Name: Detectie van wasmiddel-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Leer een methode om wasmiddel-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten te detecteren met histidine- en myc-tags. Dit protocol helpt onderzoekers bij biochemische eiwitinteractiestudies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door DK52057 en DK107498 van de NIH naar KvK X.P werd gesteund door de institutionele opleiding-subsidie 2T32DK007201 van de NIH onderzoekssubsidies.

1. het hanteren van de Peptide
<ol><li>Ontwerpen en bestellen van de peptide<ol>
<li>Kies de gewenste volgorde van de peptide en toevoegen van een tag, zoals myc epitope (EQKLISEED) op haar beide N - of C-terminus.</li>
		<li>Controleer de voorspelde oplosbaarheid van de peptide in water, met behulp van peptide oplosbaarheid rekenmachine http://pepcalc.com/peptide-solubility-calculator.php. Als de oplosbaarheid laag is, probeert toe te voegen een andere in water oplosbare tag als de balans van de kosten wilt wijzigen. Opmerking: We gebruikten de peptide die overeenkomt met de eerste luminal lus (fll) van GLUT4 die zijn gelabeld met de myc epitope (vet) in de N-terminus (Myc-fll-GLUT4): EQKLISEED-LNAPQKVIEQSYNATWLGRQGPGGPSSIPPGTLTTLWA met "goed" voorspelde oplosbaarheid in water .</li>
		<li>Bestel de aangepaste peptide met ten minste 75% zuiverheid die is voldoende voor de bepaling, en vragen van de provider voor oplosbaarheid. Scheiden de volgorde in ten minste twee aliquots in geval van onvoorziene problemen met het oplossen van de peptide. Opmerking: Myc-fll-GLUT4 werd besteld in twee porties. De gerapporteerde oplosbaarheid in water, ultrapure is ≤10 mg/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ontbinding van de peptide Opmerking: Ultrapure water is het beste oplosmiddel. Als de peptide niet oplosbaar in water lijkt, verwijzen naar http://www.genscript.com/peptide_solubility_and_stablity.html voor instructies.<ol>
<li>100 x werkoplossing van de peptide in ultrazuiver water of in de buffer van keuze, met de concentratie van 100 μg/mL voor te bereiden.</li>
		<li>Scheiden van de oplossing in 50-100 µL aliquots, en bewaar ze bij-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. het hanteren van cellen
<ol><li>Celcultuur<ol>
<li>Wild type (WT) cellen worden gebruikt als een negatieve controle, en de cellen, uiting geven aan het doel-eiwit gelabeld met zes histidines (HisP). Opmerking: We gebruikt 3T3 L1 pre adipocytes stabiel transfected met Sortilin-myc/zijn5.</li>
		<li>Het groeien van de cellen in de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) hoge suiker, aangevuld met 10% kalf runderserum, glutamine (2 mM) en penicilline/streptomycine (5 μg/mL) bij 37 ° C in 10% CO,2.</li>
		<li>Vier 10 cm schotels van cellen zitten, twee van hen met HisP transfect en transfect van de andere twee met controle plasmide (WT). 48 h na transfectie, cellen moeten 80-90% confluentie bereiken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voorbereiding van de cel Lysates<ol>
<li>Bereiden van lysis-buffermengsel (10 mM Hepes, 30 mM NaCl, 5% glycerol, 10 mM imidazool, 0,5% Triton X-100 en protease inhibitor van de omwenteling zonder EDTA cocktail voor de isolatie van Zijne-gelabelde proteïnen, pH 7.4) en houd het bij 4 ° C:</li>
		<li>Wassen van de cellen drie keer met 10 mL, 1 x met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij 4 ° C.</li>
