveals+functionally+distinct+classes+within+the+planarian+stem+cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis reveals functionally distinct classes within the planarian stem cell compartment.</a> Cell Stem Cell. 15, 326-339 (2014).</li>
<li>Adler, C. E., Seidel, C. W., McKinney, S. A., Sánchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+amputation+of+the+pharynx+identifies+a+FoxA-dependent+regeneration+program+in+planaria%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Selective amputation of the pharynx identifies a FoxA-dependent regeneration program in planaria.</a> Elife. 3, e02238(2014).</li>
<li>Adler, C. E., Sánchez Alvarado, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHRED-1+is+a+divergent+neurexin-1+homolog+that+organizes+muscle+fibers+and+patterns+organs+during+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">PHRED-1 is a divergent neurexin-1 homolog that organizes muscle fibers and patterns organs during regeneration.</a> Dev. Biol. 427, 165-175 (2017).</li>
<li>Wong, M. C., Martynovsky, M., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+migration+using+Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell migration using Caenorhabditis elegans as a model system.</a> Methods Mol. Biol. 769, 233-247 (2011).</li>
<li>Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C+elegans+chemotaxis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">C elegans chemotaxis assay.</a> J. Vis. Exp. , e50069(2013).</li>
<li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, 177(2012).</li>
<li>Tasaki, J., Uchiyama-Tasaki, C., Rouhana, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Stem+Cell+Motility+In+Vivo+Based+on+Immunodetection+of+Planarian+Neoblasts+and+Tracing+of+BrdU-Labeled+Cells+After+Partial+Irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Stem Cell Motility In Vivo Based on Immunodetection of Planarian Neoblasts and Tracing of BrdU-Labeled Cells After Partial Irradiation.</a> Methods Mol. Biol. 1365, 323-338 (2016).</li>
<li>Roberts-Galbraith, R. H., Brubacher, J. L., Newmark, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+genomics+screen+in+planarians+reveals+regulators+of+whole-brain+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A functional genomics screen in planarians reveals regulators of whole-brain regeneration.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Arnold, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+shifts+in+endogenous+microbiota+impede+tissue+regeneration+via+distinct+activation+of+TAK1%2FMKK%2Fp38%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Pathogenic shifts in endogenous microbiota impede tissue regeneration via distinct activation of TAK1/MKK/p38.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Pearson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde-based+whole-mount+in+situ+hybridization+method+for+planarians%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians.</a> Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).</li>
<li>LoCascio, S. A., Lapan, S. W., Reddien, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eye+Absence+Does+Not+Regulate+Planarian+Stem+Cells+during+Eye+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Eye Absence Does Not Regulate Planarian Stem Cells during Eye Regeneration.</a> Dev. Cell. 40, 381-391 (2017).</li>
<li>Nishimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+dopaminergic+neurons+after+6-hydroxydopamine-induced+lesion+in+planarian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Regeneration of dopaminergic neurons after 6-hydroxydopamine-induced lesion in planarian brain.</a> J. Neurochem. 119, 1217-1231 (2011).</li>
<li>Wilson, D. F., Chance, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Azide+inhibition+of+mitochondrial+electron+transport.+I.+The+aerobic+steady+state+of+succinate+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Azide inhibition of mitochondrial electron transport. I. The aerobic steady state of succinate oxidation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 131, 421-430 (1967).</li>
<li>Duncan, H. M., Mackler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+Transport+Systems+of+Yeast%3A+III.+Preparation+and+properties+of+cytochrome+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Electron Transport Systems of Yeast: III. Preparation and properties of cytochrome oxidase.</a> J. Biol. Chem. 241, 1694-1697 (1966).</li>
<li>Buchan, J. R., Yoon, J. H., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-specific+composition%2C+assembly+and+kinetics+of+stress+granules+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Stress-specific composition, assembly and kinetics of stress granules in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Cell Sci. 124, 228-239 (2011).</li>
<li>Cebrià, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+nervous+system+in+the+model+planarian+Schmidtea+mediterranea%3A+An+immunocytochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Organization of the nervous system in the model planarian Schmidtea mediterranea: An immunocytochemical study.</a> Neurosci. Res. 61, 375-384 (2008).</li>
<li>Shimoyama, S., Inoue, T., Kashima, M., Agata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Neuropeptide-Coding+Genes+Involved+in+Planarian+Pharynx+Extension%5BTitle%5D)+AND+%22Zoolog.+Sci%22%5BJournal%5D)">Multiple Neuropeptide-Coding Genes Involved in Planarian Pharynx Extension.</a> Zoolog. Sci. 33, 311-319 (2016).</li>
<li>Ito, H., Saito, Y., Watanabe, K., Orii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epimorphic+regeneration+of+the+distal+part+of+the+planarian+pharynx%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Epimorphic regeneration of the distal part of the planarian pharynx.</a> Dev. Genes Evol. 211, 2-9 (2001).</li>
<li>Bueno, D., Espinosa, L., Baguñà, J., Romero, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planarian+pharynx+regeneration+in++tail+fragments+monitored+with+cell-specific+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Planarian pharynx regeneration in tail fragments monitored with cell-specific monoclonal antibodies.</a> Dev. Genes Evol. 206, 425-434 (1997).</li>
<li>Hyman, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHyman%2C+L+%22The+invertebrates%3A+Platyhelminthes+and+Rhynchocoela%2C+the+acoelomate+Bilateria%22">The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria</a>. , McGraw-Hill. (1951).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dit protocol beschrijft een methode voor selectief ablatie van de farynx met behulp van natriumazide. Andere gerichte ablatie studies in planarians hebben gemodificeerde chirurgie tweedehands voor wegnemen researchdieren21 of farmacologische behandeling lasertherapie Dopaminerge neuronen22. Een belangrijk voordeel van chemische amputatie over bestaande methoden is dat het vereist geen chirurgie. De rigide structuur van de farynx vergeleken met de rest van het lichaam planar...

