Detectie van wasmiddel-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten
March 7th, 2018
Beschrijven we een protocol voor de detectie van wasmiddel-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten binding van de sorteer-receptor, sortilin, aan de eerste luminal lus van de glucose transporter proteïne, GLUT4, waarbij als voorbeeld.
Het algemene doel van deze procedure is om detergent-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten of andere eiwitten te detecteren. Deze procedure vereist dat één eiwit histidine-gelabeld is en overmatig wordt uitgedrukt in de cellen, terwijl de ander een myc-gelabeld peptide is. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen op het gebied van biochemie en belangrijke eiwitinteractiestudies.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om de interactie tussen membraaneiwitten op een detergent-gevoelige manier te detecteren. De procedure is snel en eenvoudig. Hoewel deze methode inzicht kan geven in membraaneiwitinteracties, kan het ook worden gebruikt om zwakke eiwitinteracties te bestuderen.
We hadden het idee voor deze methode voor het eerst toen we de interactie tussen de membraaneiwitten, Saltilin en GLUT4, wilden controleren, maar pogingen om ze samen uit het mammaal lysis te immunoprecipiteren, bleken onsuccesvol. Om een bestelling te plaatsen voor het peptide, selecteer de doelsequentie van het peptide die cruciaal is voor interactie en voeg een myc-epitoop toe aan het einde of C-terminus van de sequentie. Zodra het peptide is aangekomen, bereid 100 microgram per milliliter van de werkoplossing van het peptide in ultra puur water voor.
Zaai drie 3T3-L1 pre-adipocyte cellen in vier 10 centimeter kweekschotels en bewaar ze in de incubator. Transfect vervolgens twee kweekschotels met het doeleiwit dat is gelabeld met 6X histodyn en label als HISP in de andere twee schotels met twee controleplasmiden en label als WT. Laat de cellen na de transfectie 48 uur in de incubator om 80 tot 90% confluency te bereiken. Om de cellysaat voor te bereiden, was de cellen op ijs drie keer met 10 milliliter 1X gebufferd zoutoplossing gekoeld tot vier graden Celsius.
Voeg vervolgens 500 microliter lysisbuffer toe aan elk van hen. Los vervolgens de cellen los van de schotels met behulp van een celschraper om de lysaat voor te bereiden. Breng het cellysaat dat uit elke kweekschotel is bereid, over in vier afzonderlijke 1,5 millimeter buisjes en label alle buisjes.
Laat vervolgens het cellysaat vijf keer omhoog en omlaag door een spuit met een 26 gauge naald voor totale cellyse. Centrifugeer vervolgens de cellulaire lysaten bij 16000xg gedurende 10 minuten bij vier graden Celsius. Breng de supernatanten over in vier identiek gelabelde nieuwe buisjes.
Voor toekomstig probleemoplossen en controle-experimenten, verdeel 20 microliter van het cellysaat en bewaar het op 20 graden Celsius. Voor later gebruik, titrateer de wasbuffer op PH8 met zoutzuur om PH6 te verkrijgen en bewaar de buffer op vier graden Celsius. Om vervolgens een homogene suspensie van de kobaltkralen voor te bereiden, draai voorzichtig de fles rond.
Breng vervolgens 40 microliter van de kobaltkralensuspensie over in alle afzonderlijk gemarkeerde vier buisjes. Voeg na het toevoegen van de kobaltkralen een milliliter lysisbuffer toe aan de buisjes. Centrifugeer vervolgens de buisjes bij 1000xg gedurende vijf seconden.
Gooi de supernatant weg en pipetteer 40 microliter lysisbuffer naar de neergedaalde kralen. Breng vervolgens het cellysaat over in de bijbehorende buisjes en incubeer het gedurende 90 minuten op vier graden Celsius op een buisrotor. Na 90 minuten centrifugeer de monsters bij 1000xg gedurende vijf seconden.
