Protocol van de isolatie van muis monocyt-afgeleide dendritische cellen en hun latere In Vitro activatie met Tumor immuuncomplexen
May 31st, 2018
Monocyt-afgeleide DC (MoDC) kleine hoeveelheden gevaar-geassocieerde moleculen kunnen voelen en zijn daarom gemakkelijk primer. Wij bieden een gedetailleerd protocol voor de isolatie van de MoDC uit bloed, tumoren en hun activering met immuuncomplexen terwijl het benadrukken van belangrijke voorzorgsmaatregelen die moeten worden overwogen om te voorkomen dat hun voortijdige activering.
Deze methode is ontworpen om wetenschappers te helpen monocyte-afgeleide DC's te isoleren uit het bloed en tumoren van tumordragende muizen om hun immunostimulerende eigenschappen te bestuderen. Ik denk dat het grootste voordeel van deze procedure vergeleken met andere methoden is dat de verkregen monocyte-afgeleide DC's hun activeringstoestand in de tumor en het bloed beter weerspiegelen. Het moeilijkste is waarschijnlijk om er zeker van te zijn dat al uw reagentia en gereedschappen steriel zijn en dat u geen besmetting zult introduceren tijdens deze procedure.
Ik heb al meer dan 15 jaar myeloide cellen en dendritische cellen uit tumoren geïsoleerd, en ik kreeg het idee van deze methode toen ik merkte dat verschillende isolatieprotocollen resulteerden in verschillende patronen van celactivatie. De procedure zal worden gedemonstreerd door mevrouw Santana-Magal, die een afgestudeerde student is in mijn lab.
Nadat de muizen zijn geëuthanaseerd met behulp van kooldioxide in een laminar flow hood, worden de tumoren verwijderd en in RPMI-medium zonder foetaal bovien serum geplaatst. Gebruik vervolgens chirurgische scharen om de tumor in kleine stukken te snijden. Breng alle stukken tumor van een enkele muis over in een 30 milliliter platte bodembuis bevattende HBSS-buffer aangevuld met collagenase IV en DNase I samen met de magnetische roerders.
Incubeer de buis met de tumor stukken op een schudder bij 37 graden Celsius met een magnetische roerder binnenin op 200 tot 400 omwentelingen per minuut gedurende 20 tot 30 minuten. Filter vervolgens de cellen door een 70-micrometer celzeven. Centrifugeer vervolgens de cellen bij 400 keer g gedurende vijf tot 10 minuten bij vier graden Celsius.
Na centrifugatie, voeg 1,5 milliliter dichtheidsgradiëntmedium stamoplossing toe aan 8,5 milliliter HBSS. Roer vervolgens krachtig door het dichtheidsgradiëntmedium. Pipetteer vervolgens het mengsel naar de pellet.
Centrifugeer de celsuspensie bij 400 keer g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Giet het supernatant af na afloop van de centrifugatie. Na het twee keer wassen van de gepeletteerde cellen, suspendeer in één milliliter isolatiebuffer.
Voeg de celsuspensie toe aan 30 microliter CD11b-geconjugeerde magnetische kralen. Incubeer vervolgens het mengsel bij vier graden Celsius gedurende 15 minuten. Na centrifugatie, verwijder het supernatant en suspendeer de pellet in één milliliter isolatiebuffer.
Breng de celsuspensie aan op een voorgewassen magnetische kolom. Gebruik vervolgens drie milliliter isolatiebuffer om de kolom twee keer te wassen. Verwijder vervolgens de kolom van de magneet.
Voeg vervolgens zes milliliter isolatiebuffer toe aan de kolom. Duw met een plunjer om de magnetisch gelabelde cellen in een steriele verzamelbuis te spoelen. Centrifugeer de cellen opnieuw bij 400 keer g gedurende vijf tot 10 minuten bij vier graden Celsius.