Regeneratie is een verschijnsel dat zich voordoet in het dierenrijk, met regeneratieve capaciteiten van volledige lichaam regeneratie in bepaalde ongewervelde dieren tot meer beperkte capaciteiten in gewervelde dieren1. Vervanging van functionele weefsels is een complex proces en vaak met zich meebrengt het gelijktijdige herstel van meerdere celtypen. Bijvoorbeeld om te regenereren de salamander ledemaat, botcellen chondrocyten, neuronen, spieren en epitheliale cellen moeten worden vervangen2. Deze nieuw gegenereerde celtypes moeten ook goed worden georganiseerd om nieuwe functie van de ledematen. Inzicht in deze complexe processen vereist technieken die gericht zijn op herstel van bepaalde celtypen en hun integratie in de organen.
Een van de strategieën ter vereenvoudiging van de studie van regeneratieve reacties in dienst is de gerichte ablatie van hetzij bepaalde celtypen of grotere collecties van weefsels. Bijvoorbeeld, in zebrafish leidt uitdrukking van nitroreductase in specifieke celtypen tot hun vernietiging na toepassing van metronidazol3,4. In Drosophila larven, het uiten van pro-apoptotic genen onder weefsel-specifieke initiatiefnemers bepaalde regio's van de imaginaire schijf5,6selectief lasertherapie. Beide van deze strategieën snelle, maar gecontroleerde schade veroorzaken, en zijn gebruikt voor het ontleden van de moleculaire en cellulaire mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de regeneratie.
In dit manuscript beschrijven we een methode voor selectief lasertherapie een gehele orgaan de farynx in de planarian Schmidtea mediterraneagenoemd. Planarians zijn een klassieke model van regeneratie, bekend voor hun productieve regeneratieve vermogen, waar zelfs minieme fragmenten kunnen regrow hele dieren 7,8. Ze hebben een grote, heterogene populatie van stamcellen uit zowel pluripotente cellen en lineage-beperkte progenitoren9,10,11. Deze cellen vermenigvuldigen en onderscheid maken ter vervanging van alle ontbrekende weefsel, met inbegrip van de keelholte, zenuwachtig, spijsvertering en uitscheidingsmechanisme systemen, en spier- en epitheliale cellen9,10,12. Terwijl we weten dat deze stamcellen regeneratie start, doen we de moleculaire mechanismen die hen ter vervanging van al deze verschillende soorten cellen rijden niet volledig begrijpen. Gedefinieerde verwonden methoden die de cel van de stam van de precieze antwoorden ontlokken kunnen helpen dit complexe proces af te bakenen.
De keelholte is een grote, cilindervormige buis die nodig zijn voor het voederen en neuronen, spier, epitheliale en secretoire cellen13,29bevat. Normaal gesproken verborgen in een tasje aan de ventrale zijde van het dier, het strekt zich uit door één lichaam van het dier openen na detectie van de aanwezigheid van voedsel. Om selectief amputeren de farynx, genieten we planarians in een chemische genaamd natriumazide, een veelgebruikte verdoving in C. elegans14,15,16. Het gebruik ervan in planarians werd voor het eerst gemeld door Adler et al.., in 201412. Binnen enkele minuten van de blootstelling aan natriumazide planarians extruderen hun pharynges, en met zachte agitatie, de keelholte is losgekoppeld van het dier. We verwijzen naar dit complete en selectieve verlies van de keelholte als "chemische amputatie". Een week na amputatie, is een volledig functionele farynx gerestaureerde12. Omdat de farynx vereist wordt voor het voederen, kan functionele regeneratie worden gemeten door voeding werking te controleren. Hieronder beschrijven we het protocol voor chemische amputatie, en voor de beoordeling van de regeneratie van de farynx en restauratie van het voederen van gedrag.