		<li>Zet de gerechten op het ijs en 500 µL van lysis buffer toevoegen aan elk gerecht. Oogst van de cel lysates met behulp van een cel schraper.</li>
		<li>Plaats de cel lysate van elk gerecht in een verschillende 1,5 mL-buis. Label de buizen als WT-pH6 WT-pH8, HisP-pH6, HisP-pH8.</li>
		<li>Passeren de cel lysates een injectiespuit met een naald 26G vijf keer op en neer, tot volledige lysis.</li>
		<li>Centrifugeer de cel lysates bij 16.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.</li>
		<li>Het supernatant overbrengen in nieuwe identiek gelabelde buizen.</li>
		<li>Analyseren met behulp van de BCA eiwit Assay Kit of andere kit eiwitconcentratie.</li>
		<li>Met behulp van lysis-buffermengsel, egaliseren eiwitconcentratie van alle vier lysates.</li>
		<li>Scheiden van een klein (ca. 20 µL) hoeveelheid van elk lysate en houd het bij-20 ° C voor mogelijke controle experimenten en/of het oplossen van problemen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. bindende van Zijne-gelabeld eiwitten aan de HisPur Cobalt kralen
<ol><li>Het gebruik van verkrijgbare was buffer of bereiden een (50 mM nb2HPO4/NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazool, pH 8) en houd het bij 4 ° C.</li>
	<li>Bereiden van wassen buffer met pH 6 door tittering wassen buffer pH 8 met HCl. Houd het bij 4 ° C.</li>
	<li>Zachtjes swirl de fles van de kobalt parels te maken van homogene suspensie.</li>
	<li>Afzien 40 µL van de schorsing van de kralen kobalt in vier 1,5 mL buizen zoals hierboven aangegeven (stap 2.2.4).</li>
	<li>Voeg 1 mL lysisbuffermengsel aan elke buis, de buizen bij 1000 x g Centrifugeer gedurende 5 s. Aspirate het supernatant en 40 μL van lysis buffer toevoegen aan vaste kralen.</li>
	<li>De cel lysates aan overeenkomstige buizen toevoegen.</li>
	<li>Incubeer de buizen voor 90 min bij 4 ° C op een buis rotator bij 20 omwentelingen per minuut.</li>
	<li>Centrifugeer de buizen bij 1000 x g voor 5 s en verzamel het supernatant. Houd het supernatant bij 4 ° C.</li>
	<li>Voeg 500 µL van pH 8 of pH 6 was buffer overeenkomstige buizen en resuspendeer de kralen zachtjes.</li>
	<li>Centrifugeer de buizen bij 1000 x g gedurende 5 s en negeren het supernatant.</li>
	<li>Herhaal stap 3.9 en 3.10 voor vier keer.</li>
</ol>4. de binding van de Peptide aan de zijne-gelabeld proteïne geïmmobiliseerd op de parels
<ol><li>Met behulp van 100 x werkende oplossing van de peptide (stap 1.2.1), bereiden 1 x werkoplossing in pH 6 of pH 8 was buffer (twee 100 µL aliquots voor elk, 1 µg/mL).</li>
	<li>Voeg 100 μl van 1 x peptide oplossing aan de gewassen kralen met de bijbehorende pH.</li>
	<li>Incubeer de kralen gedurende 30 minuten bij 4 ° C op een buis rotator bij 20 omwentelingen per minuut.</li>
	<li>Centrifugeer de buizen bij 1.000 x g gedurende 5 s, verzamelen het supernatant en bewaar deze bij-20 ° C.</li>
	<li>Herhaal stap 3.9 en 3.10 voor vier keer. Opmerking: Ter vermindering mogelijk achtergrond, kunnen de volgende stappen stappen 4.4 en 4.5 vervangen.</li>
	<li>Neem vier micro kolommen met 30 μm poriën, label hen zoals in stap 2.2.4, en plaats van de kolommen in collectie buizen.</li>
	<li>Na voltooiing van stap 4.3, breng het incubatie-mengsel in de kolommen, kunt u de oplossing te passeren door de zwaartekracht. Houden van de stroom door bij-20 ° C.</li>
	<li>Pass 500 µL van wassen buffer met pH 6 of pH 8 door overeenkomstige kolommen door de zwaartekracht. Gooi de stroom door.</li>
	<li>Herhaal stap 4.8 vier keer.</li>
