Name: Een uitgebreide Procedure voor de evaluatie van de prestaties In Vitro van de vermeende Hemangioblastoma Neovascularization met behulp van de kiemen Assay sferoïde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Leer de sferoïde-kiemassay evalueren voor hemangioblastoom-neovascularisatie in vitro. Deze methode onthult dat klassieke tumorangiogenese slechts een complementair mechanisme is.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door subsidies van de Shanghai Comité van wetenschap en technologie (15411951800, 15410723200). De auteurs bedank Prof. YuMei Wen en Prof. Chao Zhao van de pathogene micro-organismen departement van Fudan Universiteit voor hun technische bijstand.

Deze methode werd uitgevoerd overeenkomstig de goedgekeurde richtsnoeren en voorschriften van het onderzoek ethisch comité van Huashan ziekenhuis, Fudan Universiteit. Bijbehorende standaard veiligheidsmaatregelen werden gevolgd in elke stap. Voor een schematische presentatie, Zie Figuur 1.
1. cel cultuur en plasmide Construct
<ol><li>Regelmatig onderhouden de menselijke navelstreng ader endothelial cel (HUVEC) in Dulbecco gewijzigd van Eagle's medium (DMEM), aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 100 eenheid/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine in een bevochtigde 5% CO2 incubator bij 37 ° C.</li>
	<li>PLKO.1 van de Digest plasmide met ApaI en EcoRI voor de synthese van shRNA fragment. Zorg ervoor dat de volgorde van oligonucleotide van VHL shRNA vector CCGGGATCTGGAAGACCACCCAAATCTCGAGA TTTGGGTGGTCTTCCAGATCTTTTTG14.</li>
	<li>Meng vervolgens 20 µΜ systeem met voorwaartse 5 µL van oligo, 5 µL van omgekeerde oligo, 5 µL van 10 x NEB buffer en 35 µL van ddH2O samen (het totale volume is 50 µL). Verwarm het mengsel bij 98 ° C gedurende 4 min, en langzaam laat afkoelen tot kamertemperatuur in een paar uur.</li>
	<li>Het afbinden van de ontharde oligos en PLKO.1 plasmide samen met T4 ligase bij 4 ° C voor overnachting. 16 h later toevoegen 5 µL van afbinding mix in 25 µL bevoegde DH5α cellen. Vervolgens scherm de met succes ligaturen plasmiden, en controleer of het ingevoegde fragment door sequentiebepaling.</li>
</ol>2. lentivirus pakket en infectie
<ol><li>Meng 10 µg van de PLKO.1-shVHL of PLKO.1-shScramble-vector, 7,5 µg plasmide psPAX2 verpakking en 2,5 µg envelop plasmide pMD2.G in 500 µL van de DMEM media zonder foetale runderserum (FBS) gedurende 25 minuten in totaal.</li>
	<li>7 mLDMEM zonder FBS aan de oplossing bereid hierboven toevoegen.</li>
	<li>Cultuur 293FT cellen in de DMEM zonder FBS in een 10-cm doorsnede weefselkweek gerechten. Zorg ervoor dat het aantal 293FT cellen 1 x 107 met behulp van een cel-teller.</li>
	<li>Voeg 1 mL van de oplossing bereid boven aan het medium van 293FT cellen voor Transfectie. Opmerking: De cellijn 293FT is afgeleid van de cellijn van 293F en stabiel express het SV40 grote T antigeen. Daarom is het een geschikte gastheer voor de productie van de lentivirale.</li>
	<li>Het kweekmedium vervangen door de DMEM met 10% FBS na 6 uur.</li>
	<li>De media met behulp van een precisiepipet in 48 h na de Transfectie te verzamelen. Opmerking: Het virus bestaat in de DMEM met 10% FBS. De dode cellen drijven op het medium. Steriele membraan van 0,45 µm gebruiken voor het filteren van de dode cellen en onzuiverheden. In het algemeen is er geen behoefte om te controleren van de veelheid van infectie (MOI). Dit is om een stabiele cellen-lijn. Bij de laatste stap, zal alle levende cellen zonder succesvolle infectie sterven door puromycin. De shScramble group en de HUVEC cellen zijn de controlegroep. Zorg ervoor dat alle HUVEC cellen met de concentratie van de gebruikte puromycin door 72 h sterven. Elke goed heeft hetzelfde aantal cellen.</li>