<table><tbody><tr><td>Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2)</td><td>Fisher Chemical</td><td>C79-3</td><td>Montju&iuml;c zout oplossing</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4)</td><td>Fisher Chemical</td><td>M65-3</td><td>Montju&iuml;c zout oplossing</td></tr><tr><td>Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2)</td><td>Acros/VWR</td><td>41341-5000</td><td>Montju&iuml;c zout oplossing</td></tr><tr><td>Potassium Chloride (KCl)</td><td>Acros Organics/VWR</td><td>196770010</td><td>Montju&iuml;c zout oplossing</td></tr><tr><td>Sodium Chloride (NaCl)</td><td>Acros Organics/VWR</td><td>207790050</td><td>Montju&iuml;c zout oplossing</td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate (NaHCO3)</td><td>Acros Organics/VWR</td><td>123360010</td><td>Montju&iuml;c zout oplossing</td></tr><tr><td>Nalgene autoclavable polypropyleencopolymeer lowboy met kraan</td><td>ThermoFisher Scientific/VWR</td><td>2324-0015</td><td>Planaria water opslaan</td></tr><tr><td>Instant Ocean Zeezout</td><td>Spectrum Brands</td><td>Amazon</td><td>Planaria water</td></tr><tr><td>Gentamicine Sulfaat</td><td>Gemini Bio-producten</td><td>400-100P</td><td>Planaria water</td></tr><tr><td>Schermessen</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71970</td><td>Lever snijden</td></tr><tr><td>Weggeefactjes voor bakkerij-16&rdquo;, 12-pack</td><td>Wilton</td><td>Amazon</td><td>Lever aliquots</td></tr><tr><td>5 mL spuiten</td><td>BD/VWR</td><td>309647</td><td>Lever aliquots</td></tr><tr><td>Petrischalen-35mm/60mm</td><td>Greiner Bio-One/VWR</td><td>82050-536/82050-544</td><td></td></tr><tr><td>Kunststof containers (diverse maten)</td><td>Ziploc</td><td>Amazon</td><td>Planarians huisvesten in statische cultuur</td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Transfer pijpje</td><td>Globe Scientific</td><td>138030</td><td></td></tr><tr><td>Pincet - Dumont Pincet, Stijl 5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72700-D (0203-5-PO)</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>62247</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidine, Alexa Fluor 488-conjugaat</td><td>ThermoFisher</td><td>S11223</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP229-1</td><td></td></tr></tbody></table>

chemische amputatie en regeneratie van de keelholte in de planarian schmidtea mediterranea