	<li>Na de laatste wassen, centrifugeren de kolommen bij 1.000 x g gedurende 15 s.</li>
</ol>5. de elutie van kobalt kralen
<ol><li>Gebruik commerciële Tricine monster buffer (200 mM Tris-HCl, 40% glycerol, 2% SDS, 0,04% Coomassie Blue, pH 6.8) en β-mercaptoethanol toevoegen aan de uiteindelijke concentratie van 2%.</li>
	<li>Voeg toe 40 µL van Tricine monster buffer (met β-mercaptoethanol) aan de gewassen kralen en vortex het monster.</li>
	<li>Verwarm de monsters gedurende 10 minuten bij 100 ° C, vortex de monsters weer samen en centrifugeer de buizen bij 1.000 x g gedurende 5 s. Opmerking: Ter vermindering van mogelijke niet-specifieke binding in de elutie, kunnen de volgende stappen stappen 5.1-5.3 vervangen.</li>
	<li>40 μL van elutie imidazool Buffer (50 mM nb2HPO4/NaH2PO4, 300 mM NaCl, 0,25 M imidazol) toevoegen aan de gewassen kralen, vortex en de buizen bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten uit te broeden.</li>
	<li>Centrifugeer de buizen bij 3000 x g gedurende 30 s, het supernatant (geëlueerd monsters) verzamelen en overdragen naar nieuwe gelabelde buizen.</li>
	<li>Voeg 40 l Tricine monster buffer aan elke buis, heat van de monsters gedurende 10 minuten bij 100 ° C, vortex en centrifuge de buizen bij 1.000 x g gedurende 5 s. Opmerking: Als micro kolommen worden gebruikt, de elutie buffer toevoegen aan de gewassen kralen, Incubeer gedurende 20 min en verzamelen de elutie door centrifugeren bij 8.000 x g gedurende 2 min. Opmerking: Monsters kunnen worden bewaard bij-20 ° C tot elektroforese wordt uitgevoerd.</li>
</ol>6. elektroforese en het westelijke bevlekken
Opmerking: De monsters zijn klaar voor de scheiding door SDS-pagina en de daaropvolgende westelijke bevlekken. Volg protocol van de Elektroforese van het gel (https://www.jove.com/science-education/5065/the-western-blot) met de volgende wijzigingen.
<ol><li>Gebruik verkrijgbare 10-20% Tricine kleurovergang gels.</li>
	<li>Op de gel, door 20 µL van de eluted monsters en 20 µL van lysates (stap 2.2.10) te laden. Voor het oplossen van problemen, is het aangeraden om te laden 20 µL van niet-afhankelijke materiaal (stap 3.8) en 10 ng van de peptide; vóór het laden, toevoegen u gelijke hoeveelheid Tricine monster buffer aan deze monsters.</li>
	<li>Verrichten van elektroforese in commerciële Tris/Tricine/SDS buffer (100 mM Tris, 100 mM Tricine, en 0,1% SDS, pH 8.3) uitgevoerd.</li>
	<li>Het materiaal van de gel op een membraan van 0,45 µm nitrocellulose met overdracht buffer (25 mM Tris base, 192 mM glycine, pH 8.4) aangevuld met 20% methanol overbrengen.</li>
	<li>Blokkeren van het membraan met 3% boviene serumalbumine (BSA) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Met behulp van vooraf gebeitst molecuulgewicht markeringen als gidsen, knippen het membraan horizontaal, vlek van het bovenste deel met een antilichaam tegen HisP en vlek het onderste gedeelte met een antilichaam tegen het myc epitoop te identificeren van de peptide myc-gelabeld. Opmerking: In ons geval, snijden van het membraan is niet vereist omdat zowel HisP als Myc-fll-GLUT4 kunnen worden opgespoord met een anti-myc antilichaam.</li>
</ol>7. analyse van de resultaten
<ol><li>De intensiteit van alle westelijke vlek signalen met behulp van een Image Station of ImageJ programma te kwantificeren.</li>
	<li>Normaliseren van het signaal van de peptide myc-gelabeld tegen het signaal van de HisP op beide pH-waarden.</li>
</ol>

