Twee-foton Intravital Imaging van leukocyten tijdens de immuunrespons bij Lipopolysaccharide-behandelde muis lever

Het algemene doel van deze procedure is om de morfologie en functionaliteit van leukocyten in de lever tijdens septische shock te observeren. Het grote voordeel van deze techniek is dat je directe video's van leukocyten in de lever kunt verkrijgen. Gebruik voorafgaand aan de operatie 70% ethanol om de operatietafel en alle instrumenten te desinfecteren.

Stel vervolgens de gereedschappen voor leverchirurgie op en pas de verwarmingsplaat aan op 37 graden Celsius. Na het verdoven van LPS of PBS geïnjecteerde muizen volgens het tekstprotocol, breng een kleine hoeveelheid oogzalf aan om uitdroging van het netvlies te voorkomen. Gebruik een scheermes en ontharingscreme om het haar rond de buik te verwijderen.

Gebruik vervolgens vochtige gaas om de buik te reinigen. Terwijl je een retro-orbitale injectie uitvoert met een insulinesyringe, injecteer je 200 microliters van een Texas red dextran oplossing. Gebruik een stift om het rechter subcostale gebied vanaf het xiphoïde proces tot het einde van de rib te markeren.

Breng vervolgens povidonjodium aan op de buik van de muis om secundaire infectie te voorkomen. Gebruik pincetten en schaar om de epidermis te snijden. Gebruik vervolgens microschaartjes en pincetten om de buikholte te openen en de lever voorzichtig bloot te leggen.

Gebruik wattenstaafjes om de linker laterale lob uit te rollen. Giet vervolgens 500 microliters steriele PBS in de buikholte om uitdroging van de lever te voorkomen. Plaats de muis in de rechter decubituspositie in een speciaal ontworpen kamer en breng een kleine hoeveelheid weefselkleefstof aan op het siliconenbed.

Gebruik vervolgens wattenstaafjes om de lever voorzichtig te bevestigen. Leverweefsel is uiterst bros. Gebruik nooit scherpe of zware gereedschappen bij het blootleggen en vasthouden van de lever.

Een paar seconden later, bevochtig de lever opnieuw met 500 microliters steriele PBS om uitdroging te voorkomen. Plaats vervolgens de metalen frame op de lever en gebruik moeren om deze stevig te bevestigen. Plaats altijd ondersteunende moeren voordat je het metalen frame plaatst.

Dit helpt de druk van het metalen frame te verminderen. Om intravitale beeldvorming van de lever uit te voeren, start de Zen-software om de laser aan te zetten. Stel de golflengte in op 880 nanometer en stel de groene en rode kanalen in.

Pas vervolgens de laservermogen aan volgens de fluorescentie-intensiteit. Plaats de kamer op de beeldvormingsfase en plaats de 20-krachtige water-immersie objectieflens dicht bij het dekglas. Bevestig de siliconenrubber verwarmer onder het lichaam van de muis om de lichaamstemperatuur te handhaven.

Trek vervolgens 500 microliters gedistilleerd water op in het metalen frame. Positioneer vervolgens het objectief dicht bij de lever. Pas de focus aan en bepaal de diepte en tijd van het beeldvormingsgebied.

Voor langetermijnbeeldvorming, injecteer elke uur gedurende de beeldvorming een halve dosis van het eerder bereide Zoletil en Rompun anesthesiemengsel omwille van ethische redenen. Houd de lichaamstemperatuur op 37 graden Celsius en houd altijd een oogje op de muis, aangezien anesthesietijden voor elke muis verschillen. Om de gegevens te analyseren, open Velocity en importeer de ruwe gegevens van de bibliotheek.

Verwijder vervolgens het geluid van het beeld en neem een momentopname. Pas ten slotte de bewerkte items aan op 100% en exporteer de bestanden als JPEG- of TIF-bestanden voor momentopnamen en AVI-bestanden voor films. Intravitale beeldvormingsanalyse van controlemuisjes toonde aan dat een klein aantal neutrofielen in de bloedvaten circuleerde.

Terwijl het aantal neutrofielen aanzienlijk toenam bij LPS-behandelde muizen. In LPS-conditie circuleerden veel neutrofielen in de bloedbaan, maar ze migreerden niet buiten het vat. Zoals te zien is in deze films, waren neutrofielen in de LPS-behandelde muizen sterker vastgehecht aan het luminale oppervlak van het vat, waardoor neutrofielen vaker in het vat werden gedetecteerd.

Naast de beweeglijkheid van neutrofielen, werden levercapsulaire macrofagen, of LCM's, in CX3CR1-GFP-muizen waargenomen op het oppervlak van het leverweefsel in plaats van diep in het weefsel. Bovendien vertoonden LCM's weinig beweging of activering in de lever, zelfs bij LPS-behandelde muizen. Eenmaal onder de knie kan deze techniek in 30 minuten worden uitgevoerd als het goed wordt uitgevoerd.

Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de incisielijn in te stellen van het xiphoïde proces tot het einde van de rechter subcostale buik. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals behandelingsinjectie worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals hoe de lever herstelt van schade en infectie. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van geneeskunde om de reactie van leukocyten tijdens sepsis te onderzoeken en potentiële medicijnen te testen.

Na het bekijken van deze video zou je een goed begrip moeten hebben van hoe je een lever met minimale buiksnede kunt blootleggen. Vergeet niet dat werken met lipopolysaccharide uiterst gevaarlijk kan zijn en dat voorzorgsmaatregelen zoals sterilisatie en handen wassen altijd moeten worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.