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians zijn platwormen die uiterst efficiënt bij regeneratie zijn. Ze zijn verplicht deze mogelijkheid om een groot aantal cellen van de stam die snel op elke vorm van schade inspelen kunnen. Gebruikelijke letsel modellen met deze dieren verwijderen grote hoeveelheden weefsel, die meerdere organen aantast. Om te overwinnen deze brede weefselschade, beschrijven we hier een methode voor het selectief verwijderen van een enkel orgaansysteem, de farynx, in het planarian Schmidtea mediterranea. Dit bereiken we door inweken dieren in een oplossing met de cytochroom oxidase remmers natriumazide. Korte blootstelling aan natriumazide veroorzaakt extrusie van de keelholte van het dier, wat wij noemen "chemische amputatie." Chemische amputatie worden verwijderd van de gehele farynx en genereert een kleine wond waar de farynx aan de darm hecht. Na het uitgebreide spoelen, regenereren alle geamputeerde dieren een volledig functionele keelholte in ongeveer een week. De cellen van de stam in de rest van het lichaam rijden regeneratie van de nieuwe farynx. Hier, wij bieden een gedetailleerd protocol voor chemische amputatie, en beschrijven van zowel histologische en gedragsmatige methoden om succesvolle amputatie en regeneratie te beoordelen.

Blootstelling aan natriumazide verstoort de normale beweeglijkheid van planarians, veroorzaakt door dieren te rekken en te spartelen. Deze bewegingen dwingen de farynx te ontstaan aan de ventrale zijde van het dier, en na ongeveer 6 min in natrium azide oplossing, het witte uiteinde van de keelholte kan worden gezien (figuur 1B-linker paneel). Een paar minuten later, dieren actief contract en de farynx volledig uit te breiden door te krachtig...

De planarian Schmidtea mediterranea is een uitstekend model voor het bestuderen van stamcellen en weefselregeneratie. Deze publicatie beschrijft een methode om selectief verwijderen van één orgaan, de keelholte, door dieren naar de chemische natriumazide bloot te leggen. Dit protocol wordt ook uitgelegd welke methoden voor de controle van de keelholte regeneratie.

Chemische amputatie en regeneratie van de keelholte in de Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