<ol><li>Bogan, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+glucose+transporter+translocation+in+health+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Regulation of glucose transporter translocation in health and diabetes.</a> Annu Rev Biochem. 81, 507-532 (2012).</li>
<li>Kandror, K. V., Pilch, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sugar+is+sIRVed%3A+sorting+Glut4+and+its+fellow+travelers%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The sugar is sIRVed: sorting Glut4 and its fellow travelers.</a> Traffic. 12 (6), 665-671 (2011).</li>
<li>Pan, X., Zaarur, N., Singh, M., Morin, P., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortilin+and+retromer+mediate+retrograde+transport+of+Glut4+in+3T3-L1+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Sortilin and retromer mediate retrograde transport of Glut4 in 3T3-L1 adipocytes.</a> Mol Biol Cell. 28 (12), 1667-1675 (2017).</li>
<li>Kim, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+luminal+loop+confers+insulin+responsiveness+to+the+glucose+transporter+4%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The first luminal loop confers insulin responsiveness to the glucose transporter 4.</a> Mol Biol Cell. 23 (5), 910-917 (2012).</li>
<li>Shi, J., Kandror, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortilin+is+essential+and+sufficient+for+the+formation+of+Glut4-storage+vesicles+in+3T3-L1+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Sortilin is essential and sufficient for the formation of Glut4-storage vesicles in 3T3-L1 adipocytes.</a> Dev Cell. 9 (1), 99-108 (2005).</li>
<li>Coutinho, M. F., Prata, M. J., Alves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shortcut+to+the+lysosome%3A+the+mannose-6-phosphate-independent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Metab%22%5BJournal%5D)">A shortcut to the lysosome: the mannose-6-phosphate-independent pathway.</a> Mol Genet Metab. 107 (3), 257-266 (2012).</li>
<li>Willnow, T. E., Petersen, C. M., Nykjaer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VPS10P-domain+receptors+-+regulators+of+neuronal+viability+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">VPS10P-domain receptors - regulators of neuronal viability and function.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (12), 899-909 (2008).</li>
<li>Mazella, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+100-kDa+neurotensin+receptor+is+gp95%2Fsortilin%2C+a+non-G-protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The 100-kDa neurotensin receptor is gp95/sortilin, a non-G-protein-coupled receptor.</a> J Biol Chem. 273 (41), 26273-26276 (1998).</li>
<li>Ni, X., Morales, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Lysosomal+Trafficking+of+Acid+Sphingomyelinase+is+Mediated+by+Sortilin+and+Mannose+6-phosphate+Receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The Lysosomal Trafficking of Acid Sphingomyelinase is Mediated by Sortilin and Mannose 6-phosphate Receptor.</a> Traffic. 7 (7), 889-902 (2006).</li>
<li>Westergaard, U. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+sortilin+Vps10p+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the sortilin Vps10p domain.</a> J Biol Chem. 279 (48), 50221-50229 (2004).</li>
<li>Nykjaer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sortilin+is+essential+for+proNGF-induced+neuronal+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sortilin is essential for proNGF-induced neuronal cell death.</a> Nature. 427 (6977), 843-848 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Sortilin is een evolutionaire Geconserveerde proteïne van de multi ligand-receptor die betrokken is in beide signalering op het plasma-membraan en intracellulaire Sorteer gebeurtenissen6,7. De zoektocht naar de authentieke sortilin liganden (waarvan sommige zijn luminal of integraal membraaneiwitten) is echter ingewikkeld als de interactie van sortilin met een aantal van haar partners bindende lijkt te zijn gevoelig voor detergentia. Daarom een eenvoudig en een b...

