Verzameling en verwerking van lymfklieren uit grote dieren RNA p.a.: lymfeklier Transcriptomic Studies van grote diersoorten voorbereiden

Hallo, mijn naam is Dr. Robert Schaut en ik ben wetenschapper bij het National Animal Disease Center in Ames, Iowa. In deze JoVE-video zullen we informatie delen over het verzamelen en verwerken van lymfeklieren van grote dieren voor gebruik in downstream RNA-experimenten. Bijvoorbeeld, deze experimenten kunnen kwantitatieve PCR op omgekeerd getranscribeerd producten omvatten, of RNA-sequencing-studies van transcriptomen.

Lymfeklieren zijn nuttige monsters voor de beoordeling van immuunreacties van de gastheer, maar kunnen ook een bron van pathogeen RNA voor onderzoek zijn, zoals in het geval van intracellulaire pathogenen die aanwezig zijn in immuuncellen in lymfeklieren. Steekproeven van grote dieren, inclusief zowel vee als wilde diersoorten, zijn van belang in de studie van zoönoses. Hier, bij het National Animal Disease Center, bestuderen we infecties van vee met soorten zoals brucella abortus, die brucellose veroorzaakt bij runderen en bizons, en E.Coli O157:H7 zoals afgescheiden uit de darmkanalen van runderen.

We zullen ook weefselmonsters herstellen van wilde diersoorten, zoals herten en elanden. Een reeks lymfeklieren kan worden verzameld van dieren die met verschillende ziekten zijn geïnfecteerd. Studies van weefsels in deze natuurlijke gastheersoorten zijn over het algemeen relevanter voor de natuurlijke progressie van ziekten dan muismodellen.

Desondanks is het proces van weefselverzameling van grote soorten noodzakelijkerwijs gecompliceerder dan dat van muizen, inclusief de langere vertraging tussen euthanasie en weefselverzameling, en een grotere grootte van lymfeklieren. Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van lymfeklieren van grote dieren voor RNA-studie dat informatief zal zijn voor moleculaire biologen betrokken bij de transcriptomische studies van infecties bij grote dieren, evenals veterinaire onderzoekers die beginnen met transcriptomische studies. In deze video zullen we procedures demonstreren op lymfeklieren voor runderen.

Voor de necropsie raden we aan de volgende benodigdheden te verzamelen die specifiek zijn voor de weefselisolatieprocedure. Microfugebuizen gevuld met ongeveer 1 ml RNA-weefselconserveerdmiddel, zoals RNAlater, wegwerpbare scalpels, schone en geautoclaveerde pincetten, biopsienalden, een container voor gebruikte scalpels en naalden, en ofwel een snijplank of een wegwerpbakje, afhankelijk van de mate van besmettelijkheid van de betrokken materialen. In dit geval zullen we de belangrijkste elementen van de procedure demonstreren door gebruik te maken van lymfeklieren die we over het algemeen van runderen verzamelen.

Ze zijn geïnfecteerd met bacteriën die brucellose veroorzaken. Dit zijn de prescapulaire lymfeklieren en de parotislymfklier. Bij het uitvoeren van een necropsie van een groot dier voor RNA-herstel is het nuttig om ten minste drie deelnemers te hebben die aan weefsels van het dier werken. Dissectoor een zal verantwoordelijk zijn voor het sectioen van grote dieren in verschillende delen van het dier, dissectoor twee zal lymfeklieren herstellen van verschillende delen van het dier aan de hoofdnecropsietafel, en dissectoor drie zal aan een aparte tafel werken om secties uit elke lymfklier te isoleren en deze over te brengen naar buisjes met conserveeroplossing. We zullen beginnen met de identificatie en verwijdering van de prescapulaire lymfklier. Ideaal gesproken zal palpatie van een lymfklier, vóór de dissectie, helpen bij het identificeren van de locatie van de lymfklier.

Hoewel het niet altijd mogelijk is om te detecteren, is de prescapulaire lymfklier meestal voelbaar bij een gezond dier. Begin door het dier in laterale liggende positie te plaatsen. Strek de schouder uit door het voorbeen terug te bewegen op het niveau van de knie.

Deze beweging zal de schouder naar achteren brengen en gemakkelijke palpatie van de lymfklier mogelijk maken. Voel naar de aanwezigheid van de lymfklier zoals getoond. Eenmaal gelokaliseerd, en met de schouder nog steeds uitgestrekt, gebruik een scalpel of necropsiemes om een huidincisie te maken langs de omtrek van de schouder.

Trek de huid terug om het punt van de schouder en nekmusculatuur te onthullen. Een sectie van onderhuids vet wordt soms waargenomen, vooral bij overgeconditioneerde dieren. De prescapulaire lymfklier wordt vaak gevonden met secties van onderhuids vet.

Hier ziet u de drie lagen van de huid, spier en onderhuids vet. Nogmaals, palpeer de locatie van een lymfklier. In tegenstelling tot het onderhuids vet, zal de lymfklier zijn vorm behouden wanneer gepalpeerd.

Na het lokaliseren van de prescapulaire lymfklier, verwijder voorzichtig het onderhuids vet en verwijder de lymfklier. Het uiterlijk van deze lymfeklieren bij bizons, die we gebruikten in brucellosestudies vanwege de gevoeligheid van bizons in het Greater Yellowstone-gebied voor brucella, is vergelijkbaar. Hier demonstreren we het uiterlijk van de prescapulaire lymfklier, zoals verwijderd uit de rechterschouder van een Amerikaanse bizon.

Vervolgens gaan we over tot de isolatie van de parotislymfklier. Met het dier in laterale liggende positie, lokaliseer het temporomandibulair gewricht. Gebruik een scalpel of necropsiemes om voorzichtig een incisie in de huid te maken.

Begin dorsaaal van het gewricht en strekt u verticaal uit langs de kaaklijn. Disseceer de huid weg om het onderhuidse weefsel te onthullen. De parotisspeekselklier zal zichtbaar zijn, eerst vanwege zijn grote omvang, gelobde oppervlakte-uiterlijk en rode kleuring.

Gebruik pincetten en scalpel om de parotisspeekselklier opzij te schuiven om de parotislymfklier te vinden die zich net craniaal en mediaal van de speekselklier bevindt. Bij het isoleren van de parotislymfklier is het van cruciaal belang om lymfklierweefsel te scheiden van het weefsel van de parotisspeekselklier. De weefseltypen zien er verschillend uit, inclusief binnenin de weefseldoorsnede.

Dit kan hier worden waargenomen, met de parotislymfklier aan de linkerkant en de parotisspeekselklier aan de rechterkant. Zorg ervoor dat u het weefsel van de parotislymfklier zorgvuldig onderzoekt op textuur voor