	<li>Cultuur van de HUVEC cellen in de lentivirale media voor 72 uur. Dan, voeg puromycin aan de media van de HUVEC cellen in een concentratie van 2 µg/mL voor 24 h. gebruik HUVEC cellen zonder behandeling als de controlegroep. Ervoor zorgen dat alle controle cellen sterven door deze tijd. Opmerking: De levende cellen, vormen een stabiele cellijn van VHL vechtpartij cellen en shSramble cellen. De plating-dichtheid is 5.000 per putje in 96-wells-platen.</li>
</ol>3. productie van Endothelial cel spheroïden
<ol><li>Trypsinize van de HUVECs cellen en resuspendeer in het medium van de DMEM met 10% FBS. Met een matig aantal cellen in een schaal 10-cm cultuur, voeg 1 mL typsin-EDTA.</li>
	<li>Het zaad van de cellen in een 3D ronde-96-Wells bodemplaat, bij een celdichtheid van 1 × 103 cellen per putje. Gebruik een goed geschikt voor een sferoïde van 0,50 µL op te schorten de sferoïde. Cellen tellen met behulp van een cel teller systeem volgens de instructies van de fabrikant.</li>
	<li>Incubeer de cellen bij 37 ° C en 5% CO2 voortdurend voor 72 uur. Zorg ervoor dat de zwevende cellen de spheroïden cel automatisch vormen onder deze omstandigheden. Vervang de helft van het kweekmedium na 36 h.</li>
</ol>4. in vitro angiogenese Assay
<ol><li>Ontdooi de gel-oplossing bij 4 ° C en Verdun het met het medium van de verminderde serum met een onderlinge verdunningsverhouding 1:5.</li>
	<li>De spheroïden van het DMEM-kweekmedium met een micropipet te zuigen. Na het wassen schorsen de spheroïden met 5 mL van de verminderde serum medium, de spheroïden zachtjes en voorzichtig in de verdunde gel. Ervoor zorgen dat er geen luchtbellen.</li>
	<li>300 µL van gemengde vloeistof in een 15-well-plate insluiten. Na incubatie bij 37 ° C en 5% CO2 voor 1 h, toevoegen 400 µL het verminderde serum medium aan elk putje. Het vullen van steriel water rond de putten voor het genereren van een bevochtigde omgeving om verdamping in de weg staan.</li>
	<li>Daarna cultuur de plaat bij 37 ° C in 5% CO2 op 100% vochtigheid gedurende 1 uur.</li>
	<li>Zorgvuldig de oud medium gecombineerd en vervang deze door 600 µL van verminderde serum medium met 1% endothelial cel groei supplementen in elk putje.</li>
	<li>Na 12 h of 24 h, nemen beelden onder een omgekeerde licht microscope (40 *).</li>
</ol>5. de gegevensanalyse
<ol><li>De afbeeldingen uploaden naar een online imago analyse platform om het verkrijgen van gegevens van de lengte van de stronk (Tabel van materialen).</li>
	<li>Maak een account per e-mail op de webpagina.</li>
	<li>Vervolgens uploaden de beelden door te klikken op de knop ' uploaden '.</li>
	<li>Download het resultaat door te klikken op de downloadknop. Opmerking: De software genereert u de bewerkte afbeelding en de gegevens. De gegevens bevatten vijf delen: cumulatieve sprout lengte, gemiddelde sprout de lengte, de standaarddeviatie van sprout lengte, sprout gebied en sferoïde gebied. In het verwerkte beeld, wordt elke parameter beschreven in een andere kleur te verlichten identificatie in de bewerkte afbeelding: rode vertegenwoordigt spruiten skelet, het aantal spruiten geel, blauw de stronk structuur, witte stronk einde en oranje sferoïde.</li>
</ol>