GLUT4 is een glucose transporter proteïne die overwegend wordt uitgedrukt in vet en skeletale spiercellen, waar het het effect van de insuline op postprandiale bloed glucose goedkeuring1bemiddelt. Wordt een zeer stabiele eiwitten, is GLUT4 op een posttranslationele niveau geregeld. Bij gebrek aan insuline, GLUT4 is grotendeels uitgesloten uit het plasma-membraan (vandaar lage basale permeabiliteit voor glucose) en is gelokaliseerd vooral binnen de cel in kleine insuline-responsieve blaasjes (IRVs) en trans-Golgi network (TGN) die dreigt te vertegenwoordigen de IRV donor compartiment. Op insuline toediening, de IRVs zekering met het plasma-membraan en GLUT4 leveren op de site van de werking ervan. Dit verhoogt de permeabiliteit van het plasma-membraan voor glucose, zodat dat glucose-opname uit bloed in adipocytes en skeletale myocytes 10 tot 40-fold stijgt. Na de terugtrekking van de insuline, is GLUT4 geïnternaliseerd in vroege/sorteren Endosomen en vervolgens opgehaald voor TGN waar de IRVs zich opnieuw gevormd. Beide sorteren stappen in het GLUT4 traject, d.w.z. wegnemen uit de perifere vroege Endosomen tot het perinuclear TGN, en de vorming van de IRVs op de TGN donor membranen zijn ingeschakeld door een familielid van Vps10p, sortilin, die een type vertegenwoordigt I transmembraan eiwit en een sorteer receptor. Volgens één model, sortilin werkt als een transmembraan steiger eiwit: het GLUT4 in het lumen van de Endosomen en TGN bindt, en werft adapters van de retromer of clathrin naar de cytoplasmatische kant van de donor membraan via haar C-terminus2, 3. Dit vergemakkelijkt de verdeling van de GLUT4 in vesiculaire dragers die GLUT4 tussen de intracellulaire compartimenten translocate.
De interactie van de cytoplasmatische staart van sortilin met retromer en verschillende adaptor eiwitten is goed gedocumenteerd. Echter, de binding van sortilin naar GLUT4 (en op een aantal van haar andere proteïne liganden) heeft zijn uitdagend om te bewijzen. In het bijzonder, pogingen om te co-immunoprecipitate sortilin en GLUT4 niet gelukt waarschijnlijk te wijten aan het wasmiddel-gevoelige aard van de interactie tussen deze twee eiwitten. Bovendien, als een typische transporter proteïne, heeft GLUT4 12 transmembraan domeinen en 6 luminal loops elke mogelijke combinatie van die potentieel een sortilin-bindende site vertegenwoordigen kan. Op hetzelfde moment, een grote hoeveelheid indirect bewijs, zoals aanzienlijke co lokalisatie in de cel, dwarsbinding met membraan-permeabele DSP, en de interactie in gist twee hybridesysteem suggereren dat sortilin kan binden aan de GLUT4. Bovendien hebben gebruikt de laatste benadering in een combinatie met de alanine scannen mutagenese, wij eerder vastgesteld dat het domein van de Vps10p van sortilin voornamelijk aan de eerste luminal lus van GLUT4 bindt. Echter, het bewijs van een dergelijke interactie in zoogdiercellen heeft ontbroken. Hier hebben we geïsoleerd zijn-gelabeld sortilin uit cellen transfected 3T3-L1 met behulp van kobalt hars en aangetoond dat kan communiceren met chemisch gesynthetiseerde peptide overeenkomt met de eerste luminal lus van GLUT4 bij pH 6 en pH 8 die lijken op zure milieu in de endosomal lumen en neutrale omgeving in het lumen van de TGN membranen. Geen bindend peptide werd ontdekt in controle experimenten waar uittreksel bereid uit niet-transfected cellen was geladen op de dezelfde parels.

```html
<table><tbody><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Sigma</td><td>P8849</td><td>voor gebruik bij de zuivering van histidine-tag-eiwitten</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline&nbsp;</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>PBS</td></tr><tr><td>1mL Insulin Syringe U-100</td><td>BD</td><td>329652</td><td>26G x 1/2</td></tr><tr><td>BCA Protein Assay Kit</td><td>Pierce</td><td>23228</td><td></td></tr><tr><td>Wash buffer</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-234</td><td>Voor His-tag-eiwit zuivering</td></tr><tr><td>HisPur Cobalt Resin</td><td>Thermo Scientific</td><td>89964</td><td></td></tr><tr><td>Tricine sample Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0739</td><td>met SDS, b-Mercaptaethanol moet worden toegevoegd</td></tr><tr><td>Elution&nbsp; Buffer</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-236</td><td>Voor His-tag-eiwit zuivering met 250mM Imidazol</td></tr><tr><td>Mini-Protean Tris-Tricine precast gels 10-20%&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>456-3115</td><td>Voor scheiding van peptide en klein eiwit</td></tr><tr><td>Tris/Tricine/SDS running buffer&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0744</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Buffer</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-190</td><td>Voeg 20% methanol toe</td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane&nbsp; 0.45 mm</td><td>Bio-Rad</td><td>1620115</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Anti Myc antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>2272</td><td>Konijn</td></tr><tr><td>Peptide</td><td>Genscipt</td><td></td><td>Op maat gemaakte bestelling</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual color Standarts</td><td>BioRad</td><td>161-0374</td><td></td></tr></tbody></table>
```

