Size Matters: Meting van de Diameter van de Capsule in Cryptococcus neoformans
27 februari 2018
De polysaccharide capsule is de primaire virulentiefactor in Cryptococcus neoformans, en haar grootte correleert met de virulentie van de stam. De diameter van de capsule metingen worden gebruikt bij het testen van de fenotypische en te meten van de therapeutische werking. Hier een standaardmethode van capsule inductie wordt gepresenteerd, en twee methoden van kleuring en het meten van de diameter worden vergeleken.
Het algemene doel van deze procedure is om de polysaccharide capsule van C.neoformans stammen te kleuren voor de visualisatie en meting van de capsulediameter. Deze methoden kunnen onderzoekers helpen bij de inductie, beeldvorming en meting van de capsulegrootte in Cryptococcus neoformans. Het grote voordeel van de kleurings- en beeldvormingstechnieken is dat ze eenvoudig, snel zijn en een nauwkeurige meting van de capsulediameter mogelijk maken.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de softwarestappen de eerste keer dat deze wordt gebruikt verwarrend kunnen zijn. De diameter van de capsule van Cryptococcus neoformans wordt vaak gebruikt als een maat voor virulentie. De mogelijkheid om dit proces te automatiseren kan aanzienlijke analysetijd besparen.
Om capsuleproductie te induceren, incubeer eerst een C.neoformans kolonie in gistpeptondextrosebouillon bij 37 graden Celsius met schudden gedurende 18-36 uur totdat de cultuur in log-fase is. Aan het einde van de cultuur, pellet de gist door centrifugatie en was de gist drie keer in PBS. Na de laatste wassing, resuspendeer de gist in een concentratie van twee keer 10 tot de vijfde cellen per twee milliliter DMEM en incubeer de cultuur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 18 uur.
De volgende dag, verzamel de cellen door centrifugatie en verwijder alle behalve de laatste 10 microliters van de supernatant. Om de gist te kleuren met Indiase inkt, resuspendeer het pellet in de resterende supernatant en breng vier microliters van de celsuspensie en vier microliters Indiase inkt over op een glazen microscoopglaasje. Meng de resulterende oplossing voorzichtig zonder bubbels te maken.
Plaats vervolgens een glas deksel van 1,5 dikte en 13 millimeter over het celmonster en verzegel de randen met een niet-toxisch afdichtmiddel. Om de gist te kleuren met een fluorescerende kleurstof, resuspendeer het overnachtingscultuurpellet in 50 microliters PBS aangevuld met 1% runder serum en incubeer de cellen in 55-60 microliters calcofluor-white en Alexa Fluor 488 geconjugeerd capsule monoklonaal 18B7 antilichaam gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, verzamel de cellen door centrifugatie en resuspendeer het pellet in 10 microliters PBS plus bovien serumalbumine.
Breng vervolgens acht microliters cellen over op een glazen microscoopglaasje, dek het celmonster af met een glas deksel van 1,5 dikte en 13 millimeter en verzegel de randen met een niet-toxisch afdichtmiddel. Om de gist te kleuren met beide kleurstoffen, incubeer de cellen eerst met een fluorescerende capsule en celwandkleuring zoals zojuist gedemonstreerd. Voeg vervolgens vier microliters van de fluorescerend gekleurde cellen en vier microliters Indiase inkt toe aan een glazen glaasje en plaats een verzegeld deksel over het schimmelcelmonster zoals gedemonstreerd.
Om de cellen te beeldvormen door lichtmicroscopie, selecteer de 100X objectief en beeld ten minste 50 niet-overlappende cellen per voorwaarde af met belichtingstijden geoptimaliseerd om de beeldcontrast te maximaliseren terwijl de vervaging veroorzaakt door kleine celbewegingen wordt geminimaliseerd. Om de cellen door fluoresceren microscopie te beeldvormen, open de microscoopbeeldvormingssoftware en selecteer de juiste excitatie- en emissiegolflengten voor de gebruikte fluoroforen. In het Z-stack controlepaneel, selecteer de eerste laatste optie.
Gebruik de fijne focuscontrole op de microscoop, focus eerst onder het breedste punt van het cellichaam van een enkele gistcel en de capsules voor alle cellen binnen het huidige gezichtsveld en klik op set first. Gebruik vervolgens de fijne focuscontrole om te focussen boven het breedste punt van het cellichaam van dezelfde cel en van de capsule voor alle cellen binnen het huidige gezichtsveld en klik op set last. Open vervolgens het acquisitietab en klik op start experiment om de Z-stack voor de huidige positie te verwerven.