<ol><li>Lonser, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0140673603136434">von Hippel-Lindau disease.</a> Lancet. 361 (9374), 2059-2067 (2003).</li>
<li>Hussein, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+capillary+haemangioblastoma%3A+the+pathologist%27s+viewpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Central nervous system capillary haemangioblastoma: the pathologist's viewpoint.</a> Int J Exp Pathol. 88 (5), 311-324 (2007).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemangioblastomas+might+derive+from+neoplastic+transformation+of+neural+stem+cells%2Fprogenitors+in+the+specific+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Hemangioblastomas might derive from neoplastic transformation of neural stem cells/progenitors in the specific niche.</a> Carcinogenesis. 32 (1), 102-109 (2011).</li>
<li>Zhuang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+derived+vasculogenesis+in+von+Hippel-Lindau+disease-associated+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Tumor derived vasculogenesis in von Hippel-Lindau disease-associated tumors.</a> Sci Rep. 4, 4102(2014).</li>
<li>Glasker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VHL-deficient+vasculogenesis+in+hemangioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">VHL-deficient vasculogenesis in hemangioblastoma.</a> Exp Mol Pathol. 96 (2), 162-167 (2014).</li>
<li>Wizigmann-Voos, S., Breier, G., Risau, W., Plate, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+vascular+endothelial+growth+factor+and+its+receptors+in+von+Hippel-Lindau+disease-associated+and+sporadic+hemangioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas.</a> Cancer Res. 55 (6), 1358-1364 (1995).</li>
<li>Cancilla, P. A., Zimmerman, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+structure+of+a+cerebellar+hemangioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The fine structure of a cerebellar hemangioblastoma.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 24 (4), 621-628 (1965).</li>
<li>Kawamura, J., Garcia, J. H., Kamijyo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+hemangioblastoma%3A+histogenesis+of+stroma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Cerebellar hemangioblastoma: histogenesis of stroma cells.</a> Cancer. 31 (6), 1528-1540 (1973).</li>
<li>Jurco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemangioblastomas%3A+histogenesis+of+the+stromal+cell+studied+by+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hemangioblastomas: histogenesis of the stromal cell studied by immunocytochemistry.</a> Hum Pathol. 13 (1), 13-18 (1982).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+tumorigenic+cells+and+implication+of+their+aberrant+differentiation+in+human+hemangioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of tumorigenic cells and implication of their aberrant differentiation in human hemangioblastomas.</a> Cancer Biol Ther. 12 (8), 727-736 (2011).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD41+and+CD45+expression+marks+the+angioformative+initiation+of+neovascularisation+in+human+haemangioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour+Biol%22%5BJournal%5D)">CD41 and CD45 expression marks the angioformative initiation of neovascularisation in human haemangioblastoma.</a> Tumour Biol. 37 (3), 3765-3774 (2016).</li>
<li>Sharifpanah, F., Sauer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Spheroid-Based+Sprout+Assay+in+Three-Dimensional+Fibrin+Scaffold%3A+A+Novel+In+Vitro+Model+for+the+Study+of+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Spheroid-Based Sprout Assay in Three-Dimensional Fibrin Scaffold: A Novel In Vitro Model for the Study of Angiogenesis.</a> Methods Mol Biol. 1430, 179-189 (2016).</li>
<li>Cai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNA+taurine+upregulated+1+enhances+tumor-induced+angiogenesis+through+inhibiting+microRNA-299+in+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNA taurine upregulated 1 enhances tumor-induced angiogenesis through inhibiting microRNA-299 in human glioblastoma.</a> Oncogene. 36 (3), 318-331 (2017).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Conveniently+Screening+pLKO.1-TRC+Vector+Tagged+with+TurboGFP%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Biochem+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Construction of Conveniently Screening pLKO.1-TRC Vector Tagged with TurboGFP.</a> Appl Biochem Biotechnol. 181 (2), 699-709 (2017).</li>
