Een snel zilver kleuring Protocol inschakelen eenvoudig en efficiënte detectie van SSR markeringen met behulp van een niet-denaturering Polyacrylamide-Gel

Het algemene doel van dit protocol is om een geoptimaliseerde zilverkleuringsmethode te introduceren voor snelle, eenvoudige en goedkope detectie van SSR-markers in niet-denaturerende polyacrylamidegels. De snelle genotypering van SSR-markers kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van genetisch onderzoek en toepassing, zoals analyse van genetische diversiteit en marker-ondersteunde selectie in moleculaire veredelingsprogramma's. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het eenvoudig uit te voeren is, minder tijd kost en minder chemische reagentia gebruikt dan andere protocollen voor de detectie van SSR-markers.

Deze methode vermijdt de fixatie, stopzetting en verschillende wasstappen die in conventionele protocollen worden aangetroffen. En vereist slechts de twee hoofdstappen van impregnatie en ontwikkeling. Duidelijke afbeeldingen kunnen worden geproduceerd met behulp van dit protocol, aangezien er geen achtergrondruis is voor de ondubbelzinnige detectie van SSR-bandingpatronen.

Met deze techniek kunnen ongeveer 800 DNA-monsters per dag worden gescreend en deze is met succes gebruikt in tabak- en bloeiende Chinese kool onderzoek. Na het voorbereiden van PCR-producten en geloplossingen volgens het tekstprotocol, gebruikt u wasmiddel in kraanwater om een set glazen platen en afstandhouders te wassen, gevolgd door een volledige spoeling met gedestilleerd water. Plaats de platen in een droogrek voor platen om aan de lucht te drogen.

Verspreid een milliliter Bind-silaanoplossing op het binnenoppervlak van een rechthoekige glazen plaat en droog het vijf minuten. Verspreid vervolgens een milliliter Repel-silaan op het binnenoppervlak van een uitgesneden glazen plaat met een doek en gebruik een tissue om overtollig oplossing af te vegen voordat de plaat vijf minuten aan de lucht kan drogen. Monteer de glazen platen met afstandhouders met de uitgesneden plaat bovenop.

En gebruik gietafklemmen om beide zijden van de constructie vast te klemmen. Giet vervolgens een geschikte hoeveelheid 6% niet-denaturerend polyacrylamidegeel in een beker voor de plaatset. Voeg 20 microliter TEMED en 200 microliter vers 20%APS toe en meng voorzichtig.

Giet de oplossing onmiddellijk en voorzichtig in de gemonteerde glazen platen langs de rand van de uitgesneden plaat, waarbij de ruimte bijna tot aan de bovenkant wordt gevuld. En plaats de kam. Voeg vervolgens een kleine hoeveelheid geloplossing toe boven de kam en laat het gel bij kamertemperatuur 30 minuten drogen.

Wanneer het gel volledig is gepolymeriseerd, verwijdert u de gietafklemmen en plaatst u de plaatset in de elektroforesetankeenheid met de uitgesneden plaat naar de bovenste bufferreservoir. Gebruik grote klemmen om de plaatset aan de tankeenheid te bevestigen. Giet een liter 0,5 X TBE-buffer in elk van de bovenste en onderste kamers.

Verwijder vervolgens de kam en gebruik een pipet of spuit gevuld met buffer om alle putjes grondig door te spoelen. Om de polyacrylamidegel te draaien, laadt u ongeveer een microliter PCR-product in elke put. Laad ook een DNA-ladder aan beide uiteinden.

Bevestig vervolgens de veiligheidsafdekking op de bovenste bufferkamer. Sluit de kabels aan op de voeding, waarbij de kleur gecodeerde rood op rood en zwart op zwart wordt gekoppeld. Laat de gel draaien bij een constante spanning van 110 volt totdat de kleurstof een gedefinieerde positie bereikt.

Normaal gesproken gedurende ongeveer 70 minuten. Na elektroforese opent u de klep en laat u de buffer uit de bovenste kamer in een grote beker lopen. Ontkoppel de zijklemmen en verwijder de plaat uit het apparaat.

Gebruik vervolgens een spatel om voorzichtig de uitgesneden glazen plaat langs een zijde te scheiden en zorg ervoor dat het gel aan de andere glazen plaat blijft plakken die is gecoat met Bind-silaan. Bereid vervolgens een liter verse impregneringsoplossing voor door 1,5 gram zilvernitraat op te lossen in een liter gedistilleerd water. Bereid vervolgens een liter verse ontwikkelingsoplossing voor door 10 gram natriumhydroxide op te lossen in 900 milliliter gedistilleerd water.

Voeg een milliliter 37% formaldehyde toe en gebruik gedistilleerd water om tot een eindvolume van een liter aan te passen. Met voldoende gedistilleerd water, spoel de gel en glazen plaat voorzichtig om de elektroforesebuffer te verwijderen. Plaats vervolgens de plaat met de gel naar boven in een plastic lade en dompel de gel onder in een liter impregneringsoplossing.

Schud de lade voorzichtig op een schudder bij 60 RPM gedurende drie tot vier minuten. Breng de plaat over van de impregneringsoplossing in een andere lade. Gebruik vervolgens voldoende gedistilleerd water om de resterende impregneringsoplossing twee keer gedurende drie tot vijf seconden van het oppervlak van de plaat en de gel af te spoelen.

De gelwasstap na impregnatie is cruciaal. Onvoldoende wassen kan onvolledige verwijdering van impregnatieoplossing veroorzaken. En resulteert in een donkere achtergrond.

Plaats de plaats met de gel naar boven in een andere lade. Dompel de plaat in een liter ontwikkelingsoplossing en schud de lade voorzichtig bij 50 RPM gedurende ongeveer drie minuten. Bewaak het verschijnen van DNA-fragmenten en stop de ontwikkeling wanneer de hoogste verhouding van het signaal van DNA-fragmenten tot het geluid van de achtergrond wordt waargenomen.

De juiste ontwikkelingstijd is een andere belangrijke stap. Overontwikkeling kan resulteren in een donkerbruine achtergrond met een laag contrastbeeld van DNA-fragmenten. Spoel de plaat en de gel twee keer met voldoende gedistilleerd water en gebruik tissuepapier om de gelplaat te drogen.

Gebruik vervolgens een scanner en de juiste software om de gel te scannen bij 300 DPI en pas de helderheid en het contrast aan om een duidelijke visualisatie van de DNA-banden te krijgen. Score ten slotte het bandingpatroon van de SSR-markers op basis van de DNA-fragmentgrootten in de afbeelding. De PCR-amplicons die hier worden gepresenteerd, zijn geproduceerd met behulp van de bijbehorende SSR-primerparen in bloeiende Chinese kool en tabak.

Na elektroforese werden de polyacrylamidegels gekleurd met behulp van het zilverkleuringsprotocol dat in deze video wordt gedemonstreerd. Die ondub