Verzamel vervolgens het supernatant gelabeld Flowthrough-1 en bewaar het op 20 graden Celsius. Voeg vervolgens 500 microliter van de wasbuffer met PH8 toe aan de afzonderlijke buisjes en schud de kralen voorzichtig opnieuw op. Centrifugeer de buisjes bij 1000xg gedurende vijf seconden en verwijder de supernatanten.
Voeg vervolgens wasbuffer met PH8 met of zes toe aan de buisjes, volgens de labels, en schud de kralen goed opnieuw op. Centrifugeer de buisjes bij 1000xg gedurende vijf seconden en verwijder de supernatanten. Bereid een microgram per milliliter werkoplossing van het peptide en waterbuffer met PH6 of acht voor.
Voeg vervolgens 100 microliter van de peptideoplossing toe aan de gewassen kralen die overeenstemmen met een vergelijkbare PH. Incubeer vervolgens de kralen gedurende 30 minuten op vier graden Celsius op een buisrotor. Neem vervolgens vier microkolommen, label ze en plaats de kolommen in verzamelbuisjes gelabeld Flowthrough-2. Nadat de incubatie voorbij is, voegt u het incubatiemengsel toe aan de kolommen.
Laat de oplossing door middel van zwaartekracht passeren en verzamel het monster uit de stroom. Plaats de kolommen in nieuwe verzamelbuisjes en bewaar ze op 20 graden Celsius. Laat vervolgens 500 microliter van de wasbuffer met PH6 of acht door middel van zwaartekrachtstroming door de afzonderlijke kolommen passeren en gooi de flowthrough weg.
Herhaal deze stap vier keer. Centrifugeer de buisjes bij 1000xg gedurende vijf seconden. Plaats de kolom in het nieuwe verzamelbuisje gelabeld Elution.
Het is belangrijk om de kralen in alle buisjes zeer zorgvuldig en gelijkmatig te wassen om van het ongebonden peptide af te komen. Voeg aan de gewassen kralen 40 microliter tricine monsterbuffer met bèta-mercaptoethanol toe. Laat het 20 minuten op kamertemperatuur staan.
Centrifugeer de kolom bij 8000xg gedurende twee minuten. Gooi de kolommen weg en verhit de verzamelbuisjes gedurende 10 minuten op 100 graden Celsius. Centrifugeer het vervolgens bij 1000xg gedurende vijf seconden.
Alternatief, voeg 40 microliter Elution Imidazolbuffer toe aan de gewassen kralen en incubeer het op kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Nadat de incubatie voorbij is, centrifugeer de buisjes bij 8000xg gedurende twee minuten. Gooi de kolommen weg en voeg 40 microliter tricine monster toe.
Verhit de verzamelbuisjes gedurende 10 minuten op 100 graden Celsius en centrifugeer het vervolgens bij 1000xg gedurende vijf seconden. Gebruik de commercieel verkrijgbare 10-20% tricine gradiëntgels. Gebruik
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor het detecteren van detergent-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten, met behulp van de binding van de sorteerreceptor, sortiline, aan het glucosetransportereiwit, GLUT4, als voorbeeld. De methode is ontworpen om studies van eiwitinteracties in een biochemisch relevante context te vergemakkelijken.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Membraaneiwitinteracties
- Eiwitmarkeringstechnieken
Achtergrond
- Het begrijpen van eiwitinteracties is cruciaal in de biochemie.
- Membraaneiwitten vereisen vaak specifieke omstandigheden om hun interacties te bestuderen.
- Detergent-gevoelige methoden geven inzicht in de dynamiek van deze interacties.
- Histidine en myc tagging zijn gebruikelijke technieken die worden gebruikt voor eiwitdetectie.
Doel van studie
- Om een betrouwbare methode te ontwikkelen voor het detecteren van interacties tussen membraaneiwitten.
- Om de voordelen van het gebruik van detergent-gevoelige technieken te benadrukken.
- Om een snel en eenvoudig protocol te bieden voor onderzoekers in het veld.
