Een uitgebreide Procedure voor de evaluatie van de prestaties In Vitro van de vermeende Hemangioblastoma Neovascularization met behulp van de kiemen Assay sferoïde
April 12th, 2018
Dit artikel presenteert een uitgebreide procedure om te evalueren in vitro of klassieke tumor angiogenese in hemangioblastomas (HBs) en haar rol in de HBs bestaat. De resultaten wijzen op de complexiteit van de HB-neovascularization en suggereren dat deze gemeenschappelijke vorm van angiogenese slechts een aanvullende mechanisme in de HB-neovascularization is.
Het algemene doel van dit experiment is om de prestaties van de vermeende hemangioblastoma neovascularisatie te evalueren met behulp van de spheroid sprouting assay in vitro. De methode kan helpen om de belangrijkste vragen in het angiogeneseveld te beantwoorden, zoals tumorangiogenese. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de product is van een uitgebreide procedure om in vitro te evalueren waar de klassieke tumorangiogenese bestaat in hemangioblastoma en het groeit in hemangioblastoma.
De implicatie van deze techniek strekt zich uit naar therapie van hemangioblastumor en vaatwerk omdat het resultaat de complexiteit van hemangioblastumor neovascularisatie benadrukt, en dat suggereert dat deze veelvoorkomende vorm van angiogenese slechts een complementair mechanisme is. Dus deze methode kan inzicht bieden in de studie van hemangioblastumor neovascularisatie. Het kan ook worden toegepast op tumoren, angiogenese en vaatvorming gerelateerde toepassingen in sommige solide tumoren, zoals tumor vasculogeen mimicry in glastumor.
Echte demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de generatie van deze gemanipuleerde endotheliale celsferoïde-stappen moeilijk te leren is. Omdat de geschikte omstandigheden belangrijk zijn. Eerst, kweek de HUVEC endotheliale cellen in DMEM-kweekmedium aangevuld met tien procent foetaal runderserum, penicilline en streptomycine.
Bewaar vervolgens de cultuur in de incubator bij 37 graden Celsius met vijf procent koolstofdioxide. Vervolgens, om het shRNA-fragment te synthetiseren, verteer de plasmide met ApaI en EcoRI restrictie-enzymen. Voeg vervolgens aan het verteerde plasmide zowel de voorwaartse en achterwaartse oligo's, 10x NEB-buffer en dubbel gedestilleerd water toe tot een eindvolume van 50 microliters.
Na het toevoegen van alle reagentia, verhit het mengsel gedurende vier minuten tot 98 graden Celsius. Koel vervolgens geleidelijk af tot kamertemperatuur in een periode van enkele uren. Gebruik T4 ligase om de geannealde oligo's en de plasmide te lijmen.
Incubeer de buis gedurende een nacht bij vier graden Celsius. De volgende dag, voeg vijf microliters ligatiemix toe aan 25 microliters DH5alpha competente cellen. Voeg in 500 microliters DMEM-medium de lentivirale vector of de scrambled vector toe, samen met andere verpakkingsplasmiden.
Vervolgens, incubeer het lentivirale mengsel gedurende 25 minuten bij 37 graden Celsius. Na incubatie, voeg 7 milliliter van het DMEM-medium toe aan de scrambled of lentivirale gemengde oplossing. Kweek de 293FT-cellen in DMEM-medium zonder foetaal runderserum in een 10 centimeter kweekschaal.
Voeg een milliliter van de lentivirale of scrambled oplossing toe aan de 293FT-cellen in de kweekschaal. Na zes uur, zuig het oude medium uit de kweekschaal. Vervolgens, vervang het oude medium door vers DMEM-medium met 10 procent foetaal runderserum.
Na 48 uur, verzamel het medium. Breng de HUVEC endotheliale cellen in het lentivirale medium over en laat ze 72 uur staan. Voeg vervolgens twee microgram per milliliter puromycine toe aan het HUVEC-cellencultuurmedium.
Ten slotte, incubeer de cultuur nog eens 24 uur. De volgende dag, voeg een milliliter trypsine EDTA toe om HUVEC-cellen te trypsiniseren. Daarna, resuspendeer de trypsiniseerde celsuspensie in DMEM-medium met 10 procent foetaal runderserum.
Tel het aantal cellen met behulp van een celteller. Na het tellen, zaai de cellen in een 3D ronde bodem 96-well plaat. Na het zaaien, incubeer de cellen gedurende 72 uur continu bij 37 graden Celsius met vijf procent koolstofdioxide.
Na 36 uur, vervang de helft van het kweekmedium door vers medium. Ontdooi eerst de geloplossing bij vier graden Celsius en verdun het vervolgens in een verhouding van een op vijf met het verminderde serummedium. Zuig de sferoïden uit het DMEM-medium met behulp van een micropipet.
Was vervolgens de sferoïden met vijf milliliters verminderd serummedium. Breng voorzichtig de gesuspendeerde sferoïden en de verdunde gel over. In een 15-well plaat, bedden 300 microlitters van de gemengde vloeistof van sferoïden en verdunde gel.
Incubeer de plaat bij 37 graden Celsius en vijf procent koolstofdioxide gedurende een uur. Voeg vervolgens 400 microliters verminderd serummedium toe aan een enkele well. Om verdamping te voorkomen, vul de omgeving van de well met steriel water.
Vervolgens, kweek de cellen bij 37 graden Celsius, vijf procent koolstofdioxide en 100 procent vochtigheid gedurende een uur. Na de incubatie, zuig het oude medium af en voeg 600 microliters verminderd serummedium met een procent endotheelcelgroeisupplement toe aan de well en incubeer gedurende een dag. Maak foto's met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop.