<li>Laib, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-based+human+endothelial+cell+microvessel+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1202-1215 (2009).</li>
<li>D'Alessio, A., Moccia, F., Li, J. H., Micera, A., Kyriakides, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+and+Vasculogenesis+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis and Vasculogenesis in Health and Disease.</a> Biomed Res Int. 2015, 126582(2015).</li>
<li>Finkenzeller, G., Graner, S., Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Stark, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+in+vivo+vasculogenic+potential+of+endothelial+progenitor+cells+in+comparison+to+human+umbilical+vein+endothelial+cells+in+a+spheroid-based+implantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Impaired in vivo vasculogenic potential of endothelial progenitor cells in comparison to human umbilical vein endothelial cells in a spheroid-based implantation model.</a> Cell Prolif. 42 (4), 498-505 (2009).</li>
<li>Morin, K. T., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+angiogenesis+and+vasculogenesis+in+fibrin+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro models of angiogenesis and vasculogenesis in fibrin gel.</a> Exp Cell Res. 319 (16), 2409-2417 (2013).</li>
<li>Blacher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+invasion+in+the+spheroid+sprouting+assay%3A+a+spatial+organisation+analysis+adaptable+to+cell+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell invasion in the spheroid sprouting assay: a spatial organisation analysis adaptable to cell behaviour.</a> PLoS One. 9 (5), 97019(2014).</li>
<li>Straume, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+heat+shock+protein+27+induces+long-term+dormancy+in+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Suppression of heat shock protein 27 induces long-term dormancy in human breast cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (22), 8699-8704 (2012).</li>
<li>Naumov, G. N., Akslen, L. A., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+angiogenesis+in+human+tumor+dormancy%3A+animal+models+of+the+angiogenic+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Role of angiogenesis in human tumor dormancy: animal models of the angiogenic switch.</a> Cell Cycle. 5 (16), 1779-1787 (2006).</li>
<li>Naumov, G. N., Folkman, J., Straume, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+dormancy+due+to+failure+of+angiogenesis%3A+role+of+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Tumor dormancy due to failure of angiogenesis: role of the microenvironment.</a> Clin Exp Metastasis. 26 (1), 51-60 (2009).</li>
<li>Wang, Y., Yang, J., Du, G., Ma, D., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+respond+to+cerebral+ischemia+without+susceptibility+to+HB-tumorigenesis+in+VHL+heterozygous+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects respond to cerebral ischemia without susceptibility to HB-tumorigenesis in VHL heterozygous knockout mice.</a> Mol Carcinog. 56 (10), 2342-2351 (2017).</li>
<li>Stratmann, R., Krieg, M., Haas, R., Plate, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+control+of+angiogenesis+in+hemangioblastomas+by+the+von+Hippel-Lindau+tumor+suppressor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Putative control of angiogenesis in hemangioblastomas by the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 56 (11), 1242-1252 (1997).</li>
<li>Correa de Sampaio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heterogeneous+in+vitro+three+dimensional+model+of+tumour-stroma+interactions+regulating+sprouting+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis.</a> PLoS One. 7 (2), 30753(2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Meerdere velden van vasculaire biologie onderzoek werden onlangs, gestimuleerd door de studie van de angiogenic endotheel15. In dit artikel, ontwikkelden we een endothelial sferoïde kiemen techniek als een experimenteel model om te bestuderen van de vorming van het vaartuig dat afkomstig van het VHL-gen verlies van functie in gemanipuleerde endotheliale cellen is te identificeren van nieuwe kandidaat-moleculen van de angiogenic cascade. Tot de beste van onze kennis is dit het eerste verslag het an...