Het algemene doel van deze amputatieprocedure is om selectief en volledig de keelholte van planarianen te verwijderen zonder andere organen te beschadigen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van regeneratie. Zoals hoe stamcellen ontbrekende organen herkennen en hun regeneratie initiëren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het zeer nauwkeurig is en dat andere organen niet worden beschadigd tijdens het proces. Ik kreeg voor het eerst het idee voor deze methode toen ik planarianen anesthetiseerde met natriumazied. Ik merkte dat blootstelling aan natriumazied ervoor zorgde dat de keelholte eruit schoot.Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de amputatie de juiste selectie van dieren vereist, evenals een zorgvuldige observatie van dierbeweging en morfologie. De procedure zal worden gedemonstreerd door Divya Shiroor, afgestudeerde student van mijn laboratorium. Voordat u begint met de procedure, gebruikt u een plastic overdrachtspipet om wormen te selecteren die vijf tot zeven dagen eerder in een schone petrischaal zijn gevoerd.Plaats een vlakke liniaal onder de petrischaal om te bevestigen dat elke planarian minstens 6 millimeter lang is terwijl ze over de schaal kruipen. Breng vervolgens maximaal 20 geselecteerde wormen over in een 35 millimeter petrischaal en gebruik een overdrachtspipet om al het planarianwater uit de schaal te verwijderen. Plaats de schaal onder een stereomicroscoop en pas de vergroting aan zodat meerdere dieren kunnen worden bekeken.Voeg vijf milliliter vers bereide 100 millimolair natriumazied-oplossing toe aan de schaal. Monitor de dieren zonder de schaal te verplaatsen gedurende drie tot vier minuten om de extrusie van de keelholte te observeren. Wanneer ten minste de helft van de dieren in de schaal een volledig uitgebreide keelholte heeft, gebruikt u een plastic overdrachtspipet om de wormen enkele keren om de schaal heen te zuigen en er krachtig omheen te spuiten.Als er enige keelholten volledig zijn uitgebreid, zal dit krachtige pipetten ervoor zorgen dat ze loslaten. Als alternatief kunt u een paar fijne pincetten gebruiken om de keelholte vast te grijpen terwijl u de planarian omhoog naar de meniscus tilt. Terwijl het dier wordt opgetild, zal de oppervlaktespanning ervoor zorgen dat de keelholte loslaat.Terwijl je de keelholte beweegt, wees voorzichtig om geen onbedoelde verwondingen aan de dieren te veroorzaken. Planarianen zijn erg zacht van lichaam en gemakkelijk beschadigd, vooral in natriumazide. Gebruik een overdrachtspipet om ongeveer 15 geamputeerde dieren naar een nieuwe schaal te verplaatsen met vers planarianwater en spoel de wormen drie keer met vers planarianwater.Zorg ervoor dat je het natriumazide volledig uitspoelt. Zelfs sporen van de chemische stof kunnen ervoor zorgen dat dieren lyze. Incubeer de wormen vervolgens gedurende zeven dagen bij 20 graden Celsius.De dag na de amputatie, plaats de wormen weer onder de microscoop om te bepalen of een donkere vlek zichtbaar is op de dorsale zijde van de worm. Om de wormen te voeren, breng een geschikt volume leverpasta over in een microcentrifugebuis en centrifugeer de buis kort om eventuele luchtbellen te verwijderen. Na het schatten van het volume van de pastapellet, voeg planarianwater toe tot een vijfde van het volume.Op basis van het totale volume in de buis, voeg twee procent rood voedselkleuring toe. Meng het voedselmonster grondig totdat de kleurstof gelijkmatig over de pasta is verdeeld en centrifugeer de buis nogmaals kort. Breng de geamputeerde dieren over in een nieuwe petrischaal en plaats ze ongeveer een uur in het donker.Aan het einde van de incubatie, snijd ongeveer een halve centimeter van het uiteinde van een P200 pipettetip en gebruik de aangepaste tip om 25 microliters rode leverpasta in de schaal over te brengen. Laat de dieren 30 minuten voeren. Plaats vervolgens de wormen op een witte achtergrond om het aantal dieren te scoren dat rood lijkt.Na ongeveer 6 minuten in natriumazied-oplossing, is de witte punt van de keelholte te zien. Een paar minuten later trekken de dieren zich actief samen en stoten de keelholte krachtig uit hun lichaam. Na ongeveer 11 minuten blootstelling aan azide, ontspannen de dieren waarbij het karakteristieke klokvormige uiterlijk van de keelholte duidelijk zichtbaar wordt.Het is nu klaar voor amputatie. Het verwijderen van deze grote ongepigmenteerde weefselmassa resulteert in het verschijnen van een donkere vlek aan de dorsale zijde van de geamputeerde dieren. Om de regeneratie van de keelholte nauwkeuriger te monitoren, kunnen de dieren worden gekleurd met fluorescent geconjugeerd streptavidine gedurende de nacht.Door voedselkleuring te combineren met de leverpasta, kunnen de dieren die eten worden onderscheiden van de dieren die niet eten. Het aantal rode dieren kan vervolgens worden gekwantificeerd om het percentage dieren met een functionele keelholte te beoordelen. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in 20 of 30 minuten worden voltooid.Bij het uitvoeren van deze procedure, vergeet niet om de beweging van de planarianen zorgvuldig te observeren om te bepalen wanneer de amputatie moet beginnen. Selectieve amputaties kunnen helpen bij het beantwoorden van vragen zoals hoe stamcellen de juiste lijnbeslissingen initiëren om regeneratie te bereiken. Deze video zou een goed begrip moeten geven van hoe selectieve verwijdering van de keelholte met behulp van natriumazide kan worden uitgevoerd.Werken met natriumazide kan uiterst gevaarlijk zijn. Vergeet niet om het altijd met handschoenen te hanteren, afval goed weg te gooien en je werkruimte na het experiment schoon te maken.

chemical-amputation-regeneration-pharynx-planarian-schmidtea

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Een aantrekkelijk model voor het bestuderen van stamcellen differentiatie binnen een levend dier is de planarian platworm. Regeneratie wordt bestudeerd door eenvoudige amputatie experimenten die gemakkelijk worden uitgevoerd in een basic laboratorium en zijn vatbaar voor farmacologische en genetische...

Farmacologische en Functionele genetische Testen om de regeneratie van de Planarian manipuleren Dugesia japonica</em

Een effectieve methode voor het enten van weefsel van gedefinieerde en consistente grootte tussen planaria wordt beschreven. Ook inbegrepen is een beschrijving van de immobilisatie technieken gebruikt voor transplantatie kan worden aangepast in samenhang met lood schilden de gedeeltelijke bestraling van levende dieren.

