Size Matters: Meting van de Diameter van de Capsule in Cryptococcus neoformans
February 27th, 2018
De polysaccharide capsule is de primaire virulentiefactor in Cryptococcus neoformans, en haar grootte correleert met de virulentie van de stam. De diameter van de capsule metingen worden gebruikt bij het testen van de fenotypische en te meten van de therapeutische werking. Hier een standaardmethode van capsule inductie wordt gepresenteerd, en twee methoden van kleuring en het meten van de diameter worden vergeleken.
Het algemene doel van deze procedure is om de polysaccharide capsule van C.neoformans stammen te kleuren voor de visualisatie en meting van de capsulediameter. Deze methoden kunnen onderzoekers helpen bij de inductie, beeldvorming en meting van de capsulegrootte in Cryptococcus neoformans. Het grote voordeel van de kleurings- en beeldvormingstechnieken is dat ze eenvoudig, snel zijn en een nauwkeurige meting van de capsulediameter mogelijk maken.
Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de softwarestappen de eerste keer dat deze wordt gebruikt verwarrend kunnen zijn. De diameter van de capsule van Cryptococcus neoformans wordt vaak gebruikt als een maat voor virulentie. De mogelijkheid om dit proces te automatiseren kan aanzienlijke analysetijd besparen.
Om capsuleproductie te induceren, incubeer eerst een C.neoformans kolonie in gistpeptondextrosebouillon bij 37 graden Celsius met schudden gedurende 18-36 uur totdat de cultuur in log-fase is. Aan het einde van de cultuur, pellet de gist door centrifugatie en was de gist drie keer in PBS. Na de laatste wassing, resuspendeer de gist in een concentratie van twee keer 10 tot de vijfde cellen per twee milliliter DMEM en incubeer de cultuur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 18 uur.
De volgende dag, verzamel de cellen door centrifugatie en verwijder alle behalve de laatste 10 microliters van de supernatant. Om de gist te kleuren met Indiase inkt, resuspendeer het pellet in de resterende supernatant en breng vier microliters van de celsuspensie en vier microliters Indiase inkt over op een glazen microscoopglaasje. Meng de resulterende oplossing voorzichtig zonder bubbels te maken.
Plaats vervolgens een glas deksel van 1,5 dikte en 13 millimeter over het celmonster en verzegel de randen met een niet-toxisch afdichtmiddel. Om de gist te kleuren met een fluorescerende kleurstof, resuspendeer het overnachtingscultuurpellet in 50 microliters PBS aangevuld met 1% runder serum en incubeer de cellen in 55-60 microliters calcofluor-white en Alexa Fluor 488 geconjugeerd capsule monoklonaal 18B7 antilichaam gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, verzamel de cellen door centrifugatie en resuspendeer het pellet in 10 microliters PBS plus bovien serumalbumine.
Breng vervolgens acht microliters cellen over op een glazen microscoopglaasje, dek het celmonster af met een glas deksel van 1,5 dikte en 13 millimeter en verzegel de randen met een niet-toxisch afdichtmiddel. Om de gist te kleuren met beide kleurstoffen, incubeer de cellen eerst met een fluorescerende capsule en celwandkleuring zoals zojuist gedemonstreerd. Voeg vervolgens vier microliters van de fluorescerend gekleurde cellen en vier microliters Indiase inkt toe aan een glazen glaasje en plaats een verzegeld deksel over het schimmelcelmonster zoals gedemonstreerd.
Om de cellen te beeldvormen door lichtmicroscopie, selecteer de 100X objectief en beeld ten minste 50 niet-overlappende cellen per voorwaarde af met belichtingstijden geoptimaliseerd om de beeldcontrast te maximaliseren terwijl de vervaging veroorzaakt door kleine celbewegingen wordt geminimaliseerd. Om de cellen door fluoresceren microscopie te beeldvormen, open de microscoopbeeldvormingssoftware en selecteer de juiste excitatie- en emissiegolflengten voor de gebruikte fluoroforen. In het Z-stack controlepaneel, selecteer de eerste laatste optie.
Gebruik de fijne focuscontrole op de microscoop, focus eerst onder het breedste punt van het cellichaam van een enkele gistcel en de capsules voor alle cellen binnen het huidige gezichtsveld en klik op set first. Gebruik vervolgens de fijne focuscontrole om te focussen boven het breedste punt van het cellichaam van dezelfde cel en van de capsule voor alle cellen binnen het huidige gezichtsveld en klik op set last. Open vervolgens het acquisitietab en klik op start experiment om de Z-stack voor de huidige positie te verwerven.
Om de capsule- en celdiameters handmatig te meten, open een geschikt celmeetprogramma en selecteer de afbeelding die moet worden gemeten. Selecteer meten en gebruik de cursor om een rechte lijn door het breedste punt van de hele cel te trekken om de totale celdiameter te meten. Klik opnieuw op meten en trek een rechte lijn door het cellichaam om de diameter van het cellichaam te meten en open de volgende cel.
Wanneer alle cellen zijn gemeten, sla de afbeeldingen op. Voor geautomatiseerde meting van de capsule- en celdiameters, open eerst een geschikt beeldbewerkingsprogramma en draai alle afbeeldingen van de met Indiase inkt gekleurde cellen om. Vervolgens, om zowel de originele als omgekeerde afbeeldingen in de celmeetsoftware te importeren, open het bestandsmenu in het meetprogramma en selecteer importeren sequentie, afbeelding laden, sequentie handmatig definiëren, dimensies kanaal, importeren en toepassen.
