Een methode om de effecten van milieu verrijking op de dikke darm Microbiome biodiversiteit in een muismodel van het Colon-Tumor definiëren
28 februari 2018
Milieu verrijking (EE) is een dierverblijven omgeving die wordt gebruikt voor het onthullen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de verbindingen tussen de levensstijl, stress en ziekte. Dit protocol beschrijft een procedure maakt die gebruikmaakt van een muismodel van dikke darm tumorvorming en EE aan wijzigingen in microbiota biodiversiteit die mogelijk van invloed op dierlijke sterfte specifiek te definiëren.
Het hoofddoel van deze publicatie is om een methode te presenteren voor het normaliseren van het microbioom van knaagdieren. In deze demonstratie wordt het effect van omgevingsverrijking op het microbioom onderzocht tijdens de ontwikkeling van darmtumoren. Dit protocol laat zien hoe het normaliseren van het microbioom vóór een interventie voor omgevingsverrijking de experimentele reproduceerbaarheid verbetert.
We laten ook zien hoe dierstress kan worden verminderd en interacties kunnen worden verbeterd met behulp van een verrijkte omgeving. Hoewel we ons hebben geconcentreerd op het effect van omgevingsverrijking in een darmtumormodel, kan de methode gemakkelijk worden toegepast om de rol van het microbioom in de etiologie van ziekten beter te begrijpen. Zet de kooien op onder steriele omstandigheden, werkend onder een geventileerde kap.
De controles voor dit experiment bestaan uit conventionele kooien met strooisel en labweefsel voor nestelen, maar hebben anders geen verrijkingsapparaten. Om de poppenkooien of de verrijkte kooien op te zetten, verbindt u twee grote geautoclaveerde kooien met een gesteriliseerde tunnel met grommet en voegt u in elke kooi een gesteriliseerde platform toe om de vloeroppervlakte te vergroten. Voor EE biedt u ook gesteriliseerde loopwielen, tunnels, iglo's, hutten, kruilballen en nestmateriaal.
Plaats zowel de verrijkte als de controlekooien in dezelfde rek om een gelijke ventilatie te bieden. Voor kweek combineert u één reu en twee potentiële moeders in normale kooien. Controleer elke ochtend op vaginale pluggen die aangeven dat het dier 's nachts heeft gepaard.
Als er geen plug wordt gezien, kan weerstand tegen vaginaal sonderen een geïnternaliseerde plug detecteren. Als een vrouw een vaginale plug heeft, plaatst u haar in een grote poppenkooi. Tot 12 zwangere moeders kunnen worden gehuisvest in de verrijkte kooien met platformen, op voorwaarde dat ze allemaal in dezelfde week verwacht worden te werpen.
Wanneer de poppen 21 tot 28 dagen oud zijn, verdeelt u de mannetjes en vrouwtjes naar genotype in controle-omgevingen of verrijkte omgevingen. Zorg ervoor dat u een verhouding van elk genotype in elke kooi behoudt. Niet-verrijkte kooien kunnen maximaal vijf muizen ondersteunen, terwijl verrijkte kooien minimaal 20 muizen nodig hebben voor sociale stimulatie en kunnen maximaal 41 muizen ondersteunen.
Begin een of twee dagen voordat de muizen worden geëuthanaseerd met het verzamelen van ontlasting. Verzamel altijd op hetzelfde tijdstip van de dag. Om ontlasting van levende dieren te verzamelen, scruft u het dier voorzichtig over een schone kooi.
Verzamel vervolgens de gedefecerende ontlasting met behulp van steriele pincetten en breng deze over in een steriele microfugebuis. Als een dier niet onmiddellijk defecereert, plaatst u het in een schone kooi en wacht tot het dier heeft gedefeceerd, wat tot een uur kan duren. Om ontlasting van een geëuthanaseerd dier te verzamelen, dissecteert u het om toegang te krijgen tot de dikke darm.
Snij vervolgens de dikke darm net onder het blindedarm af en leg de darm op een stuk filterpapier. Gebruik vervolgens pincetten om de bovenkant van de darmbuis op te tillen en open het lumen met schaar. Snijd longitudinaal van distaal naar proximaal om de darm in de lengte open te spreiden.
Verzamel vervolgens ontlasting van de distale dikke darm in een steriele microfugebuis met behulp van steriele pincetten. Bewaar de ontlastingsmonsters bij min 80 graden Celsius. Verzamel naast de ontlasting andere weefselmonsters van de dikke darm en dunne darm, microsomen, vetweefsel, enzovoort.
Gebruik een commercieel kit om microbieel DNA uit de ontlasting te isoleren volgens een protocol voor detectie van ontlastingpathogenen. Wanneer u dit doet, brengt u de monsters van de vriezer van min 80 graden Celsius op droogijs over en weegt u ze. Stel vervolgens een PCR op die het microbiële DNA amplificeert zoals beschreven in het tekstprotocol.