Na het resuspenderen en kleuren van de cellen, sorteer de cellen door de kleine cellen te kiezen, met kleine zij- en kleine voorwaartse verstrooiing. Na het euthanaseren van de muis, spuit 70% ethanol erop. Gebruik vervolgens chirurgische scharen om de huid boven het hart te verwijderen onder de laminar flow hood.
Reinig vervolgens de scharen met ethanol. Was de holte met 20-millimolair EDTA HBSS en gebruik de scharen om het rechter atrium van het hart te snijden. Gebruik vervolgens een 10-milliliter spuit met een 25-gauge naald om langzaam het rechter ventrikel van het hart te spoelen met 20-millimolair EDTA HBSS.
Gebruik vervolgens een steriele spuit om bloed uit de pleuraholte te trekken. Breng het bloed over in een buis met heparansulfaat en EDTA. Pipetteer vervolgens het bloed op het dichtheidsgradiëntmedium.
Centrifugeer de bloedcellen bij 400 keer g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur met lage rem. Na centrifugatie, verzamel de mononucleaire cellen in een buis. Suspendeer de cellen in 10 milliliter isolatiebuffer om de cellen te wassen.
Centrifugeer opnieuw de cellen bij 400 keer g gedurende vijf tot 10 minuten bij vier graden Celsius. Om de CD11b-cellen te selecteren, suspendeer de celpellet in één milliliter isolatiebuffer. Incubeer gedurende 15 minuten met 50 microliter CD11b-geconjugeerde magnetische kralen bij vier graden Celsius.
Centrifugeer opnieuw bij 400 keer g gedurende vijf tot 10 minuten bij vier graden Celsius. Verwijder vervolgens het supernatant. Suspendeer de pellet in één milliliter isolatiebuffer.
Breng vervolgens de celsuspensie aan op een voorgewassen magnetische kolom. Was de kolom twee keer met isolatiebuffer. Verwijder de kolom van de magneet en voeg zes milliliter isolatiebuffer toe aan de kolom.
Spuit vervolgens de magnetisch gelabelde cellen uit in een steriele verzamelbuis door de plunjer te duwen. Centrifugeer de cellen bij 400 keer g gedurende vijf tot 10 minuten bij vier graden Celsius. Suspendeer de cellen in isolatiebuffer en kleur met fluorofoor-geconjugeerde antilichamen.
Sorteer de cellen door de kleine cellen te kiezen met kleine zij- en kleine voorwaartse verstrooiing. Bevestig eerst de cellen in 1,8% gebufferd paraformaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Zaai de celsuspensie in elke put van een U-vormige 96-putten plaat.
Voeg vervolgens variërende verdunningen van tumorbindende antilichamen toe aan elke put. Incubeer vervolgens de cellen gedurende 15 tot 20 minuten op ijs. Na incubatie, was de cellen met 150 microliter fosfaat gebufferd zout oplossing.
Centrifugeer vervolgens bij 400 keer g gedurende vijf tot 10 minuten bij vier graden Celsius. Na centrifugatie, verwijder het supernatant en was de cellen twee keer. Suspendeer de cellen in 100 microliter FACS-buffer bevattende fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen.
Incubeer vervolgens de plaat gedurende 15 tot 20 minuten op ijs. Voeg na 15 tot 20 minuten 200 microliter FACS-buffer toe om de cellen te wassen. Centrifugeer de plaat bij
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het isoleren van monocyte-afgeleide dendritische cellen (MoDC) uit het bloed en tumoren van tumordragende muizen. Het protocol benadrukt het belang van het handhaven van steriliteit om besmetting te voorkomen en nauwkeurige resultaten te garanderen met betrekking tot de activeringstoestand van de cellen.
Belangrijkste onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Celbiologie
- Oncologie
Achtergrond
- Monocyte-afgeleide DC's zijn cruciaal voor de immuunrespons.
- Isolatiemethoden kunnen de activeringstoestand van deze cellen beïnvloeden.
- Het handhaven van steriliteit is cruciaal tijdens het isolatieproces.