Gebruikte methoden
- Overexpressie van histidine-gelabelde eiwitten in cellen.
- Gebruik van een myc-gelabeld peptide voor interactiestudies.
- Toepassing van detergent-gevoelige assays om eiwitinteracties te detecteren.
- Analyse van bindinginteracties tussen sortiline en GLUT4.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol detecteert succesvol interacties tussen membraaneiwitten.
- Detergentgevoeligheid maakt de studie van zwakke eiwitinteracties mogelijk.
- Resultaten tonen de effectiviteit van de tagging-methode aan.
- De procedure is efficiënt en reproduceerbaar voor onderzoekers.
Conclusies
- Deze methode biedt waardevolle inzichten in membraaneiwitinteracties.
- Het kan worden toegepast op verschillende eiwitinteractiestudies.
- Toekomstig onderzoek kan op deze techniek voortbouwen voor een dieper begrip.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Detection of detergent-sensitive interactions between membrane proteins addresses a critical gap in early discovery, where conventional co-immunoprecipitation fails to capture weak or transient luminal contacts. This assay enables biopharma teams to validate protein-protein interactions under native-like conditions, supporting mechanistic de-risking and target confidence at the portfolio triage stage. The method's adaptability to other membrane protein systems enhances its strategic value for enterprise R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of weak or transient membrane protein interactions that are detergent-sensitive.
- Supports functional target validation by confirming direct binding events in a controlled biochemical context.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing true biological interactions from artifacts of harsh extraction conditions.
- Improves predictive confidence for advancing targets into downstream screening or validation workflows.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protein interaction systems for downstream quantitative assays and screening platforms.
- Standardizes detection of protein-protein interactions using tagged constructs and reproducible Western blot readouts.
- Enables reproducible and scalable workflows for evaluating compound effects on membrane protein complexes.
- Supports reliable assay development for membrane protein interaction studies where detergent sensitivity is a concern.
Translational & Preclinical Research
- Provides mechanistic insight into disease-relevant membrane protein interactions when aligned with translational biomarker strategies.
- Ensures continuity from discovery-stage validation to preclinical model selection by confirming interaction specificity.
- Reduces risk of late-stage attrition due to undetected weak or context-dependent protein interactions.
Pipeline & Workflow Integration
This assay fits at the interface of early discovery and lead identification, enabling teams to validate membrane protein interactions before committing resources to large-scale screening or preclinical studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by confirming direct protein-protein contacts under native-like conditions.
- Screening: Provides a reproducible, quantitative readout for interaction strength and specificity using Western blot analysis.
- Analytics: Delivers measurable outputs (e.g., band intensity, presence/absence) to compare interaction conditions such as pH sensitivity.
- Translational Research: Aligns with biomarker strategies when membrane protein interactions are implicated in disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable workflow for diverse membrane protein systems beyond the initial sortilin-GLUT4 example.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in membrane protein target validation.
- Operational Value: Delivers a standardized, rapid, and reproducible protocol for interaction detection.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by de-risking targets early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of membrane protein targets with validated interactions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein tagging, cell culture, and Western blot analysis.
- Needs access to mammalian expression systems, peptide synthesis, and analytical instrumentation for immunoblotting.
- Demands rigorous cross-team standardization of buffer conditions and tagging strategies for reproducibility.
- Adaptable to various membrane protein systems but may require optimization for peptide solubility and tag placement.
- Limited to interactions detectable under the chosen biochemical conditions; may not capture all physiologically relevant contacts.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:05
Handling of the Peptide and Cells
3:02
Binding of His-tagged Proteins to the HisPur Cobalt Beads
4:39
Binding of the Peptide to the His-tagged Protein Immobilized on the Beads
5:59
Elution from Cobalt Beads
7:07
Electrophoresis, Western Blotting, and Analysis of Results
7:58
Results: Use of Immunoblot Assay to Study the Interaction between Sortilin Immobilized on Cobalt Beads and myc-tagged Peptide
9:18
Conclusion