Ruimen vervolgens de reactieproducten op met behulp van magnetische kralen. Voor het opruimen centrifugeert u eerst kort de amplicon PCR-plaat om de reactieproducten te poolen. Vorm vervolgens de magnetische kralen voorzichtig om ze gelijkmatig te verdelen en breng 20 microliter aliquots over naar elke reactieput.
Meng de kralen grondig met de oplossing door het hele volume langzaam 10 keer te pipetten. Laat de kralen vervolgens vijf minuten bezinken. Plaats vervolgens de PCR-plaat op een magnetisch statief en wacht twee minuten tot de supernatanten helder zijn na magnetische verzameling van kralen.
Verwijder en gooi vervolgens de supernatanten weg. Vul vervolgens, terwijl de plaat nog op de magneet staat, elke put met kralen met 200 microliter verse 80% ethanol en wacht 30 seconden. Verwijder vervolgens voorzichtig het supernatant.
Herhaal deze wasstap eenmaal en laat de kralen 10 minuten aan de lucht drogen. Eluteer nu de reactieproducten van de kralen door de plaat van het magnetische statief te verwijderen en 52,5 microliter Tris toe te voegen aan elke put. Meng de kralen volledig in oplossing door het hele volume langzaam 10 keer te pipetten.
Verzamel vervolgens de kralen op het magnetische statief zoals eerder en breng 50 microliter van het supernatant over naar een schone PCR-plaat. Bedek de plaat met een heldere kleefstof en bewaar deze bij min 20 graden Celsius gedurende maximaal een week. Gebruik het verzamelde supernatant om een index-PCR uit te voeren om barcodes aan de adaptersequentie te hechten.
Zuiver vervolgens de producten en bereid de geïndexeerde bibliotheek voor voor sequencing. Bij muizen is bekend dat omgevingsverrijking de levensduur en tumorwondherstel verbetert. Om de rol van microbiota in dit fenotype te definiëren, werden kweekdieren minimaal een maand geïntegreerd in de muizenkolonie om het microbioom te normaliseren.
Vervolgens werden ze gekweekt en hun nakomelingen werden opgevoed in een verrijkte omgeving of een normale omgeving. De nakomelingen waren ook tumordragend of wild type. Na 16 weken werden de dieren geëuthanaseerd en werden
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor het beoordelen van de effecten van omgevingsverrijking (EE) op de biodiversiteit van het darmmicrobioom in een muismodel voor colontumoren. De methode legt de nadruk op het normaliseren van het microbioom voorafgaand aan de EE-interventie om de reproduceerbaarheid van het experiment te verbeteren en onderzoekt hoe EE de samenstelling van het microbioom beïnvloedt, in het bijzonder bij muizen met tumoren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Microbioomonderzoek
- Kankerbiologie
- Dierhouderij
- Moleculaire biologie
Achtergrond
- Omgevingsverrijking is aangetoond gunstig te zijn voor de uitkomsten van ziekten bij mensen en in diermodellen.
- EE kan tumorigenese verminderen en de overleving bij muizen verbeteren door immuunresponsen en wondherstel te moduleren.
- Het darmmicrobioom is betrokken bij de pathogenese van dikkedarmkanker, inflammatoire darmziekten, obesitas en diabetes.
- Normalisatie van het microbioom en zorgvuldige dierhouderij zijn essentieel voor reproduceerbare resultaten in microbioomstudies.
Doel van de studie
- Om een reproduceerbaar protocol te bieden voor het evalueren van de impact van EE op de diversiteit van het darmmicrobioom in een muismodel voor colontumoren.
- Om het belang aan te tonen van microbiome-normalisatie voorafgaand aan experimentele interventies.
- Om veranderingen in het microbiota te karakteriseren met behulp van 16S rDNA-sequencing na langdurige blootstelling aan EE.
Gebruikte methoden
- Inrichting van controle- en verrijkte omgevingen voor muizen, inclusief specifieke kooiopstellingen en verrijkingstools.
- Fokstrategieën om de genotypeverdeling en normalisatie van het microbioom te waarborgen.
- Afname van ontlastingsmonsters van zowel levende als geëuthanaseerde dieren onder steriele omstandigheden.
- Isolatie van bacterieel DNA uit ontlastingsmonsters met behulp van commerciële kits.
- Amplificatie van 16S rDNA via PCR, gevolgd door zuivering met magnetische beads en barcoding voor sequencing.
- Analyse van de samenstelling en biodiversiteit van het microbioom na sequencing.
Belangrijkste resultaten
- Omgevingsverrijking leidde tot een significante toename van de biodiversiteit van het microbioom bij tumordragende muizen, maar niet bij wildtype dieren.