- Verschillende protocollen leveren verschillende resultaten op in celactiveringspatronen.
Doel van het onderzoek
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor het isoleren van MoDC.
- Om voorzorgsmaatregelen te benadrukken om voortijdige activering te voorkomen.
- Om het begrip van de immunostimulerende eigenschappen van MoDC te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Isolatie van MoDC uit bloed en tumoren.
- Activering van MoDC met immuuncomplexen.
- Gebruik van steriele reagentia en gereedschappen.
- Demonstratie van de procedure door een afstudeerstudent.
Belangrijkste resultaten
- De isolatiemethode weerspiegelt nauwkeurig de activeringstoestand van MoDC.
- Belangrijke voorzorgsmaatregelen zijn geïdentificeerd om besmetting te voorkomen.
- MoDC's tonen duidelijke immunostimulerende eigenschappen op basis van hun bron.
- De effectiviteit van het protocol wordt gevalideerd door praktische demonstratie.
Conclusies
- De beschreven methode verbetert de studie van MoDC's in de immunologie.
- Het handhaven van steriliteit is essentieel voor betrouwbare resultaten.
- Toekomstig onderzoek kan voortbouwen op dit protocol om MoDC-functies te onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Accurate isolation of monocyte-derived dendritic cells (MoDC) from blood and tumors is critical for studying their activation state in preclinical tumor models. This protocol minimizes premature activation and contamination, enabling reliable assessment of immunostimulatory properties and immune complex interactions. Such precision supports target validation and mechanistic de-risking in immunotherapy discovery by providing disease-relevant systems that reflect in vivo conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of MoDC activation pathways by tumor immune complexes to clarify functional target relevance.
- Operational Value: Provides a reproducible method to isolate MoDC from multiple sources, reducing variability in early-stage hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates validated MoDC populations for quantitative analysis of immune complex binding and activation markers.
- Operational Value: Standardizes cell preparation for downstream flow cytometry and imaging assays, improving screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant modeling by isolating MoDC from tumors and blood of tumor-bearing mice, aligning with translational biomarker studies.
- Operational Value: Facilitates cross-functional comparison of activation patterns across tissue sources, aiding preclinical risk assessment.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by supplying biologically relevant MoDC for early target validation, progressing to assay development for immune complex screening, and informing preclinical evaluation of dendritic cell-based immunotherapies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of MoDC activation mechanisms and pathway clarification through controlled immune complex exposure.
- Screening: Delivers standardized, quantitative readouts such as mean fluorescence intensity and marker expression (CD86, MHC II) for compound or complex evaluation.
- Analytics: Enables statistical comparison of activation states across bone marrow, spleen, tumor, and blood-derived MoDC under defined conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by using tumor-derived MoDC to model antigen uptake and presentation in vivo.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation and activation platform applicable across immunotherapy projects requiring dendritic cell functional validation.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reflecting true MoDC activation states, reducing mechanistic ambiguity in immunotherapy target validation.
- Operational Value: Ensures reproducibility through sterile, standardized isolation and activation workflows, minimizing experimental noise.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable data on MoDC immunostimulatory properties, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of dendritic cell-targeted candidates based on validated functional outputs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile cell isolation, magnetic bead separation, and flow cytometry.
- Dependent on access to centrifuges, magnetic columns, cell strainers, and sterile tissue culture facilities.
- Necessitates standardization across teams for reagent handling, antibody staining, and immune complex preparation.
- Must account for variability in tumor model systems and mouse strains when interpreting activation outcomes.
- Limited by the need for fresh tissue processing and sensitivity to contamination during isolation steps.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:11
Isolation of Tumor Associated Monocyte-derived DC
4:07
Isolation of Monocyte-derived DC from Peripheral Blood
6:54
Preparation of Tumor-IgG Immune Complexes Followed by Activation of MoDC with Tumor-IgG
8:58
Results: Isolation and Analysis of the Activation of MoDC with the Tumor Immune Complex
11:02
Conclusion