detectie van wasmiddel-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Ons vermogen om te verkennen van eiwit-eiwitinteractie is de sleutel tot het begrijpen van regelgevende verbindingen in de cel. Detectie van eiwit-eiwitinteractie in veel gevallen is echter geassocieerd met significante experimentele uitdagingen. In het bijzonder, interageren Sorteer receptoren met hun lading van de eiwitten in het lumen van het membraan compartimenten vaak in een wasmiddel-gevoelige mode, waardoor co-immunoprecipitation van deze proteïnen onbruikbaar. Binding van het sorteren receptor sortilin aan glucose transporter die glut4 als een voorbeeld van zwakke luminal interacties tussen membraaneiwitten dienen kan. Hier beschrijven we een snelle, eenvoudige en goedkope assay voor het valideren van de interactie tussen sortilin en GLUT4. Wij hebben daarvoor ontworpen en chemisch gesynthetiseerd het myc-gelabeld peptide overeenkomt met de potentiële sortilin-bindende epitoop in het luminal deel van GLUT4. Gelabeld met zes histidines Sortilin was uitgedrukt in zoogdiercellen en geïsoleerd van cel lysates met behulp van kobalt kralen. Sortilin geïmmobiliseerd op de parels was geïncubeerd met de peptide oplossing bij verschillende pH-waarden, en het eluted materiaal werd geanalyseerd door het westelijke bevlekken. Deze test kan gemakkelijk aangepast worden aan andere wasmiddel-gevoelige eiwit-eiwitinteractie te bestuderen.