- De toename in biodiversiteit was hoofdzakelijk toe te schrijven aan een hogere abundantie van Proteobacteria, in het bijzonder alphaproteobacteria en betaproteobacteria, met een afname van pathogene gammaproteobacteria.
- Het genus Sutterella, waarschijnlijk een commensaal, vertoonde de grootste toename binnen de betaproteobacteria.
- Correcte normalisatie van het microbioom en goede praktijken met betrekking tot de huisvesting verminderden storende variabelen en verbeterden de reproduceerbaarheid.
Conclusies
- Het protocol maakt een robuuste beoordeling mogelijk van de effecten van EE op het darmmicrobioom in ziektemodellen.
- Normalisatie van het microbioom voorafgaand aan de interventie is essentieel voor betrouwbare resultaten.
- Deze aanpak kan worden aangepast om de rol van het microbioom bij verschillende ziekten te bestuderen met behulp van muismodellen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Het normaliseren van het microbioom in preklinische muismodellen is cruciaal voor het verminderen van storende variabelen en het verbeteren van het voorspellende vertrouwen van studies naar omgevingsverrijking in oncologisch onderzoek. Deze methode maakt een robuuste beoordeling mogelijk van hoe omgevingsfactoren de diversiteit van het microbioom moduleren, wat direct van invloed is op de betrouwbaarheid van ziekte-relevante modellen en de ontdekking van translationele biomarkers. De integratie van protocollen voor microbioomnormalisatie en -verrijking versterkt de vroege ontdekking en portfoliotriage door de biologische mechanismen ten grondslag aan tumorprogressie te verduidelijken.
Strategische toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Maakt een rigoureuze analyse mogelijk van de rol van het microbioom bij tumorigenese en ziekteprogressie.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door te controleren voor omgevingsfactoren en microbiële confounders.
- Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij het koppelen van omgevingsverrijking aan effecten die door het immuunsysteem en het microbioom worden gemedieerd.
- Faciliteert functionele targetvalidatie in ziekterelevante muismodellen.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gestandaardiseerde diercohorten voor voor downstream microbiome- en immunologie-assays.
- Verbetert de reproduceerbaarheid en kwantitatieve output door gecontroleerde monstername en 16S rDNA-sequencing.
- Maakt een betrouwbare evaluatie mogelijk van microbiome-modulerende interventies in oncologie-pipelines.
- Ondersteunt de schaalbaarheid van assays en het hergebruik van platforms over meerdere ziektemodellen.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Rijmt preklinische modellen op menselijke ziekten door in te gaan op microbiome-gestuurde pathogenese.
- Zorgt voor continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie voor microbiome-gerichte therapieën.
- Maakt risico-gecorrigeerde beslissingen over voortgang mogelijk op basis van robuuste, reproduceerbare microbiome-gegevens.
- Ondersteunt de identificatie van translationele biomarkers die gekoppeld zijn aan omgevings- en microbiële modulatie.
Integratie van Pijplijn & Workflow
Dit protocol integreert in het continuüm van ontdekking naar preklinisch onderzoek door gestandaardiseerde microbioomcondities vast te stellen voorafgaand aan interventies met omgevingsverrijking in muistumormodellen.
- Ontdekkingsbiologie: Faciliteert hypothesetesten over interacties tussen het microbioom en de omgeving bij tumorigenese.
- Screening: Biedt reproduceerbare, kwantitatieve microbioom-uitlezingen voor het vergelijken van experimentele condities.
- Analytiek: Levert 16S rDNA-sequencinggegevens ter ondersteuning van statistische analyse van verschuivingen in microbiële diversiteit.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen preklinische bevindingen en menselijke ziekten door het modelleren van door het microbioom aangestuurde mechanismen.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Biedt een herbruikbare workflow die aanpasbaar is aan diverse ziekte-relevante muismodellen.
Operationele impact en impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in microbiome-oncologieonderzoek.
- Operationele waarde: Standaardiseert de dierenhouderij en monsterverwerking voor reproduceerbare resultaten.
- Strategische waarde: Informeert go/no-go-beslissingen en verhoogt de kapitaalefficiëntie door storende variabelen te minimaliseren.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogecorrigeerde prioritering van programma's voor microbiome-gerichte en omgevingsinterventies.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in dierhouderij, microbioomanalyse en moleculaire biologische technieken.
- Toegang tot steriele dierfaciliteiten, PCR-instrumentatie en sequencing-infrastructuur is noodzakelijk.
- Strikte standaardisatie van fok-, verrijkings- en monsternameprotocollen tussen teams is vereist.
- Aanpasbaar voor verschillende muisgenotypes en ziektemodellen, met aandacht voor kolonie-integratie en omgevingscontroles.
- Potentiële beperkingen omvatten stress-geïnduceerde verschuivingen in het microbioom en de noodzaak van zorgvuldig omgevingsbeheer.