Hemangioblastomas (HBs) zijn goedaardige vasculaire tumoren die uitsluitend binnen het menselijk zenuwstelsel (CNS) worden gevonden. Zij ontwikkelen bij patiënten met de ziekte van von Hippel-Lindau (VHL) of sporadische laesies. VHL-HBs zijn moeilijk te genezen door middel van de chirurgische behandeling als gevolg van de frequente herhaling en meerdere letsels die het gevolg zijn van deze genetische wanorde1. Hoewel de inactivering van het VHL tumor suppressor gen is beschouwd als de oorzaak van de tumorigenesis van VHL-HBs, blijven de cytologische oorsprong (met inbegrip van neovascularization) en het evolutieproces van HBs grotendeels controversiële2. Dus, een beter begrip van HB-neovascular biologische mechanismen kan voorzien nuttige inzichten in de strategieën van de meest veelbelovende anti-vasculaire VHL-HBs.
Recent onderzoek heeft gesuggereerd dat HB-neovascularization vergelijkbaar met de embryologic vasculogenese3,4,5 is. Klassieke vasculaire endotheliale-groeifactor (VEGF)-gemedieerde angiogenese die afkomstig is van het vasculaire endotheel en die wordt aangestuurd door VHL verlies van functie resulteerde in proliferatie en neovascular formatie, die is6uitgedaagd. In 1965, Cancilla en Zimmerman gevonden, met behulp van elektronenmicroscopie, die HBs afkomstig van het endotheel-7 zijn. Later bleek dat stromale cellen zijn afgeleid van vasoformative element8. In 1982 vonden Jurco et al. dat stromale cellen van endothelial oorsprong9. Dus veronderstelde we dat menselijke vasculaire endotheliale cellen de oorspronkelijke cellen van HB-neovascularization10 zijn. Hoewel het is beter om het gebruik van de primaire culturen uit HB-cellen afgeleid van VHL patiënten chirurgische ingrepen, onze vorige onderzoek aangegeven dat primaire culturen van HB niet stabiel zijn, en cellijnen gevestigde3niet kon worden. Bovendien, de primaire culturen in de 3D-omgeving kunnen niet identificeren de cytologische oorsprong van HB-neovascularization omdat zij de progenitoren van HB-vasculaire ingrediënten10,11 omvatten. Daarom, als een primitieve en klassieke model van endotheliale cellen, kunnen menselijke vasculaire endotheliale cellen (HUVEC) dienen als een alternatief cellulaire model voor HBs.
De gekiemde assay sferoïde is een nieuw model in weefsel engineering12,13. In deze paper, een 3D collageen gebaseerde coculture systeem in vitro met behulp van de sferoïde kiemen assay werd ontwikkeld, met een algemene doelstelling om te evalueren of klassieke tumor angiogenese in HBs, evenals zijn rol in de HBs bestaat.