Hier wordt het sferoïde uitlopen van de cellen vastgelegd met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop om het effect van VHL-gensilencing op het angiogeen potentieel van de endotheelcellen te bestuderen. Een sferoïde wordt gezien die 12 uur na lentivirale behandeling ontspruit in zowel de controle als VHL-gesilenceerde endotheliale cellen. Vervolgens wordt statistische analyse uitgevoerd om de lengte van de uitlopers die worden gegenereerd door de VHL-gen gesilenceerde sferoïden te kwantificeren.
De gemiddelde spruitlengte lijkt ongeveer 125 micrometer te zijn in de VHL-gesilenceerde groepen, terwijl deze slechts ongeveer 65 micrometer is in de controlegroep. De gemiddelde cumulatieve spruitlengte van de VHL-gesilenceerde groep is ongeveer 1250 micrometer, terwijl die van de controlegroep 680 micrometer is. Deze resultaten wijzen op een tweevoudige spruitlengtetoename in de VHL-gesilenceerde groepen.
Eenmaal onder de knie, kan deze techniek in 48 uur worden uitgevoerd als deze correct wordt uitgevoerd. Volgens deze procedure en methode zoals capillaire formatie-assay kan worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden. Zoals het onder
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie evalueert de neovascularisatie van hemangioblastoma's (HB's) met behulp van een in vitro spheroïd uitlopers assay. De bevindingen suggereren dat klassieke tumor angiogenese een complementair mechanisme is in HB-neovascularisatie.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Oncologie
- Angiogenesis
Achtergrond
- Hemangioblastoma's zijn vasculaire tumoren geassocieerd met complexe neovascularisatie.
- Begrip van angiogenese in HB's is cruciaal voor therapeutische vooruitgang.
- Klassieke tumor angiogenese kan een rol spelen in HB-ontwikkeling.
- In vitro assays kunnen inzichten bieden in tumor vasculaire mechanismen.
Doel van het onderzoek
- Om de rol van klassieke tumor angiogenese in hemangioblastoma's te beoordelen.
- Om de spheroïd uitlopers assay te gebruiken voor het evalueren van neovascularisatie.
- Om implicaties voor hemangioblastoma therapie te verkennen.
Gebruikte methoden
- Spheroïd uitlopers assay om neovascularisatie te evalueren.
- In vitro technieken om angiogenese mechanismen te beoordelen.
- Vergelijkende analyse van klassieke angiogenese in HB's.
- Evaluatie van therapeutische implicaties op basis van bevindingen.
Belangrijkste resultaten
- Klassieke tumor angiogenese bestaat in hemangioblastoma's.
- Neovascularisatie in HB's is complex en multifactorieel.
- Klassieke angiogenese is een complementair mechanisme in HB-ontwikkeling.
- De verkregen inzichten kunnen toekomstige therapeutische strategieën informeren.
Conclusies
- De studie verbetert het begrip van hemangioblastoma neovascularisatie.
- Klassieke angiogenese draagt bij aan, maar drijft de HB-ontwikkeling niet alleen aan.
- Verder onderzoek is nodig om therapeutische toepassingen te verkennen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding the mechanistic contribution of classic tumor angiogenesis to hemangioblastoma neovascularization supports target validation in vascular tumor research. The spheroid sprouting assay provides quantitative, reproducible readouts that enable preclinical de-risking of angiogenic pathways. This assay aids in prioritizing therapeutic strategies by distinguishing primary from complementary angiogenic mechanisms in solid tumors.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the role of VHL gene silencing in modulating endothelial angiogenic potential.
- Operational Value: Enables functional validation of putative angiogenic targets using a controlled in vitro system.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by quantifying sprouting dynamics under genetic perturbation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized spheroid sprouting metrics for compound or genetic screening campaigns.
- Quantitative Output: Measures sprout length and cumulative sprouting as dose-responsive angiogenic readouts.
- Scalability: Compatible with 96-well plate formats for medium-throughput evaluation of angiogenic modulators.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models hemangioblastoma-associated neovascularization using VHL-deficient endothelial cells.
- Translational Continuity: Bridges in vitro angiogenesis findings to in vivo vascular tumor complexity.
- Risk-Adjusted Decision-Making: Informs go/no-go criteria by revealing whether angiogenesis is a driver or complementary mechanism.
Pipeline & Workflow Integration
The spheroid sprouting assay fits within the discovery continuum from target validation to preclinical assessment of angiogenic inhibitors in vascular tumors.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about gene-specific effects on endothelial sprouting and pathway activation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative angiogenic phenotypes for compound library or siRNA screening.
- Analytics: Provides morphometric data (sprout length, cumulative length) for statistical comparison across conditions.
- Translational Research: Connects in vitro angiogenic potential to tumor vascularization patterns observed in hemangioblastoma models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating angiogenic activity across multiple tumor types and genetic backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in angiogenic pathway contribution to tumor vascularization.
- Operational Value: Delivers standardized, quantitative imaging-based readouts suitable for multi-site reproducibility.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by identifying non-driver angiogenic mechanisms early in discovery.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by highlighting complementary versus primary angiogenic roles in tumor models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in endothelial cell culture, lentiviral transduction, and 3D spheroid handling.
- Depends on access to inverted light microscopy and image analysis tools for sprout quantification.
- Necessitates standardized serum-reduced conditions and extracellular matrix handling for consistent sprouting.
- Involves optimization steps for spheroid formation and embedding in gel matrices.
- Limited to in vitro modeling; findings require validation in more complex vascular tumor models.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:46
Cell Culture and Plasmid Construct
3:00
Lentivirus Package and Infection
4:19
Generation of Modified Endothelial Cell Spheroids
5:04
In Vitro Angiogenesis Assay
6:26
Results: Use of Spheroid Sprouting Assay to Study Modified Endothelial Cell Vessel Formation
7:30
Conclusion