Lysates waren bereid uit 3T3 L1 cellen transfected stabiel met Sortilin-myc/zijn5 en uit WT 3T3 L1 cellen, gebruikt als een negatieve controle. Beide lysates werden geïncubeerd met kobalt kralen op pH 6 of pH 8 en grondig gewassen. Kralen met geïmmobiliseerdet eiwitten werden vervolgens geïncubeerd in de oplossing van Myc-fll-Glut4. Na voorzichtig wast, werden eiwitten gebonden aan de parels geëlueerd met 0,25 M imidazool. Monsters werden blootgesteld, samen met de...

Beschrijven we een protocol voor de detectie van wasmiddel-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten binding van de sorteer-receptor, sortilin, aan de eerste luminal lus van de glucose transporter proteïne, GLUT4, waarbij als voorbeeld.

Detectie van wasmiddel-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

Het algemene doel van deze procedure is om detergent-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten of andere eiwitten te detecteren. Deze procedure vereist dat één eiwit histidine-gelabeld is en overmatig wordt uitgedrukt in de cellen, terwijl de ander een myc-gelabeld peptide is. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen op het gebied van biochemie en belangrijke eiwitinteractiestudies.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om de interactie tussen membraaneiwitten op een detergent-gevoelige manier te detecteren. De procedure is snel en eenvoudig. Hoewel deze methode inzicht kan geven in membraaneiwitinteracties, kan het ook worden gebruikt om zwakke eiwitinteracties te bestuderen.We hadden het idee voor deze methode voor het eerst toen we de interactie tussen de membraaneiwitten, Saltilin en GLUT4, wilden controleren, maar pogingen om ze samen uit het mammaal lysis te immunoprecipiteren, bleken onsuccesvol. Om een bestelling te plaatsen voor het peptide, selecteer de doelsequentie van het peptide die cruciaal is voor interactie en voeg een myc-epitoop toe aan het einde of C-terminus van de sequentie. Zodra het peptide is aangekomen, bereid 100 microgram per milliliter van de werkoplossing van het peptide in ultra puur water voor.Zaai drie 3T3-L1 pre-adipocyte cellen in vier 10 centimeter kweekschotels en bewaar ze in de incubator. Transfect vervolgens twee kweekschotels met het doeleiwit dat is gelabeld met 6X histodyn en label als HISP in de andere twee schotels met twee controleplasmiden en label als WT. Laat de cellen na de transfectie 48 uur in de incubator om 80 tot 90% confluency te bereiken. Om de cellysaat voor te bereiden, was de cellen op ijs drie keer met 10 milliliter 1X gebufferd zoutoplossing gekoeld tot vier graden Celsius.Voeg vervolgens 500 microliter lysisbuffer toe aan elk van hen. Los vervolgens de cellen los van de schotels met behulp van een celschraper om de lysaat voor te bereiden. Breng het cellysaat dat uit elke kweekschotel is bereid, over in vier afzonderlijke 1,5 millimeter buisjes en label alle buisjes.Laat vervolgens het cellysaat vijf keer omhoog en omlaag door een spuit met een 26 gauge naald voor totale cellyse. Centrifugeer vervolgens de cellulaire lysaten bij 16000xg gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Breng de supernatanten over in vier identiek gelabelde nieuwe buisjes.Voor toekomstig probleemoplossen en controle-experimenten, verdeel 20 microliter van het cellysaat en bewaar het op 20 graden Celsius. Voor later gebruik, titrateer de wasbuffer op PH8 met zoutzuur om PH6 te verkrijgen en bewaar de buffer op vier graden Celsius. Om vervolgens een homogene suspensie van de kobaltkralen voor te bereiden, draai voorzichtig de fles rond.Breng vervolgens 40 microliter van de kobaltkralensuspensie over in alle afzonderlijk gemarkeerde vier buisjes. Voeg na het toevoegen van de kobaltkralen een milliliter lysisbuffer toe aan de buisjes. Centrifugeer vervolgens de buisjes bij 1000xg gedurende vijf seconden.Gooi de supernatant weg en pipetteer 40 microliter lysisbuffer naar de neergedaalde kralen. Breng vervolgens het cellysaat over in de bijbehorende buisjes en incubeer het gedurende 90 minuten op vier graden Celsius op een buisrotor. Na 90 minuten centrifugeer de monsters bij 1000xg gedurende vijf seconden.Verzamel vervolgens het supernatant gelabeld Flowthrough-1 en bewaar het op 20 graden Celsius. Voeg vervolgens 500 microliter van de wasbuffer met PH8 toe aan de afzonderlijke buisjes en schud de kralen voorzichtig opnieuw op. Centrifugeer de buisjes bij 1000xg gedurende vijf seconden en verwijder de supernatanten.Voeg vervolgens wasbuffer met PH8 met of zes toe aan de buisjes, volgens de labels, en schud de kralen goed opnieuw op. Centrifugeer de buisjes bij 1000xg gedurende vijf seconden en verwijder de supernatanten. Bereid een microgram per milliliter werkoplossing van het peptide en waterbuffer met PH6 of acht voor.Voeg vervolgens 100 microliter van de peptideoplossing toe aan de gewassen kralen die overeenstemmen met een vergelijkbare PH. Incubeer vervolgens de kralen gedurende 30 minuten op vier graden Celsius op een buisrotor. Neem vervolgens vier microkolommen, label ze en plaats de kolommen in verzamelbuisjes gelabeld Flowthrough-2. Nadat de incubatie voorbij is, voegt u het incubatiemengsel toe aan de kolommen.Laat de oplossing door middel van zwaartekracht passeren en verzamel het monster uit de stroom. Plaats de kolommen in nieuwe verzamelbuisjes en bewaar ze op 20 graden Celsius. Laat vervolgens 500 microliter van de wasbuffer met PH6 of acht door middel van zwaartekrachtstroming door de afzonderlijke kolommen passeren en gooi de flowthrough weg.Herhaal deze stap vier keer. Centrifugeer de buisjes bij 1000xg gedurende vijf seconden. Plaats de kolom in het nieuwe verzamelbuisje gelabeld Elution.Het is belangrijk om de kralen in alle buisjes zeer zorgvuldig en gelijkmatig te wassen om van het ongebonden peptide af te komen. Voeg aan de gewassen kralen 40 microliter tricine monsterbuffer met bèta-mercaptoethanol toe. Laat het 20 minuten op kamertemperatuur staan.Centrifugeer de kolom bij 8000xg gedurende twee minuten. Gooi de kolommen weg en verhit de verzamelbuisjes gedurende 10 minuten op 100 graden Celsius. Centrifugeer het vervolgens bij 1000xg gedurende vijf seconden.Alternatief, voeg 40 microliter Elution Imidazolbuffer toe aan de gewassen kralen en incubeer het op kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Nadat de incubatie voorbij is, centrifugeer de buisjes bij 8000xg gedurende twee minuten. Gooi de kolommen weg en voeg 40 microliter tricine monster toe.Verhit de verzamelbuisjes gedurende 10 minuten op 100 graden Celsius en centrifugeer het vervolgens bij 1000xg gedurende vijf seconden. Gebruik de commercieel verkrijgbare 10-20% tricine gradiëntgels. Gebruik

detection-detergent-sensitive-interactions-between-membrane

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

In this video, we demonstrate a fluorescence-detection size-exclusion chromatography technique to screen for green fluorescent protein (GFP)-fused membrane protein stability in Escherichia coli following detergent solubilization. Proteins exhibiting a symmetrical peak in the size-exclusion profile with little or no free GFP indicate purified proteins with minimum degradation and aggregation, which can subsequently be selected for structure-function analysis.