<table><tbody><tr><td>human umbilical vein endothelial cell</td><td>Fudan IBS Cell Center</td><td>FDCC-HXN180</td><td></td></tr><tr><td>dulbecco&rsquo;s modified eagle&rsquo;s medium&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11995040</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>&nbsp;26400044</td><td></td></tr><tr><td>PLKO.1-puro vector</td><td>Addgene</td><td>#8453</td><td></td></tr><tr><td>packing plasmid psPAX2&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>#12260</td><td></td></tr><tr><td>envelope plasmid pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td></td></tr><tr><td>3D round-bottom 96-well plates</td><td>S-Bio</td><td>MS-9096M</td><td></td></tr><tr><td>matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM medium</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>reduced serum medium&nbsp;</td></tr><tr><td>15-well plate</td><td>Ibidi</td><td>81501</td><td>Luchtbellen in de gel kunnen worden verminderd door de &mu;&ndash;Slide angiogenesis voor gebruik de nacht ervoor in de incubator te plaatsen</td></tr><tr><td>endothelial cell growth supplements</td><td>Sciencell</td><td>#1052</td><td></td></tr><tr><td>10-cm culture dish</td><td>Corning</td><td>Scipu000813</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>typsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Automated Cell Counter System &nbsp;</td><td>BioTech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Analysis software&nbsp;</td><td>Winmasis</td><td></td><td>http://mywim.wimasis.com&nbsp;</td></tr></tbody></table>

een uitgebreide procedure voor de evaluatie van de prestaties in vitro van de vermeende hemangioblastoma neovascularization met behulp van de kiemen assay sferoïde

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

De inactivering van het von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gen speelt een cruciale rol in de ontwikkeling van de hemangioblastomas (HBs) binnen het menselijk zenuwstelsel (CNS). Echter zowel de cytologische oorsprong en het evolutieproces van HBs (inclusief neovascularization) blijven omstreden, en anti-angiogenese voor VHL-HBs, gebaseerd op de klassieke HB angiogenese, teleurstellende resultaten in de klinische proeven hebben opgeleverd. Een belangrijke belemmering voor de succesvolle klinische vertaling van anti-vasculaire behandeling is het ontbreken van een grondige kennis van neovascularization in deze vasculaire tumor. In dit artikel presenteren we een uitgebreide procedure om te evalueren in vitro of klassieke tumor angiogenese in HBs, evenals zijn rol in de HBs bestaat. Met deze procedure, kunnen onderzoekers nauwkeurig begrijpen de complexiteit van HB neovascularization en identificeren van de functie van deze gemeenschappelijke vorm van angiogenese in HBs. Deze protocollen kunnen worden gebruikt om de meest veelbelovende anti-vasculaire therapie voor tumoren, die hoge translationeel potentieel tumoren behandeling of heeft voor medeplichtigheid in de optimalisatie van de anti-angiogenic behandeling van HBs voortaan vertalingen evalueren. De resultaten wijzen op de complexiteit van HB neovascularization en suggereren dat dit gemeenschappelijk formulier angiogenese slechts een aanvullende mechanisme in HB neovascularization is.