Selecteer het kolonie-analyzer fluorescerend protocol voor de eerste geïnteresseerde omgekeerde afbeelding en klik op toepassen. Selecteer het kolonie-analyzer fluorescerend protocol opnieuw om de omgekeerde C.neoformans cellichaamsafbeeldingen van hun capsules te segmenteren en klik opnieuw op toepassen om een tellingsmasker te maken. Klik met de rechtermuisknop om het tellingsmasker cellichaam om te dopen en gebruik het celproliferatieprotocol op de originele afbeelding om de capsule te detecteren en te maskeren.
Klik op toepassen om een tellingsmasker voor de originele afbeelding te maken en doop het tellingsmasker capsule om. Om een nieuw masker over de originele afbeelding te maken om de aangrenzende capsules van elkaar te scheiden, selecteer capsule-partitie en capsule voor het capsulegebied. Om de gegevens te exporteren, klik op spreadsheet en klik vervolgens op het pictogram exporteren naar spreadsheet.
Selecteer de metingen die u wenst te exporteren en sla tenslotte de gegevens op. Een toename van de capsulegrootte is duidelijk zichtbaar in de meeste stammen na inductie, hoewel sommige stammen van nature kleine capsules vertonen. In dit representatieve experiment werd consistent een significant verschil in capsulegrootte waargenomen tussen de grootste stam en de twee kleinere stammen.
Verschillen in capsulegrootte kunnen ook worden gedetecteerd met behulp van fluorescerende kleurstoffen. Z-stack beeldacquisitie zorgt ervoor dat de maximale capsule- en cellichaamsdiameter voor elke cel wordt verworven. De stacks kunnen vervolgens worden verwerkt
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het kleuren en meten van de polysacharide-capsule van Cryptococcus neoformans, een belangrijk virulentiefactor. De beschreven technieken vergemakkelijken nauwkeurige visualisatie en diametermeting, die correleert met de virulentie van de stam.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Microbiologie
- Pathogeniciteit
- Immunologie
Achtergrond
- De polysacharide-capsule is cruciaal voor de virulentie van Cryptococcus neoformans.
- Capsulediameter is een belangrijke maatstaf voor de virulentie van de stam.
- Nauwkeurige meettechnieken zijn essentieel voor beoordelingen van therapeutische werkzaamheid.
- Visuele demonstratie helpt bij het begrijpen van de methodologie.
Doel van de studie
- Om een gestandaardiseerde methode voor capsule-inductie te bieden.
- Om verschillende kleurings- en meettechnieken te vergelijken.
- Om de nauwkeurigheid en efficiëntie van capsulediametermeting te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Inductie van polysacharide-capsule in C. neoformans-stammen.
- Kleurtechnieken voor visualisatie.
- Meting van capsulediameter met behulp van beeldverwerkingssoftware.
- Vergelijking van verschillende kleuringsmethoden op effectiviteit.
Belangrijkste resultaten
- De gepresenteerde methoden maken eenvoudige en snelle capsule-visualisatie mogelijk.
- Nauwkeurige meting van capsulediameter werd bereikt.
- Automatisering van het proces kan de analysetijd aanzienlijk verkorten.
- Visuele hulpmiddelen zijn cruciaal voor het begrijpen van de betrokken softwarestappen.
Conclusies
- De gepresenteerde methoden zijn effectief voor het bestuderen van de virulentie van C. neoformans.
- Nauwkeurige capsulemeting is essentieel voor het beoordelen van therapeutische werkzaamheid.
- Toekomstige studies kunnen profiteren van de automatisering van deze technieken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accurate measurement of Cryptococcus neoformans capsule diameter provides a quantitative proxy for virulence assessment, supporting target validation in antifungal discovery. The ability to automate capsule size measurement enhances reproducibility and throughput in phenotypic screening campaigns. This method enables mechanistic de-risking by linking capsule modulation to therapeutic intervention efficacy.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of virulence-associated phenotypes through direct measurement of capsule diameter.
- Operational Value: Supports hypothesis testing of genetic or chemical modulators of capsule biosynthesis.
- Strategic Value: Facilitates target confidence by correlating capsule size with pathogenic potential.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a quantifiable readout for high-content screening of compounds affecting capsule formation.
- Operational Value: India ink staining with automated image analysis enables scalable, standardized capsule diameter measurement.
- Strategic Value: Improves assay reproducibility and reduces inter-operator variability in virulence phenotype assessment.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links capsule diameter changes to strain virulence, supporting predictive modeling of therapeutic efficacy.
- Operational Value: Fluorescent co-staining with confocal imaging allows for precise, resolution-enhanced capsule visualization.
- Strategic Value: Enables translational continuity from in vitro phenotype to in vivo pathogenicity assessment.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through phenotypic screening to preclinical evaluation, where capsule diameter serves as a biomarker of virulence modulation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of capsule biosynthesis pathways as virulence determinants.
- Screening: Enables automated, quantitative measurement of capsule size for compound library screening.
- Analytics: Generates morphometric data (capsule and cell body diameter) for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects in vitro capsule measurements to in vivo virulence models for risk-adjusted advancement.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for antifungal lead identification and mechanism-of-action studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in virulence assessment through direct, quantifiable phenotyping.
- Operational Value: Standardization via automated image analysis improves throughput and reduces manual measurement bias.
- Strategic Value: Increases predictive confidence in go/no-go decisions by linking capsule size to pathogenic potential.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of antifungal candidates based on virulence attenuation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiological culture techniques and microscopy-based imaging.
- Dependent on access to light or fluorescence microscopy and image analysis software capable of morphometric segmentation.
- Necessitates standardization of capsule induction protocols across laboratories to ensure comparability.
- Automated measurement requires cells to be in focus with sufficient capsule size and minimal clustering for accurate segmentation.
- Inter-experiment variability is higher with India ink than fluorescent staining, necessitating careful protocol adherence.
