Met behulp van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide Hepatocyte-achtige cellen voor drugontdekking

Het algemene doel van dit experiment is om humane geïnduceerde pluripotente stamcellen te differentiëren in hepatocyte-achtige cellen op een manier die geschikt is voor high-throughput screening. Levercellen zijn moeilijk te kweken in het laboratorium, maar ze kunnen worden gegenereerd uit geïnduceerde pluripotente stamcellen, wat een screeningplatform biedt om behandelingen voor leverziekte te identificeren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat er onbeperkte aantallen hepatocyten kunnen worden gegenereerd van elke patiënt met leverziekte die de ziekte in het laboratorium nabootst.

De procedure is relatief eenvoudig te vestigen, zelfs zonder uitgebreide kennis van stamcelbiologie. De reproduceerbaarheid ervan stelt onderzoekers in staat om duizenden verbindingen te screenen zonder de noodzaak van complexe robotica. Ray Liu, een postdoctoraal fellow, en Paige Lamprecht, een afgestudeerde student, zullen de procedure vandaag demonstreren.

Eerst verdunt u het fusie-eiwit Ecad tot 15 microgram per milliliter met Dulbecco's fosfaatgebufferd zoutwater, of DPBS, dat calcium en magnesium bevat. Bekleed 100 millimeter suspensie weefselkweekschotels met vijf milliliter verdund matrix en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende ten minste een uur. Na incubatie, verwijder de substraat en vervang met vijf milliliter iPSC kweekmedium.

Haal een flesje van cryobewaarde humane geïnduceerde pluripotente stamcellen uit vloeibare stikstof. Ontdooi bij 37 graden Celsius tot er een kleine ijskristall blijft. Pipetteer vervolgens voorzichtig de cellen in een steriele 15 milliliter conische buis met vier milliliter van het kweekmedium.

Centrifugeer de cellen bij 300 G gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant en re-suspendeer de cellen voorzichtig met vijf milliliter medium aangevuld met tien micromolar van Y-27632, een selectieve remmer van een Rho-geassocieerde, gespiraliseerde, kettingvormige eiwitkinase. Verwijder nu het kweekmedium van de Ecad-gecoate tien millimeter suspensie weefselkweekschotels en voeg vijf milliliter van de cellen toe.

Zodra de iPSC's ongeveer 80% confluentie bereiken, verwijdert u het kweekmedium en was eenmaal met calcium- en magnesiumvrij DPBS. Aaspibeer de DPBS en voeg een voldoende hoeveelheid 0,02% EDTA-oplossing toe om de schotels te bedekken. Bewerk vervolgens de cellen gedurende maximaal drie minuten bij kamertemperatuur.

Zodra de cellen beginnen los te laten, verwijdert u de 0,02% EDTA-oplossing en spoelt u de schaal met tien milliliter M-medium om de cellen los te laten. Help de loslating van iPSC's door voorzichtig te pipetteren. Breng 1/10e van de gesuspendeerde cellen per verse Ecad-gecoate weefselkweekschotel met vijf milliliter M-medium over.

Bewerk de culturen bij 37 graden Celsius onder 4% zuurstof en 5% koolstofdioxide, ververs het medium dagelijks. Haal een flesje van 250 microliter ijskoud matrixvoorraad met een concentratie van twee milligram per milliliter en ontdooi het op ijs. Combineer vervolgens de ontdooide matrix met tien milliliter koude DMEM/F12 door voorzichtig te mengen met een voorgekoelde pipette om een ​​eindconcentratie van 0,05 milligram per milliliter te maken.

Breng 100 microliter van de verdunde matrix over naar elke put van een 96-puts weefselkweekplaat. Bewerk de plaat bij 37 graden Celsius onder 4% zuurstof en 5% koolstofdioxide gedurende ten minste een uur. Na incubatie, gooi de matrix weg en vervang door 50 microliter M-medium per put, herhaal dezelfde coatingprocedure met de rest van de platen.

Kweek nu de iPSC's op 100 millimeter schotels tot de cellen 80% confluentie naderen. Om de iPSC's uit elke 100 millimeter plaat te oogsten, aspireer het kweekmedium en spoel met vijf milliliter DPBS. Vervang het spoelen met drie milliliter celdetacheringsoplossing, zoals Accutase.

Bewerk vervolgens ongeveer twee minuten bij 37 graden Celsius onder 4% zuurstof en 5% koolstofdioxide. Zodra de cellen beginnen los te laten, oogst door zeven milliliter M-medium toe te voegen. Pipetteer meerdere keren om de celkolonies te dissociëren in kleine clusters van ongeveer drie tot zes cellen.

Verzamel vervolgens de iPSC's in een 15 milliliter steriele centrifugeerbuis en centrifugeer bij 300 G gedurende vijf minuten. Verwijder na voltooiing het supernatant en re-suspendeer het cellenpellet in vijf milliliter M-medium. Verdeel de cellen gelijkmatig over 96-puts matrix-gecoate platen door 50 microliter suspensiecellen in elke put te pipetten met behulp van een multikanaals pipette.

Kweek vervolgens de cellen een nacht bij 37 graden Celsius onder 4% zuurstof en 5% koolstofdioxide en herhaal de celzaaiprocedures met de rest van de platen. Onderzoek de 96-puts platen onder een microscoop om ervoor te zorgen dat de cellen ten minste 70% van het oppervlak van elke individuele put bedekken. Voor dag één tot dag twee van differentiatie, vervang het kweekmedium met 100 microliter RPMI-gebaseerd differentiatiemedium per put.

Bewerk vervolgens de cellen bij 37 graden Celsius in omgevingszuurstof en 5% koolstofdioxide gedurende twee dagen met dagelijkse mediumverversing. Voor dag drie tot dag vijf van differentiatie, vervang het kweekmedium met 100 microliter RPMI-gebaseerd differentiatiemedium aangevuld met 2% B27 en 100 nanogram per milliliter actief NA. Bewerk de cellen bij 37 graden Celsius in omgevingszuurstof en 5% koolstofdioxide gedurende drie dagen met dagelijkse mediumverversing. Op differentiatiedag vijf, behandel elke put met 100 microliter 0,02% EDTA-oplossing gedurende 30 seconden en verwijder de oplossing onmiddellijk.

Voeg 100 microliter vers RPMI-gebaseerd differentiatiemedium toe en herhaal dezelfde procedure voor de rest van de platen. Voor differentiatie tussen dag zes en tien, vervang het kweekmedium met 100 microliter RPMI-gebaseerd differentiatiemedium. Bewerk de cellen bij 37 graden Celsius onder 4% zuurstof en 5% koolstofdioxide gedurende vijf dagen met dagelijkse