Originele beelden zijn genomen door omgekeerde lichte Microscoop. De typische beelden van de controlegroep en de groep VHL zijn afgebeeld in Figuur 2-A1 en Figuur 2-A2. De gekiemde lengte van de controlegroep is korter dan die van de VHL-groep.
Na het uploaden van de beelden, biedt het online platform rechtstreeks analyseresultaten. De ...

Dit artikel presenteert een uitgebreide procedure om te evalueren in vitro of klassieke tumor angiogenese in hemangioblastomas (HBs) en haar rol in de HBs bestaat. De resultaten wijzen op de complexiteit van de HB-neovascularization en suggereren dat deze gemeenschappelijke vorm van angiogenese slechts een aanvullende mechanisme in de HB-neovascularization is.

Een uitgebreide Procedure voor de evaluatie van de prestaties In Vitro van de vermeende Hemangioblastoma Neovascularization met behulp van de kiemen Assay sferoïde

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

Het algemene doel van dit experiment is om de prestaties van de vermeende hemangioblastoma neovascularisatie te evalueren met behulp van de spheroid sprouting assay in vitro. De methode kan helpen om de belangrijkste vragen in het angiogeneseveld te beantwoorden, zoals tumorangiogenese. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de product is van een uitgebreide procedure om in vitro te evalueren waar de klassieke tumorangiogenese bestaat in hemangioblastoma en het groeit in hemangioblastoma.De implicatie van deze techniek strekt zich uit naar therapie van hemangioblastumor en vaatwerk omdat het resultaat de complexiteit van hemangioblastumor neovascularisatie benadrukt, en dat suggereert dat deze veelvoorkomende vorm van angiogenese slechts een complementair mechanisme is. Dus deze methode kan inzicht bieden in de studie van hemangioblastumor neovascularisatie. Het kan ook worden toegepast op tumoren, angiogenese en vaatvorming gerelateerde toepassingen in sommige solide tumoren, zoals tumor vasculogeen mimicry in glastumor.Echte demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de generatie van deze gemanipuleerde endotheliale celsferoïde-stappen moeilijk te leren is. Omdat de geschikte omstandigheden belangrijk zijn. Eerst, kweek de HUVEC endotheliale cellen in DMEM-kweekmedium aangevuld met tien procent foetaal runderserum, penicilline en streptomycine.Bewaar vervolgens de cultuur in de incubator bij 37 graden Celsius met vijf procent koolstofdioxide. Vervolgens, om het shRNA-fragment te synthetiseren, verteer de plasmide met ApaI en EcoRI restrictie-enzymen. Voeg vervolgens aan het verteerde plasmide zowel de voorwaartse en achterwaartse oligo's, 10x NEB-buffer en dubbel gedestilleerd water toe tot een eindvolume van 50 microliters.Na het toevoegen van alle reagentia, verhit het mengsel gedurende vier minuten tot 98 graden Celsius. Koel vervolgens geleidelijk af tot kamertemperatuur in een periode van enkele uren. Gebruik T4 ligase om de geannealde oligo's en de plasmide te lijmen.Incubeer de buis gedurende een nacht bij vier graden Celsius. De volgende dag, voeg vijf microliters ligatiemix toe aan 25 microliters DH5alpha competente cellen. Voeg in 500 microliters DMEM-medium de lentivirale vector of de scrambled vector toe, samen met andere verpakkingsplasmiden.Vervolgens, incubeer het lentivirale mengsel gedurende 25 minuten bij 37 graden Celsius. Na incubatie, voeg 7 milliliter van het DMEM-medium toe aan de scrambled of lentivirale gemengde oplossing. Kweek de 293FT-cellen in DMEM-medium zonder foetaal runderserum in een 10 centimeter kweekschaal.Voeg een milliliter van de lentivirale of scrambled oplossing toe aan de 293FT-cellen in de kweekschaal. Na zes uur, zuig het oude medium uit de kweekschaal. Vervolgens, vervang het oude medium door vers DMEM-medium met 10 procent foetaal runderserum.Na 48 uur, verzamel het medium. Breng de HUVEC endotheliale cellen in het lentivirale medium over en laat ze 72 uur staan. Voeg vervolgens twee microgram per milliliter puromycine toe aan het HUVEC-cellencultuurmedium.Ten slotte, incubeer de cultuur nog eens 24 uur. De volgende dag, voeg een milliliter trypsine EDTA toe om HUVEC-cellen te trypsiniseren. Daarna, resuspendeer de trypsiniseerde celsuspensie in DMEM-medium met 10 procent foetaal runderserum.Tel het aantal cellen met behulp van een celteller. Na het tellen, zaai de cellen in een 3D ronde bodem 96-well plaat. Na het zaaien, incubeer de cellen gedurende 72 uur continu bij 37 graden Celsius met vijf procent koolstofdioxide.Na 36 uur, vervang de helft van het kweekmedium door vers medium. Ontdooi eerst de geloplossing bij vier graden Celsius en verdun het vervolgens in een verhouding van een op vijf met het verminderde serummedium. Zuig de sferoïden uit het DMEM-medium met behulp van een micropipet.Was vervolgens de sferoïden met vijf milliliters verminderd serummedium. Breng voorzichtig de gesuspendeerde sferoïden en de verdunde gel over. In een 15-well plaat, bedden 300 microlitters van de gemengde vloeistof van sferoïden en verdunde gel.Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius en vijf procent koolstofdioxide gedurende een uur. Voeg vervolgens 400 microliters verminderd serummedium toe aan een enkele well. Om verdamping te voorkomen, vul de omgeving van de well met steriel water.Vervolgens, kweek de cellen bij 37 graden Celsius, vijf procent koolstofdioxide en 100 procent vochtigheid gedurende een uur. Na de incubatie, zuig het oude medium af en voeg 600 microliters verminderd serummedium met een procent endotheelcelgroeisupplement toe aan de well en incubeer gedurende een dag. Maak foto's met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop.Hier wordt het sferoïde uitlopen van de cellen vastgelegd met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop om het effect van VHL-gensilencing op het angiogeen potentieel van de endotheelcellen te bestuderen. Een sferoïde wordt gezien die 12 uur na lentivirale behandeling ontspruit in zowel de controle als VHL-gesilenceerde endotheliale cellen. Vervolgens wordt statistische analyse uitgevoerd om de lengte van de uitlopers die worden gegenereerd door de VHL-gen gesilenceerde sferoïden te kwantificeren.De gemiddelde spruitlengte lijkt ongeveer 125 micrometer te zijn in de VHL-gesilenceerde groepen, terwijl deze slechts ongeveer 65 micrometer is in de controlegroep. De gemiddelde cumulatieve spruitlengte van de VHL-gesilenceerde groep is ongeveer 1250 micrometer, terwijl die van de controlegroep 680 micrometer is. Deze resultaten wijzen op een tweevoudige spruitlengtetoename in de VHL-gesilenceerde groepen.Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in 48 uur worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd. Volgens deze procedure en methode zoals capillaire formatie-assay kan worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden. Zoals het onder