Fluorescence-Detection Size-Exclusion Chromatography: A Technique to Identify the Integrity of Fluorescent Membrane Proteins upon Detergent Solubilization

Een biochemische benadering wordt beschreven in vivo eiwit-eiwit interacties (PPI) van membraaneiwitten identificeren. De methode combineert eiwit verknoping, affiniteitszuivering en massaspectrometrie, en is aanpasbaar aan vrijwel elk type cel of organisme. Met deze benadering ook de identificatie van voorbijgaande PPI mogelijk.

Membraan-STEKEL: een biochemische Tool om eiwit-eiwit interacties van membraaneiwitten Identificeer In Vivo

Een gestroomlijnde benadering screening op de expressie van recombinant membraaneiwitten in Escherichia coli gebaseerd op fusie met groen fluorescent proteïne gepresenteerd.

Green Fluorescent Protein gebaseerd Expression Screening van membraaneiwitten in<em&gt; Escherichia coli</em

Veel eiwitten voeren hun functie uit wanneer ze aan membraanoppervlakken zijn gehecht. De binding van extrinsieke eiwitten op nanodisc-membranen kan indirect worden afgebeeld door transmissie-elektronenmicroscopie. We laten zien dat de karakteristieke stapelvorming (rouleau) van nanodiscs, veroorzaakt door de negatieve kleuring natriumfosfowolframaat, wordt voorkomen door de binding van extrinsiek eiwit.

Methode om te visualiseren en te analyseren Membrane interagerende eiwitten door Transmission Electron Microscopy

Dit protocol laat zien hoe een model met een lage resolutie ab initio en structurele details van een wasmiddel-ontbindend membraan eiwit in small-angle neutron scattering met contrast-matching van het detergent oplossing te verkrijgen.

Contrast-Matching wasmiddel in Small-Angle Neutron Scattering experimenten voor membraan eiwit structurele analyse en modellering van de Ab Initio

Hier presenteren we een protocol voor een verterings techniek op membraan voor de bereiding van monsters voor massaspectrometrie. Deze techniek vergemakkelijkt de gemakkelijke analyse van eiwit-eiwit interacties.

Evaluatie van eiwit-eiwit interacties met behulp van een on-membraan Vergistings techniek

Thermoforese op microschaal verkrijgt snel bindingsconstanten tegen lage materiaalkosten. Gelabelde of labelvrije thermoforese op microschaal is in de handel verkrijgbaar; labelvrije thermoforese is echter niet in staat tot de diversiteit aan interactiemetingen die kunnen worden uitgevoerd met behulp van fluorescerende labels. Wij bieden een protocol voor gelabelde thermoforesemetingen.

Gebruik van thermoforese op microschaal om eiwit-lipide-interacties te meten

We presenteren een methode die membraan eiwit zuivering en reconstitutie in peptidiscs combineert in een enkele chromatografische stap. Biotinyated steigers worden gebruikt voor directe oppervlakte bevestiging en meting van eiwit-ligand interacties via biolayer interferometrie.

PeptiQuick, een in één stap incorporatie van membraan eiwitten in Biotinylated Peptidiscs voor gestroomlijnde eiwit binding assays

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de bepaling van oligomere toestand van membraaneiwitten dat gebruik maakt van een inheems celmembraan nanodeeltjessysteem in combinatie met elektronenmicroscopie.

Native Cell Membrane Nanodeeltjes Systeem voor Membraan Eiwit-Eiwit Interactie Analyse

Dit artikel beschrijft een methode voor het beoordelen van de interacties en assemblages van integrale membraaneiwitten in vitro met verschillende partnerfactoren in een lipid-proximaal milieu.

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren In Vitro

Leer een methode om wasmiddel-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten te detecteren met histidine- en myc-tags. Dit protocol helpt onderzoekers bij biochemische eiwitinteractiestudies.

Detectie van wasmiddel-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten

Meer video's verkennen