Om de capsule- en celdiameters handmatig te meten, open een geschikt celmeetprogramma en selecteer de afbeelding die moet worden gemeten. Selecteer meten en gebruik de cursor om een rechte lijn door het breedste punt van de hele cel te trekken om de totale celdiameter te meten. Klik opnieuw op meten en trek een rechte lijn door het cellichaam om de diameter van het cellichaam te meten en open de volgende cel.
Wanneer alle cellen zijn gemeten, sla de afbeeldingen op. Voor geautomatiseerde meting van de capsule- en celdiameters, open eerst een geschikt beeldbewerkingsprogramma en draai alle afbeeldingen van de met Indiase inkt gekleurde cellen om. Vervolgens, om zowel de originele als omgekeerde afbeeldingen in de celmeetsoftware te importeren, open het bestandsmenu in het meetprogramma en selecteer importeren sequentie, afbeelding laden, sequentie handmatig definiëren, dimensies kanaal, importeren en toepassen.
Selecteer het kolonie-analyzer fluorescerend protocol voor de eerste geïnteresseerde omgekeerde afbeelding en klik op toepassen. Selecteer het kolonie-analyzer fluorescerend protocol opnieuw om de omgekeerde C.neoformans cellichaamsafbeeldingen van hun capsules te segmenteren en klik opnieuw op toepassen om een tellingsmasker te maken. Klik met de rechtermuisknop om het tellingsmasker cellichaam om te dopen en gebruik het celproliferatieprotocol op de originele afbeelding om de capsule te detecteren en te maskeren.
Klik op toepassen om een tellingsmasker voor de originele afbeelding te maken en doop het tellingsmasker capsule om. Om een nieuw masker over de originele afbeelding te maken om de aangrenzende capsules van elkaar te scheiden, selecteer capsule-partitie en capsule voor het capsulegebied. Om de gegevens te exporteren, klik op spreadsheet en klik vervolgens op het pictogram exporteren naar spreadsheet.
Selecteer de metingen die u wenst te exporteren en sla tenslotte de gegevens op. Een toename van de capsulegrootte is duidelijk zichtbaar in de meeste stammen na inductie, hoewel sommige stammen van nature kleine capsules vertonen. In dit representatieve experiment werd consistent een significant verschil in capsulegrootte waargenomen tussen de grootste stam en de twee kleinere stammen.
Verschillen in capsulegrootte kunnen ook worden gedetecteerd met behulp van fluorescerende kleurstoffen. Z-stack beeldacquisitie zorgt ervoor dat de maximale capsule- en cellichaamsdiameter voor elke cel wordt verworven. De stacks kunnen vervolgens worden verwerkt
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het kleuren en meten van de polysaccharidecapsule van Cryptococcus neoformans, een cruciale virulentiefactor. De beschreven technieken maken een nauwkeurige visualisatie en diametermeting mogelijk, wat correleert met de virulentie van de stam.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiologie
- Pathogeniteit
- Immunologie
Achtergrond
- De polysaccharidecapsule is cruciaal voor de virulentie van Cryptococcus neoformans.
- De diameter van de capsule is een belangrijke maatstaf voor de virulentie van de stam.
- Nauwkeurige meettechnieken zijn essentieel voor beoordelingen van de therapeutische effectiviteit.
- Een visuele demonstratie helpt bij het begrijpen van de methodologie.
Doel van de studie
- Om een gestandaardiseerde methode voor capsule-inductie te bieden.
- Om verschillende kleurings- en meettechnieken te vergelijken.
- Om de nauwkeurigheid en efficiëntie van de meting van de capsulesdiameter te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Inductie van de polysaccharidecapsule in C. neoformans-stammen.
- Kleuringstechnieken voor visualisatie.
- Meting van de capsuldiameter met behulp van imagingsoftware.
- Vergelijking van verschillende kleuringsmethoden op basis van effectiviteit.
Belangrijkste resultaten
- De gepresenteerde methoden maken een eenvoudige en snelle visualisatie van capsules mogelijk.
- Er werd een nauwkeurige meting van de capsule-diameter bereikt.
- Automatisering van het proces kan de analysetijd aanzienlijk verkorten.