a-comprehensive-procedure-to-evaluate-vitro-performance-putative

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Invasie van omliggende normale weefsels is een typerend kenmerk van kwaadaardige tumoren. We bieden hier een eenvoudige, semi-geautomatiseerde microplaattest van invasie in een natuurlijke 3D biomatrix die met een aantal modellen van gevorderde menselijke kankers is geëxemplifeerd.

Driedimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Het protocol wordt beschreven hoe een perfusable vasculaire netwerk in een sferoïde ingenieur. Van de sferoïde omliggende communicatie is bedacht om te induceren angiogenese en de sferoïde verbinden met de microchannels in een microfluidic apparaat. De methode staat de perfusie van het sferoïde, die een langverwachte techniek in driedimensionale culturen is.

Perfusable vasculaire netwerk met een Model van het weefsel in een Microfluidic-apparaat

Dit protocol presenteert een kraal roman in vitro assay dat meer modellen op de juiste wijze het proces van in vivo angiogenese kiemen door pericytes op te nemen. Deze wijziging maakt het mogelijk de bepaling van de kraal te recapituleren meer getrouw de heterotypic cellulaire interacties tussen endotheliale cellen en muurschildering cellen die essentieel zijn voor angiogenese.

Integratie van Pericytes in een parel van de Endothelial cel kiemen Assay

Deze methode beschrijft de cultuur van door IPSC afkomstige endotheliale cellen als 40 geperfundeerd 3D Micro vaten in een gestandaardiseerd microfluïdisch platform. Dit platform maakt de studie mogelijk van gradiënt-gedreven angiogene kiemen in 3D, inclusief anastomose en stabilisatie van de angiogene spruiten op een schaalbare en hoge doorvoer wijze.

Gestandaardiseerde en schaalbare assay voor het bestuderen van Perfused 3D-angiogene kiemen van door iPSC afgeleide endotheliale cellen in vitro

Driedimensionaal co-Culture spheroid-systeem voor angiogenese is ontworpen om de fysiologische angiogenese na te bootsen. Co-Culture sferoïden worden gevormd door twee humane vasculaire celprecursoren, ecfcs en MSCS, en ingebed in collageen gel. Het nieuwe systeem is effectief voor het evalueren van angiogene modulatoren en verschaft relevantere informatie aan de in vivo studie.

Driedimensionaal angiogenese-assay systeem met co-Culture Spheroids gevormd door endotheliale kolonie vormende cellen en mesenchymale stamcellen

Dit protocol presenteert choroïde kiemen test, een ex vivo model van microvasculaire proliferatie. Deze test kan worden gebruikt om trajecten die betrokken zijn bij het verspreiden van choroidale microvaten te beoordelen en te beoordelen drug behandelingen met behulp van wilde type en genetisch gemodificeerd muisweefsel.

Een Ex Vivo Choroid Sprouting Assay van Oculaire Microvasculaire Angiogenese

Deze test maakt gebruik van embryonale stamcellen van muizen gedifferentieerd in embryoïde lichamen gekweekt in 3D-collageengel om de biologische processen te analyseren die kiemende angiogenese in vitro beheersen. De techniek kan worden toegepast voor het testen van medicijnen, het modelleren van ziekten en voor het bestuderen van specifieke genen in de context van deleties die embryonaal dodelijk zijn.

In vitro Driedimensionale kiemtest van angiogenese met behulp van embryonale stamcellen van muizen voor vaatziektemodellering en drugstests

Kruisverwijzing tussen borstepitheelcellen en endotheelcellen draagt belangrijk bij aan de progressie van borstkanker, tumorgroei en metastase. In deze studie zijn sferoïden gemaakt van borstkankercellen samen met vasculaire en / of lymfatische endotheelcellen en tonen hun toepasbaarheid aan als een in vitro systeem voor borstkankeronderzoek.

Mammary Epitheliale en Endotheelcel Sferoïden als een potentieel functioneel in vitro model voor borstkankeronderzoek

Hier presenteren we een protocol dat snelle, robuuste en goedkope fabricage van tumorsferoïden mogelijk maakt, gevolgd door hydrogel-inkapseling. Het is breed toepasbaar omdat er geen gespecialiseerde apparatuur voor nodig is. Het zou met name nuttig zijn voor het onderzoeken van sferoïde-matrixinteracties en het bouwen van in vitro weefselfysiologische of pathologiemodellen.

Fabricage en inkapseling van tumorsferoïden in polyethyleenglycolhydrogels voor het bestuderen van sferoïde-matrixinteracties

Deze studie presenteert de tweedimensionale (2D) kraswondmigratietest en de driedimensionale (3D) sferoïde kiemtest, samen met hun respectievelijke stroomafwaartse analysemethoden, waaronder RNA-extractie en immunocytochemie, als geschikte tests om angiogenese in vitro te bestuderen.

Onderzoek naar angiogenese op functioneel en moleculair niveau door gebruik te maken van de Scratch Wound Migration Assay en de Spheroid Sprouting Assay

Leer de sferoïde-kiemassay evalueren voor hemangioblastoom-neovascularisatie in vitro. Deze methode onthult dat klassieke tumorangiogenese slechts een complementair mechanisme is.

Een uitgebreide Procedure voor de evaluatie van de prestaties In Vitro van de vermeende Hemangioblastoma Neovascularization met behulp van de kiemen Assay sferoïde (Video) | JoVE Journal

Een uitgebreide Procedure voor de evaluatie van de prestaties In Vitro van de vermeende Hemangioblastoma Neovascularization met behulp van de kiemen Assay sferoïde

Meer video's verkennen