Planarian Immobilisatie, Gedeeltelijke Bestraling en weefseltransplantatie

Hier demonstreren we hoe we regeneratie kunnen induceren en monitoren in de Starlet Zeeanemoon Nematostella vectensis, een model cnidarian anthozoan.  We laten zien hoe we kunnen amputeren en regeneratie categoriseren met behulp van een morfologisch stadiasysteem, en we gebruiken dit systeem om een vereiste voor autofagie in regenererende poliepstructuren te onthullen.

Inducerende Compleet Poliep Regeneration van de aboral Physa van de Starlet Zeeanemoon Nematostella vectensis

Dit protocol toont hoe planarian ogen (optische koppen) consistent snijden zonder verstoring omliggende weefsels. Via een insuline naald en spuit, een of beide ogen kunnen worden geablateerd voor onderzoek naar de mechanismen reguleren oog regeneratie, de ontwikkeling van visuele regeneratie en de neurale basis van door licht geïnduceerde gedragingen vergemakkelijken.

Chirurgische Ablation Assay voor het bestuderen van Eye Regeneratie in planarians

Hier presenteren we een protocol van volwassen muizen Terminal falalanx amputatie om de vorming van zoogdieren blastema en intramembraneuze ossificatie te onderzoeken, geanalyseerd door fluorescerende immunohistochemie en sequentiële in-vivo microcomputer tomografie.

Volwassen muis cijfer amputatie en regeneratie: een eenvoudig model om de vorming en Intramembraneuze ossificatie van zoogdier Blastema te onderzoeken

Zoetwaterplanariërs vertonen drie gangen (glijden, peristaltiek en scrunching) die te onderscheiden zijn door kwantitatieve gedragsanalyse. We beschrijven een methode om scrunching te induceren met behulp van verschillende schadelijke stimuli, kwantificering daarvan, en onderscheid van peristaltiek en glijden. Met behulp van gen knockdown, tonen we de specificiteit van scrunching als een kwantitatieve fenotypische uitlezing.

Planarian Scrunching als een kwantitatieve gedragsuitlezing voor schadelijke stimuli sensing

Het doel van deze studie was om een veilige en reproduceerbare chirurgische aanpak te standaardiseren voor het uitvoeren van een volledige transversale amputatie van de mandibula in Ambystoma mexicanum voor de studie van craniofaciaal weefselregeneratie.

Ontwerp en standaardisatie van een model voor mandibulair letsel voor de studie van craniofaciaal weefselregeneratie in het Ambystoma mexicanum model

Dit protocol biedt een geoptimaliseerde, gedetailleerde gids voor het gebruik van de planarian Schmidtea mediterranea als modelsysteem om gastheer-pathogeen interacties tijdens schimmelinfecties te bestuderen. De methode bouwt voort op de vorige procedure voor het infecteren van planarians met de menselijke schimmelziekteverwekker Candida albicans, en biedt gedetailleerde richtlijnen om de reproduceerbaarheid en experimentele consistentie te verbeteren.

Een geoptimaliseerd protocol voor Candida albicans-infectie in Schmidtea mediterranea om schimmelpathogenese en gastheerverdediging te bestuderen

We beschrijven de gedetailleerde stappen van een hoog-doorvoer chemische test bij de rondworm Caenorhabditis elegans die wordt gebruikt om de toxiciteit van de kiemcellen te beoordelen. Bij deze test wordt de verstoring van de kiemcellenfunctie na blootstelling aan chemicaliën gemonitord met behulp van een fluorescerende reporter specifiek voor aneuploïde embryo's.

Uitgebreide beoordeling van Kiembaan chemische toxiciteit De nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Drosophila bloedcellen, of hemocyten, circuleren tussen residente locaties en circulatie.  In de larve lokaliseren residente (sessile) hemocyten zich in inductief micro-omgevingen, de hematopoietische zakken, terwijl circulerende hemocyten vrij bewegen in de hemolymf. Het doel van dit protocol is de gestandaardiseerde isolatie en kwantificering van deze twee, gedragsmatig verschillende maar onderling uitwisselbare, hemocytpopulaties.

Testen Bloedcel Populaties van de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

Leer een methode voor chemische amputatie van de keelholte in planaria Schmidtea mediterranea met natriumazide. Deze techniek onderzoekt stamcelgedrag en regeneratieprocessen zonder andere organen te beschadigen.

Chemische amputatie en regeneratie van de keelholte in de Planarian Schmidtea mediterranea

Meer video's verkennen