- Visuele hulpmiddelen zijn essentieel voor het begrijpen van de bijbehorende softwarestappen.
Conclusies
- De gepresenteerde methoden zijn effectief voor het bestuderen van de virulentie van C. neoformans.
- Nauwkeurige meting van de capsule is essentieel voor het beoordelen van de therapeutische effectiviteit.
- Toekomstige studies kunnen profiteren van de automatisering van deze technieken.
Veelgestelde Vragen
Relevantie voor de Industrie
Nauwkeurige meting van de kapseldiameter van Cryptococcus neoformans biedt een kwantitatieve proxy voor de beoordeling van virulentie, wat targetvalidatie bij de ontdekking van antifungale middelen ondersteunt. De mogelijkheid om de meting van de kapselgrootte te automatiseren, verhoogt de reproduceerbaarheid en doorvoersnelheid in fenotypische screeningcampagnes. Deze methode maakt mechanistische risicoreductie mogelijk door kapselmodulatie te koppelen aan de effectiviteit van therapeutische interventies.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & target-validatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar virulentie-geassocieerde fenotypes mogelijk door directe meting van de capsulesdiameter.
- Operationele waarde: Ondersteunt hypothesetests van genetische of chemische modulatoren van capsulebiosynthese.
- Strategische waarde: Verhoogt het vertrouwen in targets door de kapselgrootte te correleren met het pathogene potentieel.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Biedt een kwantificeerbare uitlezing voor high-content screening van verbindingen die de kapselvorming beïnvloeden.
- Operationele waarde: Indische inktkleuring met geautomatiseerde beeldanalyse maakt schaalbare, gestandaardiseerde meting van de kapseldiameter mogelijk.
- Strategische waarde: Verbetert de reproduceerbaarheid van de assay en vermindert de variabiliteit tussen operators bij de beoordeling van het virulentiefenotype.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Koppelt veranderingen in de kapseldiameter aan de virulentie van de stam, wat bijdraagt aan voorspellende modellering van de therapeutische effectiviteit.
- Operationele waarde: Fluorescente co-kleuring met confocale beeldvorming maakt een nauwkeurige visualisatie van het kapsel met een verbeterde resolutie mogelijk.
- Strategische waarde: Maakt translationele continuïteit mogelijk van in vitro fenotype naar in vivo pathogeniteitsbeoordeling.
Pipeline- & workflowintegratie
Deze methode past binnen het ontdekkingscontinuüm van targetvalidatie via fenotypische screening tot preklinische evaluatie, waarbij de capsule-diameter dient als biomarker voor virulentiemodulatie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothese-gestuurde analyse van capsulesynthesepaden als virulentiedeterminanten.
- Screening: Maakt geautomatiseerde, kwantitatieve meting van capsulegrootte mogelijk voor screening van verbindingenbibliotheken.
- Analytiek: Genereert morfometrische gegevens (diameter van capsule en cellichaam) voor vergelijkende analyse onder verschillende condities.
- Translationeel onderzoek: Verbindt in vitro capsulemetingen met in vivo virulentiemodellen voor risico-gecorrigeerde verdere ontwikkeling.
- Bedrijfmatige herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar platform voor de identificatie van antifungale lead-verbindingen en studies naar het werkingsmechanisme.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanistische ambiguïteit bij de beoordeling van virulentie door directe, kwantificeerbare fenotypering.
- Operationele waarde: Standaardisatie via geautomatiseerde beeldanalyse verbetert de doorvoersnelheid en vermindert handmatige meetbias.
- Strategische waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij go/no-go-beslissingen door capsulegrootte te koppelen aan pathogeen potentieel.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde prioritering van antifungale kandidaten op basis van virulentie-attenuatie.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in microbiologische kweektechnieken en microscopie-gebaseerde beeldvorming.
- Afhankelijk van toegang tot licht- of fluorescentiemicroscopie en software voor beeldanalyse die in staat is tot morfometrische segmentatie.
- Vereist standaardisatie van protocollen voor capsule-inductie tussen laboratoria om vergelijkbaarheid te waarborgen.
- Geautomatiseerde meting vereist dat cellen in focus zijn met een voldoende capsulegrootte en minimale clustering voor een nauwkeurige segmentatie.
- De variabiliteit tussen experimenten is hoger bij India-inkt dan bij fluorescente kleuring, wat een strikte naleving van het protocol noodzakelijk maakt.
